基于柱前衍生的lc-ms测定有机酸含量的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种有机酸测定方法，具体涉及一种基于柱前衍生的LC-MS测定有机酸含量的方法，属于分析化学领域。
【背景技术】
[0002]有机酸是影响水果风味的一类重要物质，其种类和含量与果品的品质、风味密切相关，影响着水果的成熟度，包括酒石酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸等，具有提高机体免疫力、抑制脑组织脂质过氧化物生成、抗癌等作用。准确分析、测定样品中有机酸的种类和含量，对根系分泌物中有机酸种类研究以及果实风味特性及品质评价具有重要的意义。
[0003]目前，有机酸的测定方法主要包括气相色谱法、高效液相色谱法、离色谱法及气质联用、液质联用法，其中气相色谱法在检测时需先将有机酸衍生为易挥发物质，操作繁琐且检测结果准确性较低，而高效液相色谱法虽操作简便、结果重现性好，但由于有机酸极性较强，在色谱柱上的保留时间较短，难以与杂质有效分离，无法保障检测的灵敏度。加之水果中有机酸多具有相似的化学结构，光谱性质和PKa值类似，也严重阻碍了分析测定的进行。
[0004]化学衍生化技术是通过化学反应将某特定基团连接到目标化合物上，将其转换为一种具有新的物化性质的衍生物，再对衍生物进行分析测定，从而间接定性定量目标化合物的方法。鉴于有机酸中含有羧基基团，其衍生化可借鉴全氟辛酸、丙戊酸钠、γ -羟基丁酸等的分析检测。一般的，基于LC-MS的衍生化试剂应满足以下3点要求:1)对反应条件要求不苛刻，能够快速定量；2)与样品中某一组分反应后只针对性地生成一种衍生物，样品的分离、检测不受反应副产物和过量衍生化试剂的干扰;3)衍生化试剂廉价易得、通用性良好，与样品反应迅速、有效和具体，能形成相对稳定的衍生物。
[0005]公布号CN103698450A的发明专利公开了一种气相色谱-质谱检测细胞内有机酸的方法，包括:在胞内代谢物样品中加入氨基酸衍生剂，恒温静置后离心取上清，对上清进行气相色谱-质谱分析，其中氨基酸衍生剂为三甲基氯硅烷的三氟乙酰胺溶液，气相色谱柱采用HP-5MS或DB-5MS毛细管柱，检测器温度250 V，阶梯式升温至300 °C后维持3min，质谱分析采用EI离子源，检测器为四级杆，电离能70eV，离子源表面温度280°C。该方法能测定胞内如琥珀酸、苹果酸、柠檬酸等多种有机酸，色谱分析效果良好，但检测结果准确性及灵敏度还有待提尚。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种基于柱前衍生的LC-MS测定有机酸含量的方法，该方法操作简便，检测结果准确性好，灵敏度高，成本较低。
[0007]为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是:
[0008]基于柱前衍生的LC-MS测定有机酸含量的方法，包括以下步骤:
[0009]I)将待测样品、碳酸钠和2-溴苯乙酮加入溶剂中，混匀后于50?60°C下衍生化反应20?28h，冷却备用；
[0010]2)取步骤I)中反应产物进行液相色谱-质谱分析，对照标准曲线计算待测样品中有机酸的含量。
[0011]所述有机酸如水果中常见的二元或三元有机酸，如苹果酸、柠檬酸等。
[0012]步骤I)中碳酸钠可以与有机酸(如苹果酸、柠檬酸等)发生反应生成柠檬酸钠，相较有机酸，其钠盐更易与2-溴苯乙酮反应生成衍生产物。
[0013]步骤I)中2-溴苯乙酮是化学衍生化试剂，可与有机酸反应生成两种产物，一种是与有机酸中的一个羧基发生酯化反应的产物I，另一种是与两个羧基发生酯化反应的产物2，由于产物I在液相色谱分析中难以与杂质有效分离，特选择产物2作定性定量分析。经实验验证，2-溴苯乙酮过量添加不会对检测结果产生不良影响。
[0014]步骤I)中溶剂可采用无水乙腈、乙酸乙酯、四氢呋喃等。优选为无水乙腈，性质较稳定。经实验验证，无水乙腈添加量或多或少均不会对检测结果产生不良影响。
[0015]步骤I)中为促使待测样品(作标准曲线时，取待测有机酸的标准物质)、碳酸钠在无水乙腈中分散、溶解完全，可先将待测样品(作标准曲线时，取待测有机酸的标准物质)、碳酸钠溶于少量水中，再于无水乙腈混合。
