专利名称：同时测定水果中10种有机酸含量的高效液相色谱法的制作方法
同时测定水果中10种有机酸含量的高效液相色谱法
技术领域：
本发明涉及一种水果有机酸的含量的测定方法，尤其涉及一种同时测定水果中10种有机酸含量的高效液相色谱法。
背景技术：
有机酸是指一些具有酸性的有机化合物。最常见的有机酸是羧酸，其酸性源于羧基(-C00H)。磺酸(-SO3H)、亚磺酸(RSOOH)、硫羧酸(RCOSH)等也属于有机酸。有机酸可与醇反应生成酯。羧基是羧酸的官能团，除甲酸(H-COOH)外，羧酸可看做是羟分子中的氢原子被羧基取代后的衍生物。可用通式(Ar)R-COOH表示。羧酸在自然界中常以游离状态或以盐、酯的形式广泛存在。羧酸分子中羟基上的氢原子被其他原子或原子团取代的衍生物叫取代羧酸。重要的取代羧酸有卤代酸、羟基酸、酮酸和氨基酸等。这些化合物中的一部分参与动植物代谢的生命过羟，有些是代谢的中间产物，有些具有显著的生物活性，能防病、治病，有些是有机合成、工农业生产和医药工业原料。水果中有相当部分的干物质是有机酸，它往往比许多其他物质更多地决定水果的特殊味道，并在食品营养学中占有重要位置，不同种类的水果中有机酸的种类和含量差别很到，故在现代食品工业中对有机酸的研究已愈加重视和普及。有机酸的分析方法主要有酸碱滴定法、薄层色谱法、气相色谱法、离子色谱法及高效液相色谱法等。由于各组分的检测方法和条件差别较大，需分批多次检测，非常繁琐。高效液相色谱法操作简便、准确度高、重现性好，可同时定量测定多种有机酸。但现有技术中还未出现能够采用高效液相色谱同时测定水果中的10个有机酸(草酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、苹果酸、富马酸、乙酸、丙酸、异丙酸、丁酸)的相关文献或报道。
发明内容本发明所要解决的技术问题在于提供一种同时测定水果中10种有机酸含量的高效液相色谱法，具有操作简单快捷的特点。本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的一种同时测定水果中10种有机酸含量的高效液相色谱法，该方法具体包括如下步骤( I)标准样品溶液的制备分别称取HPLC色谱纯度在99%以上的草酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、苹果酸、富马酸、乙酸、丙酸、异丙酸、丁酸试剂，之后用流动相水相制备该10种有机酸不同浓度梯度在O. 01-lmg/mL的标准样品溶液；(2)待测液的制备鲜样称取IOg鲜样置于组织捣碎机中，并加入IOOml 80%乙醇匀浆lmin，取IOml的匀浆以3000rpm/min离心IOmin后分出上清液，将上清液转入50mL容量瓶中，且离心的残渣再用80%乙醇洗涤两次，每次15ml，离心lOmin，合并上清液，用80%乙醇定容混匀得提取液；取5. OOmL提取液于蒸发皿中，且于70°C下恒温水浴蒸发乙醇，蒸发获得的残留物用重蒸水定容到IOmL混匀得样液，之后取部分该样液过O. 45um滤膜得待测液；干样称2 3g干样并采用20mL 80%乙醇进行研磨，接着于80°C下恒温水浴30min后浸提，并离心收集提取液，之后将提取液蒸干，蒸干获得的物质采用2ml超纯水溶解得样液，取部分该样液过O. 45um滤膜即获待测液；(3)使用包括四元泵、柱温箱、DAD检测器以及工作站所组成的HPLC仪器，在氢离子交换柱上，以乙腈-硫酸溶液为流动相等度洗脱分离各种有机酸，色谱条件如下分析柱氢离子交换柱；流动相水相A:0. 001mol/L—O. 005mol/L的硫酸溶液；有机相B:乙腈；且A的体积百分比为100-96%，B的体积百分比为为4-0%;流速0·4-0. 5mL/min;·
洗脱方式等度洗脱；检测210nm_280nm；温度25-50O;进样体积10-20μ L ；检测时间30min；(4)测定分别取制备获得的标准样品溶液及待测液，并采用上述色谱条件进行进样检测，之后采用外标法定量分析计算水果中10种有机酸的含量。进一步地，所述氢离子交换柱为Rezex ROA-Organic Acid H+New Column250x4. 6mm。进一步地，所述水果为枇杷、葡萄或柑橘。本发明同时测定水果中10种有机酸含量的高效液相色谱法的有益效果在于能够对水果中的草酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、苹果酸、富马酸、乙酸、丙酸、异丙酸、丁酸进行同时测定，且测定的操作简单快捷，并且具有较高的测定准确度。
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。图I是本发明标准样品溶液的高效液相色谱图。图2是本发明中实施例一待测液的高效液相色谱图。图3是本发明中实施例二待测液的高效液相色谱图。图4是本发明中实施例三待测液的高效液相色谱图。图5是本发明中实施例四待测液的高效液相色谱图。
具体实施方式结合如下实施例对本发明同时测定水果中10种有机酸含量的高效液相色谱法进行进一步说明；需要说明的是，本发明中10种有机酸分别为草酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、苹果酸、富马酸、乙酸、丙酸、异丙酸、丁酸；申请人以葡萄果实干样(含果皮、果肉)、新鲜枇杷果肉、及冻干的茂谷橘橙为例来分别测定葡萄、枇杷、及柑橘中该10种有机酸的含量；且在本发明中，测定新鲜水果(鲜样)、或水果的冻干果实(干样)时，其制备待测液的操作是不一致的，具体的参照如下各实施例。
