蓝莓中有机酸含量的测定的制作方法
【专利摘要】本发明具体涉及一种同时测定蓝莓中8个有机酸类成分含量的高效液相色谱法。其技术要点主要包括以下几个步骤：1)样品溶液的制备；2)标准溶液的制备；3)8种有机酸对照品标准曲线的建立；4)样品中有机酸含量的测定。本发明方法简便、快速、准确，具有良好的重复性和回收率，可作为蓝莓果实中有机酸含量的测定方法。
【专利说明】
蓝莓中有机酸含量的测定
技术领域
[0001] 本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种同时测定蓝莓果实提取物中8种有 机酸含量的方法。
【背景技术】
[0002] 蓝莓，又名蓝衆果、越橘，为杜鹊花科(Ericaceae)越橘属(Vaccinium)多年生灌木 果树，其果酸、甘、平，可止痢。蓝莓被国际粮农组织列为五大健康食品之一，具有抗肿瘤、增 强记忆力、增强视力、调节血脂、延缓衰老、消炎、调节血糖、改善血液循环、减肥等功效。其 果实的品质优劣是由风味和营养价值来综合体现，现代研究显示，蓝莓果实中含有丰富的 花色素、酚酸、有机酸等多种有效成分，蓝莓中的花青素一直是研究的热点，而有机酸的存 在不仅对蓝莓的风味有影响，更重要的是对花色苷等物质具有保护作用。
[0003] 目前对有机酸的检测方法很多，高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC)技术应用于蓝莓有机酸的含量检测也有报道，但已有的报道选择的 品种有限，同时测定有机酸的种类也不多。本实验采用HPLC法同时测定26种蓝莓中8个有机 酸的含量，建立的方法准确可靠，简便快捷，是一种分析蓝莓有机酸类成分的有效途径，可 为蓝莓中有机酸的开发利用提供理论依据，为蓝莓科学食用、品种选育及优良品种推广奠 定理论基础。
【发明内容】
[0004] 一种同时测定蓝莓中8种有机酸含量的HPLC方法，其特征在于，包括以下几个步 骤：
[0005] (1)样品溶液的制备
[0006] 精密称取蓝莓鲜果，切碎，以1 g: 10~15mL料液比加入含体积分数0.2 %盐酸的纯 净水，超声提取30~40min，过滤，滤渣以上述方法再提取一次，合并滤液，浓缩，定容，待 HPLC定量分析；
[0007] (2)标准溶液的制备
[0008] 分别精密称取草酸、奎宁酸、甲酸、苹果酸、莽草酸、乳酸、乙酸、柠檬酸对照品，用 纯净水根据标准品在HPLC中的响应值大小配制成质量浓度为1~20mg/mL的各有机酸标准 品储备液;再稀释制备成不同质量浓度的8种有机酸对照品混合溶液供制作标准曲线用；
[0009] (3) 8种有机酸对照品标准曲线的建立
[0010] 分别吸取步骤(2)中不同质量浓度的有机酸对照品混合溶液，进行高效液相色谱 测定，混合液中各有机酸的终浓度分别为:草酸10~400yg/mL、奎宁酸50~5000yg/mL、甲酸 0 · 06~0 · 72yg/mL、苹果酸50~2000yg/mL、莽草酸1 ~100yg/mL、乳酸 0 · 05~lyg/mL、乙酸 0.05~lyg/mL、柠檬酸500~20000yg/mL。色谱条件为：色谱柱XtimateXB-C18色谱柱4.6 X 250臟，5以111;流动相为0.01111〇1/1的磷酸二氢钾溶液，所述磷酸二氢钾溶液?!1为2.5;检测器 G4212-60008二极管阵列检测器，检测波长215nm;流速0.8mL/min;柱温40°C ;进样量10yL;
[0011]以有机酸对照品质量浓度X对峰面积Y进行线性回归，得到标准曲线，按信噪比3:1 确定检测限。
[0012] 4)样品中有机酸含量的测定
[0013] 按上述标准曲线建立的色谱条件对制备的样品溶液进行测定，利用线性回归方 程，计算样品中每种有机酸的含量。
[0014] 进一步地，在上述技术方案中，所述步骤（1)中，蓝莓鲜果质量与定容体积的比例 为3~5g:10mL。
[0015] 进一步地，在上述技术方案中，所述步骤(3)中，所述磷酸二氢钾溶液pH采用磷酸 调节。
[0016] 本发明的有益效果：
[0017] 优化的方法具有分析速度快，准确度高，重现性好，精密度高，稳定性好等优点，是 一种同时测定蓝莓果实中有机酸含量的理想方法，并可为其他原料中有机酸含量的测定提 供参考依据。
