[0080] 除了所述表达元件以外，根据本发明的载体可以包含更多的元件。例如，所述载体 可以包含一个或多个选择标记物。优选地，所述选择标记物中的至少一个适于针对不包含 所述载体的宿主细胞选择包含该载体的宿主细胞、特别是真核宿主细胞、优选哺乳动物宿 主细胞、更优选人宿主细胞。所述选择标记物的合适的例子是提供针对抗生素化合物的抗 性的基因。此外，所述载体可以包含适于将其在原核宿主细胞（如大肠杆菌细胞）中扩增 的元件。例如，这样的元件包括复制起点（如ColElOri)和原核选择标记物（如提供针 对杀细菌剂（例如氨苄青霉素）的抗性的基因）。
[0081] 优选地，所述载体是环状或线性双链DNA，特别是环状双链DNA。
[0082] 在某些优选实施方案中，所述载体包含具有表达元件的表达盒，所述表达元件包 含编码所关注的肽的核酸序列。
[0083] 包含表达盒或载体的宿主细胞
[0084] 在又一个方面，本发明提供包含根据本发明的表达盒或根据本发明的载体的宿主 细胞。所述宿主细胞可以是适于用所述表达盒或载体转染并且特别是适于生产所述所关 注的肽的任何细胞。优选地，所述宿主细胞源自建立的表达细胞系。所述宿主细胞优选真 核细胞、更优选哺乳动物细胞、最优选人细胞。在优选的实施方案中，所述宿主细胞源自人 髓样白血病细胞。宿主细胞的具体例子为K562、NM-F9、NM-D4、NM-H9D8、NM-H9D8-E6、NM H9D8-E6Q12、GT-2X、GT-5s和源自任意一种所述宿主细胞的细胞。K562是存在于美国典型 培养物保藏中心中的人髓样白血病细胞（ATCCCCL-243)。剩余的细胞系源自K562细胞并 已经针对具体的糖基化特征进行过选择。源自K562的细胞系可以在适合K562的众所周知 的条件下进行培养和维持。除K562细胞外的所有这些细胞系均根据布达佩斯条约进行保 藏。可在本说明书的结尾处发现关于所述保藏的信息。
[0085] 例如，示例性的宿主细胞也被描述于W0 2008/028686中。在优选的实施方案中， 所述宿主细胞被优化用于表达具有特定糖基化模式的糖蛋白。优选地，所述表达元件中的 密码子使用和/或所述表达盒或载体的启动子和其它元件与所使用的宿主类型相容，更优 选地针对所使用的宿主类型进行优化。
[0086] 在某些实施方案中，所述宿主细胞是分离的宿主细胞。优选地，所述宿主细胞不存 在于人或动物身体中。
[0087] 在某些优选的实施方案中，所述宿主细胞被用包含表达盒的载体进行转染，所述 表达盒具有包含编码所关注的肽的核酸序列的表达元件。
[0088] 生产方法
[0089] 本发明提供用于生产所关注的肽的方法，其包括以下步骤 [0090](a)提供根据本发明的宿主细胞；
[0091] (b)在所述宿主细胞表达包含所述所关注的肽和所述血型糖蛋白的细胞外区或其 部分的融合肽的条件下培养所述宿主细胞；
[0092] (c)获得所述所关注的肽，任选地以所述融合肽的形式。
[0093] 在该方法中所使用的宿主细胞特别地被根据本发明的载体或表达盒所转染，其中 其表达元件包含编码所述所关注的肽的核酸序列。适合用于培养所述宿主细胞和表达所述 融合蛋白质的条件取决于在该方法中所使用的具体的宿主细胞、载体和表达盒。本领域技 术人员可以容易地确定合适的条件，并且对于众多宿主细胞而言这样的条件也已经是已知 的。在优选的实施方案中，所述融合肽由所述宿主细胞分泌进入培养基。在这些实施方案 中，所述表达元件优选包含编码包含细胞外定位信号的信号肽的核酸序列。
[0094] 用于生产所关注的肽的方法优选还包括以下步骤
[0095] (d)分离所述所关注的肽，任选地以所述融合肽的形式。
[0096] 步骤（d)优选在步骤（b)和步骤（c)之间进行。
[0097] 所关注的肽的分离特别指将所述所关注的肽与细胞培养物的剩余组分分离开。例 如，在所述所关注的肽由所述宿主细胞分泌的情况下，所述所关注的肽的分离包括将细胞 培养基与宿主细胞分开（例如通过离心）和将所述所关注的肽与所述培养基的一些或大部 分组分分离（例如通过色谱法）。适用于分离所述所关注的肽的方法和手段是本领域已知 的，并可以容易地由本领域技术人员进行应用。
[0098] 在优选的实施方案中，在根据本发明的方法中所使用的宿主细胞被用根据本发明 的载体或表达盒转染，其中其表达元件包含编码所述所关注的肽的核酸序列和编码蛋白酶 识别位点的核酸序列，所述蛋白酶识别位点位于编码所述血型糖蛋白的细胞外区或其部分 的核酸序列和编码所述所关注的肽的核酸序列之间。在这些实施方案中，所述方法优选还 包括以下步骤
[0099] (e)用能够识别所述蛋白酶识别位点的蛋白酶处理所述融合肽，其中所述融合肽 被裂解为作为所述所关注的肽的第一部分和包含所述血型糖蛋白的细胞外区或其部分的 第二部分；以及
[0100] (f)将所述所关注的肽与所述融合肽的第二部分分离。