实施例一葡萄果皮干样(I)标准样品溶液的制备分别称取HPLC色谱纯度在99%以上的草酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、苹果酸、富马酸、乙酸、丙酸、异丙酸、丁酸试剂，用O. OOlmol/L的硫酸溶液配制10种有机酸O. 5mg/mL的标准液；根据葡萄酒中有机酸的实际含量及每种标准品的最大吸收波长下得响应值，稀释一定倍数配制混合标准液，再将该混合标准液稀释成不同的浓度梯度得标准样品溶液，即上述混合标准液浓度的O. 5,0. 25，O. 1,0. 05，O. 025,0. 02倍。(2)待测液的制备称2g葡萄果皮干样并采用20mL 80%乙醇进行研磨，接着于80°C下恒温水浴30min后浸提，并离心收集提取液，之后将提取液蒸干，蒸干获得的物质采 用2ml超纯水溶解得样液，取部分该样液过O. 45um滤膜即获待测液；(3)使用包括四元泵、柱温箱、DAD检测器以及工作站所组成的HPLC仪器，在氢离子交换柱上，以乙腈-硫酸溶液为流动相等度洗脱分离各种有机酸，色谱条件如下分析柱RezexROA-Organic Acid H+New Column 250x4. 6mm ；流动相水相A:0. 001mol/L的硫酸溶液；有机相B:乙腈；且A的体积百分比为96%，B的体积百分比为4%;流速0.4mL/min;洗脱方式等度洗脱；检测210-280nm；温度50°C;进样体积15yL;检测时间30min；(4)测定分别取制备获得的标准样品溶液及待测液，并采用上述色谱条件进行进样检测，获得10条标准曲线回归方程(见表I)、如图I所示标准样品的高效色谱图及如图2所示待测液的高效色谱图；之后采用外标法定量分析计算该葡萄果皮干样中10种有机酸的含量，且分析计算结果如表2所示。表I有机酸标准曲线回归方程、相关系数、线性下限
权利要求
1.一种同时测定水果中10种有机酸含量的高效液相色谱法，其特征在于该方法具体包括如下步骤 (1)标准样品溶液的制备 分别称取HPLC色谱纯度在99%以上的草酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、苹果酸、富马酸、乙酸、丙酸、异丙酸、丁酸试剂，之后用流动相水相制备该10种有机酸不同浓度梯度在O.01-lmg/mL的标准样品溶液； (2)待测液的制备 鲜样称取IOg鲜样置于组织捣碎机中，并加入IOOml 80%乙醇匀浆lmin，取IOml的匀浆以3000rpm/min离心IOmin后分出上清液，将上清液转入50mL容量瓶中，且离心的残渣再用80%乙醇洗涤两次，每次15ml，离心lOmin，合并上清液，用80%乙醇定容混匀得提取液；取5. OOmL提取液于蒸发皿中，且于70°C下恒温水浴蒸发乙醇，蒸发获得的残留物用重蒸水定容到IOmL混匀得样液，之后取部分该样液过O. 45um滤膜得待测液； 干样称2 3g干样并研磨过60目，接着于80°C下恒温水浴80%乙醇浸提30min，并离心收集提取液，之后将提取液蒸干，蒸干获得的物质采用2ml超纯水溶解得样液，取部分该样液过O. 45um滤膜即获待测液； (3)使用包括四元泵、柱温箱、DAD检测器以及工作站所组成的HPLC仪器，在氢离子交换柱上，以乙腈-硫酸溶液为流动相等度洗脱分离各种有机酸，色谱条件如下 分析柱氢离子交换柱； 流动相水相A:0. 001mol/L—O. 005mol/L的硫酸溶液；有机相B:乙腈；且A的体积百分比为100-96%，B的体积百分比为为4-0%;流速0. 4-0. 5mT,/mi η ; 洗脱方式等度洗脱； 检测210nm-280nm ；温度:25-50 0C ； 进样体积10-20yL； 检测时间30min ； (4)测定分别取制备获得的标准样品溶液及待测液，并采用上述色谱条件进行进样检测，之后采用外标法定量分析计算水果中10种有机酸的含量。
2.根据权利要求I所述同时测定水果中10种有机酸含量的高效液相色谱法，其特征在于所述氢离子交换柱为 Rezex ROA-Organic Acid H+New Column 250x4. 6mm。
3.根据权利要求I所述同时测定水果中10种有机酸含量的高效液相色谱法，其特征在于所述水果为枇杷、葡萄或柑橘。
全文摘要
本发明提供一种同时测定水果中10种有机酸含量的高效液相色谱法，将制备的标准样品溶液及待测液进行高效液相色谱仪进行检测，且色谱条件如下分析柱氢离子交换柱；流动相水相A:0.001mol/L—0.005mol/L的硫酸溶液；有机相B:乙腈；且A的体积百分比为100-96%，B的体积百分比为为4-0%；流速0.4-0.5mL/min;洗脱方式等度洗脱；检测210nm-280nm；温度25-50℃；进样体积10-20μL；检测时间30min；且最后采用外标法定量分析计算水果中10种有机酸的含量。且本发明具有操作简单快捷的特点。
文档编号G01N30/88GK102818872SQ20121028089
公开日2012年12月12日 申请日期2012年8月8日 优先权日2012年8月8日
发明者陈源, 余亚白, 何志刚, 林晓姿, 魏巍, 谢鸿根 申请人:福建省农业科学院农业工程技术研究所