【附图说明】
[0018] 图1是实施例1中有机酸对照品混合液的液相色谱图，其中，草酸100yg/mL、奎宁酸 500yg/mL、甲酸0.24yg/mL、苹果酸 200yg/mL、莽草酸4yg/mL、乳酸0.2yg/mL、乙酸0.2yg/mL、 朽1 檬酸 2000yg/mL;
[0019] 图2是实施例1中蓝莓样品北陆的液相色谱图。
【具体实施方式】
[0020] 本发明提供了一种同时测定蓝莓样品中8种有机酸含量的液相色谱法，本发明领 域技术人员可借鉴本发明，适当改进工艺参数，所有类似的替换和改动都视为本发明。下述 非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制 本发明。下述实施例中所用试剂，如无特殊说明，均为商业途径获得;下述实施例中所用试 验方法，如无特殊说明，均为本领域技术人员熟知的常规实验方法。
[0021] 实施例1
[0022] 同时测定蓝莓中8种有机酸的含量，具体实施方案包括以下几个步骤：
[0023] (1)样品溶液的制备
[0024] 精密称取5.0g蓝莓鲜果，切碎，以1:10料液比加入含0.2%盐酸的纯净水，超声提 取30min，过滤，滤渣以上述方法再提取一次，合并滤液，浓缩，定容至10mL，待HPLC定量分 析。
[0025] (2)标准溶液的制备
[0026] 分别精密称取各个对照品草酸8.0mg、奎宁酸5.0mg、甲酸1.4mg、苹果酸4.0mg、莽 草酸2.0mg、乳酸1 .Omg、乙酸1 .Omg、梓檬酸20.0mg，再分别加lmL纯净水定容至lmL的容量瓶 中，得到质量浓度分别为8mg/mL(草酸）、5mg/mL(奎宁酸）、1 · 4mg/mL(甲酸）、4mg/mL(苹果 酸）、2mg/mL(莽草酸）、lmg/mL(乳酸）、lmg/mL(乙酸）、20mg/mL(朽 1檬酸）的不同质量浓度的 各标准品储备液，再稀释制备成6份不同质量浓度的混合对照品溶液，其中所含各个对照品 溶液的浓度分别为:草酸lOyg/mL、奎宁酸50yg/mL、甲酸0.06yg/mL、苹果酸50yg/mL、莽草酸 lyg/mL、乳酸 Ο · 05yg/mL、乙酸Ο · 05yg/mL、梓檬酸500yg/mL;草酸50yg/mL、奎宁酸 100yg/mL、 甲酸0 · 12yg/mL、苹果酸100yg/mL、莽草酸2yg/mL、乳酸0 · lyg/mL、乙酸0 · lyg/mL、梓檬酸 1000yg/mL;草酸 100yg/mL、奎宁酸500yg/mL、甲酸0 · 24yg/mL、苹果酸200yg/mL、莽草酸4yg/ mL、乳酸0 · 2yg/mL、乙酸0 · 2yg/mL、梓檬酸2000yg/mL;草酸200yg/mL、奎宁酸 1000yg/mL、甲 酸0.36yg/mL、苹果酸400yg/mL、莽草酸6yg/mL、乳酸0.4yg/mL、乙酸0.4yg/mL、梓檬酸3000μ g/mL;草酸300yg/mL、奎宁酸2000yg/mL、甲酸0 · 48yg/mL、苹果酸800yg/mL、莽草酸 1 Oyg/mL、 乳酸0 · 8yg/mL、乙酸0 · 8yg/mL、梓檬酸5000yg/mL;草酸400yg/mL、奎宁酸5000yg/mL、甲酸 0· 72yg/mL、苹果酸 2000yg/mL、莽草酸 100yg/mL、乳酸 lyg/mL、乙酸 lyg/mL、梓檬酸 20000yg/ mL〇
[0027] (3) 8种有机酸对照品标准曲线的建立
[0028] 分别吸取(2)中各个有机酸对照品稀释后得到的标准溶液混合液进行高效液相色 谱测定，每份混合标准溶液进样3次，每次进样10yL。色谱条件为:色谱柱XtimateXB-C18色 谱柱(4.6 X 250mm，5ym);流动相为0 · OlmoVL的磷酸二氢钾溶液(磷酸调节pH2 · 5);检测器 G4212-60008二极管阵列检测器，检测波长215nm;流速0.8mL/min;柱温40°C ;进样量10yL。
[0029] 以有机酸对照品质量浓度X对峰面积Y进行线性回归，得到标准曲线，按信噪比3:1 确定检测限，见表1。
[0030] 表1八种有机酸对照品标准曲线方程
[0033] (4)样品中有机酸含量的测定
[0034]按上述标准曲线建立的色谱条件对制备的样品溶液进行测定，利用线性回归方 程，计算样品中每种有机酸的含量。
[0035]表2蓝莓中有机酸含量(单位:mg/g鲜果）
[0037] 2、测定方法学考察
[0038] (1)精密度实验
[0039] 取有机酸对照品溶液，上述色谱条件连续进样6次，计算各有机酸峰面积的相对标 准偏差（Relative Standard Deviation，RSD)，结果所有有机酸的RSD值在 1.17% ~2.16% 之间，表明所用仪器精密度良好。结果如表3所示。
[0040] 表3精密度实验结果
[0042] (2)重复性实验
[0043]取品种蓝港的果实，按上述样品溶液制备方法分别提取6份，按上述色谱条件分别 进样，计算样品各有机酸峰面积的RSD值，结果其RSD值在0.53 %~2.73 %之间，表明该方法 重复性良好。结果如表4所示。
[0044] 表4重复性实验结果
[0046] (3)稳定性实验
[0047]取同一蓝莓样品提取液，按上述色谱条件，分别在放置0、2、4、8和12h后进样分析， 记录峰面积，计算样品各有机酸峰面积的RSD，结果其RSD值在1.22 %~3.89 %之间，表明供 试品溶液在室温条件下放置12h稳定性良好。结果如表5所示。
[0048]表5稳定性实验结果
[0050] (4)加样回收率实验
[0051]分别取9份相同重量的已知各有机酸含量的蓝港果实样品按上述方法制备有机酸 提取液，一份加入纯净水作对照，其余八份分别加入相同体积不同浓度的有机酸对照品溶 液，完全混匀后经过〇.45以!11微孔滤膜过滤，进样1(^匕各有机酸的平均回收率在96.8%~ 102.8 %之间，表明方法准确率高，结果见表6。
[0052]表6加样回收率实验结果(n = 9)
【主权项】
1. 一种同时测定蓝莓中8种有机酸含量的HPLC方法，其特征在于，包括以下几个步骤： (1) 样品溶液的制备 精密称取蓝莓鲜果，切碎，以lg: 10~15mL料液比加入含体积分数0.2 %盐酸的纯净水， 超声提取30~40min，过滤，滤渣以上述方法再提取一次，合并滤液，浓缩，定容，待HPLC定量 分析； (2) 标准溶液的制备 分别精密称取草酸、奎宁酸、甲酸、苹果酸、莽草酸、乳酸、乙酸、柠檬酸对照品，用纯净 水根据标准品在HPLC中的响应值大小配制成质量浓度分别为1~20mg/mL的各有机酸标准 品储备液;再稀释制备成不同质量浓度的对照品混合溶液； (3) 8种有机酸对照品标准曲线的建立 分别吸取步骤(2)种不同质量浓度的有机酸对照品混合溶液，进行液相色谱测定，混合 液中各有机酸的终浓度分别为：草酸10~400yg/mL、奎宁酸50~5000yg/mL、甲酸0.06~ 0 · 72yg/mL、苹果酸 50~2000yg/mL、莽草酸 1 ~100yg/mL、乳酸 0 · 05~lyg/mL、乙酸 0 · 05~1μ g/mL、柠檬酸500~20000yg/mL;色谱条件为：色谱柱XtimateXB-C18色谱柱4.6 X 250mm，5μ 111;流动相为0.01111〇1/1的磷酸二氢钾溶液，所述磷酸二氢钾溶液?!1为2.5;检测器64212-60008二极管阵列检测器，检测波长215nm;流速0.8mL/min;柱温40°C ;进样量10yL; 以有机酸对照品质量浓度X对峰面积Y进行线性回归，得到标准曲线，按信噪比3:1确定 检测限； 4)样品中有机酸含量的测定 按上述标准曲线建立的色谱条件对制备的样品溶液进行测定，利用线性回归方程，计 算样品中每种有机酸的含量。2. 根据权利要求1所述同时测定蓝莓中8种有机酸含量的HPLC方法，其特征在于，所述 步骤(1)中，蓝莓鲜果质量与定容体积的比例为3~5g: 1 OmL。3. 根据权利要求1所述同时测定蓝莓中8种有机酸含量的HPLC方法，其特征在于，所述 步骤(3)中，所述磷酸二氢钾溶液pH采用磷酸调节。
【文档编号】G01N30/88GK105866310SQ201610341896
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月20日
【发明人】弓晓杰, 李珂珂, 杨莉, 徐玉涛
【申请人】大连大学