一种pH响应性蛋白质-高分子结合体及其制备和组装方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种刺激响应性蛋白质-高分子结合体及其制备和组装方法，属于药 物载体材料制备技术领域。
【背景技术】
[0002] 通过精屯、设计的纳米药物载体可将药物包埋或溶解在纳米粒内部，也可吸附或偶 合在其表面。利用祀向制剂对纳米载体进行修饰，将祀向配体连接到纳米粒子表面，通过配 体对细胞膜上受体的特异性识别，修饰后的载药纳米粒子可W祀向到癌细胞，进而进入细 胞释放药物实现药物的祀向输送，同时具有缓释、保护药物、提高疗效、降低毒副作用等优 点。
[0003] 纳米粒子进入细胞后，只有将携带的治疗剂释放出来才能让治疗剂发挥作用，实 现对肿瘤细胞的杀伤。理想的纳米载体应可实现对治疗剂的可控释放。随着材料科学的发 展，越来越多的刺激响应性材料被用于纳米载体的制备。该些材料包括；抑敏感材料、温度 敏感材料、光敏感材料W及氧化还原敏感材料等。利用细胞内本身的特性如内涵体的pH值 偏酸（抑在5. 0-6. 5之间），使进入细胞内的纳米粒子在该些刺激下发生崩解，从而释放出 治疗剂，达到可控释放。如聚甲基丙締酸二异丙基氨基己醋（PDPA)具有优越的抑响应性， 在人体正常生理环境抑值7. 2~7. 6时因其等电点特性作为疏水端，在人体某些病变部位 pH值下降或进入细胞内涵体抑值较低时发生强烈质子化，改变其疏水性能，控释负载的治 疗性药物，是一种很好的医用高分子材料，广泛的用于抑响应性的药物载体及缓释剂。
[0004] 到目前为止，在纳米载体的设计方面已取得了显著的进展，有效地提高了治疗剂 的治疗效果，但大部分尚处于实验阶段，很少转化为临床和投入市场，仍需要科学家们进一 步努力。同时，由于制备技术等方面的原因，纳米载体的大小与形貌的可控性方面也是限制 其发展的一个重要原因。除此之外，用于制备纳米载体的材料的生物安全性和生物相容性 也是纳米载体设计中需要考虑的的一个重要方面。
[0005] 为了提高材料的生物安全性和生物相容性，将蛋白质作为亲水端，刺激响应性疏 水高分子作为疏水端构成巨型双亲性蛋白质-高分子结合体，集蛋白质和连接的高分子的 性能和优势于一体，同时还显示出一些新的性能。蛋白质具有安全无毒、无免疫原性、可生 物降解、生物相容性好等优点，蛋白质的存在赋予结合体优异的生物相容性和生物功能，而 高分子链的引入可W增加蛋白质的稳定性，同时可W赋予结合体双亲性能和高分子链本身 的性能，如引入温度敏感的高分子链可赋予结合体温度敏感性。由于蛋白质对药物具有很 高结合性，蛋白质高分子纳米粒可W高效率的负载药物。利用蛋白质高分子纳米粒表面的 功能基团如胺基和駿基可W用来偶联药物和祀向配体。目前应用最广泛的蛋白质有牛血清 白蛋白炬SA)和人血清白蛋白化SA)等。
[0006] 研究发现，该种的双亲性蛋白质-刺激响应性高分子结合体在水溶液中表现出与 传统的双亲性小分子和嵌段共聚物相似的组装性能，可W自组装形成多种形貌的组装体， 制备好的可生物相容性的纳米载体可有效的将治疗剂运输到癌症细胞内，减少抗癌药物对 正常器官和组织毒副作用，并实现治疗剂的可控释放，提高药物局部浓度，有效增强治疗剂 的治疗效果，实现对癌症的祀向治疗。
【发明内容】
[0007] 本发明中，首先设计合成一种牛血清白蛋白炬SA)大分子原子转移自由基聚合 (ATR巧引发剂，引发甲基丙締酸二异丙基氨基己醋值PA)单体的ATRP聚合，制备一种抑响 应性的牛血清白蛋白炬SA)-聚甲基丙締酸二异丙基氨基己醋（PDPA)双亲性结合体。BSA 作为亲水部分的存在赋予结合体优异的生物相容性，可控活性聚合引入的疏水端PDPA增 加BSA的稳定性，使得该蛋白质一高分子结合体具有双亲性和抑响应性，可进行自组装并 pH介导装载治疗药物，且在肿瘤微环境或细胞内涵体内pH值较低的环境下PDPA发生强烈 质子化，控释负载的药物，有效提高治疗效果，是一种的药物载体材料。本制备方法可W实 现PDPA的定点结合W及数目可控。