[0016]步骤2)中液相色谱-质谱分析的色谱条件为:色谱柱:安捷伦EclipsePlus C18，规格:2.1 X 150mm、3.5μηι ；流动相:0.1 %乙酸水溶液:甲醇(v/v) = 2: 3，分析时间:O?12min，流速:0.2mL/min ；进样量:5yL。
[0017]步骤2)中液相色谱-质谱分析的质谱条件为:离子源:电喷雾电离源(ESI)正离子模式；毛细管电压:4500V；干燥气温度:2200C ；干燥气流速:4L/min ；雾化气气压:199.9KPa。液相采用安捷伦1260型液相色谱仪，质谱采用布鲁克amaZon SL离子阱质谱仪。
[0018]步骤2)中标准曲线的制作方法为:取待测有机酸的标准物质配制成系列浓度的标准溶液，在标准溶液中加入碳酸钠和2-溴苯乙酮，并于50?60 0C下衍生化反应20?28h，反应完毕，取反应产物进行液相色谱-质谱分析，以反应产物所对应的峰面积对其浓度作回归分析，得到物质浓度与峰面积的关系曲线。
[0019]本发明的有益效果:
[0020]本发明通过化学修饰技术对有机酸进行衍生化处理，改变其物理化学特性，在液质联用检测中能提高离子化效率，降低基质干扰，同时减少无机盐及内源性杂质的干扰，改善被分析物的信号强度，便于色谱分离和质谱检测，再利用液相色谱-质谱联用技术分析检测衍生化产物，能实现对有机酸的定性、定量分析。相对于现有的有机酸检测技术，该方法具有简单、高效等优点，采用常规色谱柱即可实现目标物与杂质的有效分离，且质谱分析效果良好，检测灵敏度高，准确性好。
[0021]本发明中化学衍生化试剂2-溴苯乙酮具有摩尔吸收系数大、衍生效率高、廉价易得等优点。另外，质谱分析时采用电喷雾电离源正离子模式能显著提高检测的灵敏度(相较LC-MS负离子模式而言)，适用于低含量有机酸的分析检测。
【附图说明】
[0022]图1为实施例1中梓檬酸衍生化产物的液质图；
[0023]图2为柠檬酸衍生化产物I的质谱图；
[0024]图3为柠檬酸衍生化产物2的质谱图；
[0025]图4为柠檬酸衍生化产物2对应柠檬酸浓度的标准曲线；
[0026]图5为实施例2中苹果酸衍生化产物的液质图；
[0027]图6为苹果酸衍生化产物I，的质谱图；
[0028]图7为苹果酸衍生化产物2’的质谱图；
[0029]图8为苹果酸衍生化产物2’对应苹果酸浓度的标准曲线。
【具体实施方式】
[0030]下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
[0031]实施例1
[0032 ]基于柱前衍生的LC-MS测定柠檬汁中柠檬酸含量的方法，包括以下步骤:
[0033]I)衍生化试剂、碳酸钠溶液及柠檬酸标准溶液的配制
[OO34 ] 准确称取19.9mg的2 -溴苯乙酮于干燥的试剂小瓶中，加入I OmL无水乙腈配制成浓度0.0lmol/L的储备溶液A，密封后置于冰箱中储存备用；
[0035]准确称取5.3mg的碳酸钠于干燥的试剂小瓶中，加入0.5mL水溶解碳酸钠，再加入9.5mL无水乙腈配制成浓度0.005mol/L的储备溶液B，密封后置于冰箱中储存备用；
[0036]准确称取6.4mg的柠檬酸于干燥的试剂小瓶中，加入1.5mL水溶解柠檬酸，再加入
8.5mL无水乙腈配制成浓度0.003mol/L的储备溶液C，密封后置于冰箱中储存备用；取5个干燥的离心管，分别量取100yL的无水乙腈，再依次分别加入1000yL、333yL、143yL、85yL、67y1^的储备溶液(3，配制成浓度为32(^8/1111^、16(^8/1]11^、8(^8/1111^、5(^8/1111^、4(^8/111]^的系列朽1檬酸标准溶液；
[0037]2)制作标准曲线
[0038]衍生化反应:分别量取500yL系列浓度的柠檬酸标准溶液于50mL的烧瓶中，按照摩尔比柠檬酸:碳酸钠:2-溴苯乙酮=1:1:1加入储备溶液A和储备溶液B，混合均匀，于55°C油浴条件下反应24h，反应完毕，冷却；
[0039]LC-MS检测:取柠檬酸衍生化产物进行高效液相色谱-质谱分析，液质图见图1;高效液相色谱的检测条件为:色谱柱:安捷伦Eclipse Plus C18，规格:2.1 X 150mm、3.5μπι；流动相:0.1 % (体积百分数)乙酸水溶液:甲醇(>八)=2:3，分析时间:0?121]1；[11，流速:0.211117min;进样量:5yL;质谱的检测条件为:离子源:电喷雾电离源(ESI)正离子模式；毛细管电压:4500V;干燥气温度:2200C ；干燥气流速:4L/min;雾化气气压: