199.9KPa;液相采用安捷伦1260型液相色谱仪，质谱采用布鲁克amaZon SL离子阱质谱仪；
[0040]数据处理:从总离子流图中提取与一个羧基发生酯化反应的衍生化产物I([M+1 ] +准分子离子峰m/z = 310.98)的质谱图(见图2，图中[M+Na]+离子峰m/z = 333.04)，以及与两个羧基发生酯化反应的衍生化产物2([M+1]+准分子离子峰m/z = 429.08)的质谱图(见图3，图中[M+Na]+离子峰m/z = 451.09)，由于产物I在液相色谱分析中难以与杂质有效分离，特选择产物2作定性定量分析；以柠檬酸浓度为横坐标X，与两个羧基发生酯化反应的衍生化产物2所对应的峰面积为纵坐标Y，以外标法定量(见图4)，在柠檬酸浓度13.33?106.6yg/1^范围内，得到标准曲线1:丫 = 283718(^+42515600 4 = 0.9966;
[0041 ] 3)柠檬汁中柠檬酸含量的测定
[0042]衍生化反应:取500yL柠檬汁于50mL的烧瓶中，加入500yL储备溶液A和500yL储备溶液B，混合均匀，于55 °C油浴条件下反应24h，反应完毕，冷却；
[0043]LC-MS检测:取反应产物进行高效液相色谱-质谱分析;高效液相色谱和质谱的检测条件同上；
[0044]数据处理:从总离子流图中提取与两个羧基发生酯化反应的衍生化产物2的质谱图，通过检测产物2所对应的峰面积，由标准曲线得到检测样品中柠檬酸的含量，再计算得到梓檬汁中梓檬酸的含量为19.4yg/ mL。
[0045]实施例2
[0046]基于柱前衍生的LC-MS测定苹果汁中苹果酸含量的方法，包括以下步骤:
[0047]I)衍生化试剂、碳酸钠溶液及苹果酸标准溶液的配制
[OO48 ] 准确称取19.9mg的2 -溴苯乙酮于干燥的试剂小瓶中，加入I OmL无水乙腈配制成浓度0.0lmol/L的储备溶液A，密封后置于冰箱中储存备用；
[0049]准确称取5.3mg的碳酸钠于干燥的试剂小瓶中，加入0.5mL水溶解碳酸钠，再加入9.5mL无水乙腈配制成浓度0.005mol/L的储备溶液B，密封后置于冰箱中储存备用；
[°05°] 准确称取6.7mg的苹果酸于干燥的试剂小瓶中，加入ImL水溶解苹果酸，再加入9mL无水乙腈配制成浓度0.005mol/L的储备溶液C，密封后置于冰箱中储存备用；取5个干燥的离心管，分别量取100(^1^的无水乙腈，再依次分别加入33341^、14341^、6741^，3241^，2141^的储备溶液C，配置成浓度为 167.5yg/ml、83.8yg/ml、42.lyg/ml、20.8yg/ml、13.8yg/ml的系列苹果酸标准溶液。
[0051 ] 2)制作标准曲线
[0052]衍生化反应:分别量取500yL系列浓度的苹果酸标准溶液于50mL的烧瓶中，按照摩尔比苹果酸:碳酸钠:2-溴苯乙酮=1:1:1加入储备溶液A和储备溶液B，混合均匀，于55°C油浴条件下反应24h，反应完毕，冷却；
[0053]LC-MS检测:取苹果酸衍生化产物进行高效液相色谱-质谱分析，液质图见图5;高效液相色谱的检测条件为:色谱柱:安捷伦Eclipse Plus C18，规格:2.1 X 150mm、3.5μπι；流动相:0.1 %乙酸水溶液:甲醇(v/v) = 2:3，分析时间:O?12min，流速:0.2mL/min ；进样量:5yL;质谱的检测条件为:离子源:电喷雾电离源(ESI)正离子模式;毛细管电压:4500V;干燥气温度:220 0C ；干燥气流速:4L/min ；雾化气气压:199.9KPa ；
[0054]数据处理:从总离子流图中提取与一个羧基发生酯化反应的衍生化产物I’([M+1]+准分子离子峰m/z = 252.94)的质谱图(见图6，图中[M+Na]+离子峰m/z = 274.94)，以及与两个羧基发生酯化反应的衍生化产物2’([M+1]+准分子离子峰m/z = 371.04)的质谱图(见图7，图中[M+Na]+离子峰m/z = 393.08)，由于产物I在液相色谱分析中难以与杂质有效分离，特选择产物2，作定性定量分析；以苹果酸浓度为横坐标X，与两个羧基发生酯化反应的衍生化产物2’所对应的峰面积为纵坐标Y，以外标法定量(见图8)，在苹果酸浓度4.65?55.83yg/mL范围内，得到标准曲线2: Y = 8971190X+115583000，r = 0.9754；
[0055]3)苹果汁中苹果酸含量的测定
[0056]衍生化反应:取500yL苹果汁于50mL的烧瓶中，加入500yL储备溶液A和500yL储备溶液B，混合均匀，于55 °C油浴条件下反应24h，反应完毕，冷却；
[0057]LC-MS检测:取反应产物进行高效液相色谱-质谱分析;高效液相色谱和质谱的检测条件同上；
[0058]数据处理:从总离子流图中提取与两个羧基发生酯化反应的衍生化产物2’的质谱图，通过检测产物2’所对应的峰面积，由标准曲线得到检测样品中苹果酸的含量，再计算得到苹果汁中苹果酸的含量为15.3yg/mL。
[0059]实施例3
[0060]基于柱前衍生的LC-MS测定混合果汁中柠檬酸、苹果酸含量的方法，包括以下步骤:
[0061]I)衍生化试剂、碳酸钠溶液、柠檬酸及苹果酸标准溶液的配制同实施例1、2;
[0062]2)柠檬酸、苹果酸标准曲线的制作也同实施例1、2;
[0063]3)混合果汁中柠檬酸、苹果酸含量的测定
[0064]衍生化反应:取500yL混合果汁于50mL的烧瓶中，加入500yL储备溶液A和500yL储备溶液B，混合均匀，于55 °C油浴条件下反应24h，反应完毕，冷却；
[0065]LC-MS检测:取反应产物进行高效液相色谱-质谱分析;高效液相色谱和质谱的检测条件同上；
[0066]数据处理:从总离子流图中提取与两个羧基发生酯化反应的衍生化产物2及衍生化产物2’的质谱图，通过检测产物2、产物2’所对应的峰面积，由标准曲线1、2得到检测样品中柠檬酸、苹果酸的含量，再计算得到混合果汁中柠檬酸、苹果酸的含量分别为12.5yg/mL和13.6yg/mLo
【主权项】
1.基于柱前衍生的LC-MS测定有机酸含量的方法，其特征在于:包括以下步骤: 1)将待测样品、碳酸钠和2-溴苯乙酮加入溶剂中，混匀后于50?60°C下衍生化反应20?28h，冷却备用； 2)取步骤I)中反应产物进行液相色谱-质谱分析，对照标准曲线计算待测样品中有机酸的含量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述有机酸为水果中的二元或三元有机酸。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤I)中溶剂为无水乙腈、乙酸乙酯或四氢呋喃。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤2)中液相色谱-质谱分析的色谱条件为:色谱柱:安捷伦Eclipse Plus C18，规格:2.1 X 150mm、3.5μηι;流动相:以体积比计，0.1%乙酸水溶液:甲醇= 2:3，分析时间:0?12min，流速:0.2mL/min;进样量:5yL。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤2)中液相色谱-质谱分析的质谱条件为:离子源:电喷雾电离源正离子模式；毛细管电压:4500V;干燥气温度:2200C ;干燥气流速:4L/min ；雾化气气压:199.9KPa。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤2)中标准曲线的制作方法为:取待测有机酸的标准物质配制成系列浓度的标准溶液，在标准溶液中加入碳酸钠和2-溴苯乙酮，并于50?600C下衍生化反应20?28h，反应完毕，取反应产物进行液相色谱-质谱分析，以反应产物所对应的峰面积对其浓度作回归分析，得到物质浓度与峰面积的关系曲线。
【专利摘要】本发明公开了一种基于柱前衍生的LC-MS测定有机酸含量的方法，属于分析化学领域。该方法包括：1)将待测样品、碳酸钠和2-溴苯乙酮加入溶剂中，混匀后于50～60℃下衍生化反应20～28h，冷却备用；2)取步骤1)中反应产物进行液相色谱-质谱分析，对照标准曲线计算待测样品中有机酸的含量。本发明通过化学修饰技术对有机酸进行衍生化处理，改变其物理化学特性，在液质联用检测中能提高离子化效率，降低基质干扰，同时减少无机盐及内源性杂质的干扰，改善被分析物的信号强度，便于色谱分离和质谱检测，再利用液相色谱-质谱联用技术分析检测衍生化产物，能实现对有机酸的定性、定量分析，具有简单、高效、检测灵敏度高、准确性好等优点。
【IPC分类】G01N30/88, G01N30/06
【公开号】CN105699580
【申请号】CN201610277903
【发明人】卢明华, 徐林芳, 王友梅
【申请人】河南大学
【公开日】2016年6月22日
【申请日】2016年4月28日