[000引本发明制备了一种抑响应性蛋白质-高分子双亲性结合体，选用牛血清白蛋白 炬SA)和聚甲基丙締酸二异丙基氨基己醋（PDPA)，利用BSA上的琉基（-SH)通过迈克尔加 成反应结合马来酷亚胺化的小分子引发剂，后引发PDPA聚合，形成抑响应性BSA-PDPA结 合体。并且该结合体可W组装形成BSA-PDPA球形纳米载体。
[0009] 本发明的技术方案如下；
[0010] 一种抑响应性蛋白质-高分子双亲性结合体，其特征是BSA-PDPA结构式如下；
[0011] CHj r ?2 11 因图A"f-C-- s i g c^=o 貧 CHz CHj n_ HC。。- W j /、州3 HjC HjC
[0012] 其中聚合度n大于等于5,即高分子链分子量大于1000 ;
[0013] 最佳聚合度范围为10~200,即高分子链分子量为2000~40000。
[0014] 本发明的抑响应性蛋白质-高分子双亲性结合体组装形成BSA-PDPA球形纳米载 体。
[001引本发明的抑响应性蛋白质-高分子结合体的制备方法，步骤如下：
[0016] 1)制备牛血清白蛋白大分子ATRP引发剂；
[0017] 将牛血清白蛋白炬SA)溶于PBS缓冲液形成BSA溶液，2-漠代-2-甲基丙酸 2-(2, 5-二氧杂-3-二氨化化咯-1-基）己醋（产品D)溶于N，N-二甲基甲酯胺中形成产 品D溶液，产品D溶液滴加至BSA溶液中，在氣气保护下室温反应24~36h，纯水透析24~ 4她后冻干得到蛋白质ATRP引发剂；
[0018] 2)ATRP引发剂引发抑响应性高分子聚甲基丙締酸二异丙基氨基己醋（PDPA)聚 合；
[0019] ①在Schlenk管中，将ATRP引发剂、单体DPA依次溶于溶剂中，引发剂和单体的摩 尔比例为1:10~200 ;
[0020] ②通过抽真空-充氮气各一次作为一个循环，对体系进行除氧，然后加入配体 N，N，N'，N，'N"-五甲基二亚己基S胺，再进行抽真空-充氮气一个循环，然后加入催化剂 化(I)Br，再进行抽真空-充氮气一个循环；
[002U⑨将Schlenk管置于恒温油浴中，将体系升温至50~70°C反应12~16h;后处理 得到白色固体产品即BSA-PDPA结合体。
[002引所述的牛血清白蛋白；2-漠代-2-甲基丙酸2-化5-二氧杂-3-二氨化化 咯-1-基）己醋的质量比优选为12~15:1。
[002引所述反应体系的溶剂为N，N-二甲基甲酯胺值M巧与异丙醇一种或两种的组合，单 体浓度优选为115~240g/L。
[0024] 所述的BSA溶于PBS缓冲液浓度优选为22~25g/L。
[0025] 所述的产品D溶于N，N-二甲基甲酯胺浓度优选为6. 5~9g/L。
[0026] 所述的引发剂与PM邸TA、化(I)化的摩尔比例优选为1:2:1。
[0027] 所述的后处理具体步骤为反应结束后，将反应体系迅速冷却至室温，通入空气，终 止聚合反应；用四氨快喃稀释产物，然后将体系加入到二氧化娃柱，用四氨快喃做洗脱剂进 行洗脱，得无色溶液；将收集的溶液在旋转蒸发仪上将溶剂蒸出绝大部分，然后体系转移到 透析袋中，先在四氨快喃中进行透析24~48小时，之后转移至水中透析液透析3~5天。 最后通过冻干得到白色固体产品。
[0028] 本发明的BSA-PDPA结合体球形纳米载体组装方法，取pH响应性BSA-PDPA结合体 溶解在去离子水中，将溶液置于冰浴中；在超声波发生器作用下，滴入机溶剂为，超声结束， 将得到的乳液在25~30°C下通过旋转蒸发仪进行旋蒸10~15分钟，除去有机相，得到抑 响应性BSA-PDPA结合体的组装体溶液。
[0029] 所述的BSA-PDPA溶于去离子水浓度优选为为1~5g/L。
[0030] 所述的有机溶剂：离子水体积比优选为为1:1~20。
[0031] 所述的有机溶剂机溶剂为二氯甲烧或=氯甲烧
[0032] 组成的抑响应性BSA-PDPA结合体的自组装纳米载体，制剂粒径在80至1] 140纳米 之间，在抑降低时，Zeta电位值由负电转