[0101] 步骤（e)和（f)优选在步骤（b)和步骤（C)之间进行，更优选在步骤（d)和步骤 (c)之间进行。在这些实施方案中优选作为单个肽而不作为融合肽获得所述所关注的肽。
[0102] 合适的蛋白酶被描述于本文的上文中。适于蛋白酶消化的条件取决于所使用的具 体的蛋白酶并且所述条件是本领域已知的。可以通过已知方法将所述所关注的肽与所述融 合肽的第二部分分离，例如通过色谱法或体积排阻过滤。
[0103] 在更多的实施方案中，用于生产所关注的肽的方法优选还包括以下步骤
[0104] (g)将所述所关注的肽、任选地为所述融合肽的形式配制为药物组合物。
[0105] 步骤（g)优选在步骤（c)之后进行，特别是作为该方法的最后的步骤。
[0106] 将所述所关注的肽配制为药物组合物优选包括交换包含所述所关注的肽的组合 物的缓冲溶液或缓冲溶液组分。此外，配制步骤可以包括所述所关注的肽的冻干。特别地， 将所述所关注的肽转入仅包含药学可接受的成分的组合物。
[0107] 本发明还提供包含血型糖蛋白的细胞外区或其部分和所关注的肽的融合肽，其可 通过根据本发明的方法获得。此外，本发明提供包含融合肽的药物组合物，所述融合肽包含 血型糖蛋白的细胞外区或其部分和所关注的肽，其可通过根据本发明的方法获得。
[0108] 广量的提尚
[0109] 在又一个方面，本发明提供用于增加所关注的肽在重组生产中的产量的方法，其 包括作为融合肽的部分表达所述所关注的肽的步骤，所述融合肽还包含血型糖蛋白的细胞 外区或其部分。对于所述所关注的肽作为这样的融合肽的表达，优选使用根据本发明的表 达盒、载体、宿主细胞和/或生产方法。
[0110] 此外，本发明提供血型糖蛋白的细胞外区或其部分与所关注的肽一起以融合肽的 形式用于增加所述所关注的肽在重组生产中的产量的用途。对于所述所关注的肽作为这样 的融合肽的重组生产，优选使用根据本发明的表达盒、载体、宿主细胞和/或生产方法。
[0111] 上述的所有实施方案和特征也同样适用于根据本发明的方法和用途。
[0112] 本文中所描述的数字范围包括限定该范围的数字。本文所提供的标题并不限制可 以由参考本说明书作为一个整体所阅读出的本发明的各个方面或实施方案。根据一个实施 方案，本文所述的包含某些步骤的主题（在方法的情况下）或者包含某些成分的主题（在 组合物的情况下）是指由相应步骤或成分组成的主题。优选选择和组合本文所述的优选的 方面和实施方案，并且由优选的实施方案的各自组合所产生的具体的主题也属于本发明公 开的内容。 实施例
[0113] 实施例1 :红细胞生成素单独表达或作为融合蛋白质表达的比较
[0114] 在该测定中，测试了与血型糖蛋白A细胞外区的一部分融合对模型蛋白质人红细 胞生成素（EP0)的表达的作用。将编码EP0的核酸序列克隆入用于真核表达的标准载体， 所述载体包含EF-la启动子和作为选择标记物的二氢叶酸还原酶（DHFR)基因。存在IgK 或GM-CSF的前导序列（细胞外表达信号）用于所述EP0的分泌表达。此外，将编码成熟人 血型糖蛋白A的氨基酸1至38的核酸序列（GYPAex.reg.)以相同的阅读框克隆入所述载 体，在细胞外表达信号和所述EP0之间或所述EP0之后。在对照载体中，没有插入所述血型 糖蛋白构建体，而是仅编码所述细胞外表达信号和所述EP0。在该测定中所使用的构建体如 下：
[0115] 对照1 :IgK前导序列-EP0
[0116] 对照2 :GM-CSF前导序列-EP0
[0117]ETagl. 1:IgK前导序列-EPO-GYPAex.reg.
[0118]ETagl. 2 :IgK前导序列-GYPAex.reg. -EP0
[0119]ETagl. 3 :GM_CSF前导序列-GYPAex.reg. -EP0
[0120] 将这些不同的载体分别转染进入两个不同的人白血病来源的宿主细胞系。使用甲 氨蝶呤对细胞选择阳性转染子，并针对细胞生长和EP0生产力筛选所得到的转染细胞。针 对两个不同浓度的甲氨蝶呤选择剂确定这些细胞的皮克EP0/细胞/天（pcd)形式的生产 速率。没有进一步分析带有对照2构建体的细胞，因为它们的EP0生产力在最初的筛选中 非常低。不同表达细胞的最大生产速率被概括于下表中。
[0121] 表 1
[0122]
[0123] 这些数据证实了引入血型糖蛋白A的细胞外区片段显著提高所关注的蛋白质（即 EP0)的生产速率。生产速率的这种提高独立于所述血型糖蛋白片段的位置。N-末端和C-末 端融合提供了可媲美的高生产速率。甚至当忽视针对两个设置所使用的不同甲氨蝶呤浓度 时，使用血型糖蛋白片段融合构建体获得了生产速率的几乎10倍提高。在200mM甲氨蝶呤 浓度的组内，即针对带有多拷贝载体的转染细胞具有更高的选择压力，证实有高达20倍至 几乎40倍的提高。此外，根据本发明的融合构建体也显示出提高的生产速率独立于所使用 的表达细胞系。
[012