V与Vk序列的框架区I至III进行组合来实现。这些人工和 嵌合可变结构域的稳定性进一步通过可变轻链结构域的框架区III中的F101E修改(根据 AHo编号方案)来改进，所述F101E即为空间上接近框架区IV的位置。
[0085] 重要的是，基于公开的情况（Schdfer, Protein Engineering，Design&Selection 25(2012)485-505)，可变结构域的优选特性也有望转化为其他抗体形式。
[0086] 从参考文献（W0 2009/155723)鉴别示例性兔结合剂，并且使用如Borras等 (Borras，上述引文）中所公开的CDR定义将所述结合剂的CDR移植到人共有VH3/VK1框架的 相应的可变结构域中（Rader 2000,上述引文;W0/2005/016950;W0 2008/004834;US 8， 293，235)。对于兔⑶R的环移植，将根据Honegger(Honegger&Pliickthun，上述引文；参见图 2)进行编号的序列片段CDR-L1 (L24-L42)、CDR-L2(L58-L72)、CDR-L3(L107-L138)、CDR-H1 (H27-H42)、CDR-H2(H57-H76)、CDR-H3(H109-H138)转移到人框架中。基于这些人源化可变 结构域，scFv构建体通过借助于柔性Gly4-Ser接头连接VL和VH来产生，从而产生NH 2-VL-接 头-VH-C00H的构型。
[0087] 方法
[0088] 构建体设计和制造
[0089]从头合成所得氨基酸序列，并且将其克隆到针对大肠杆菌表达基于pET26b( + )主 链（Novagen)进行修改的表达载体中。将表达构建体转化至大肠杆菌菌株BL12(DE3) (Novagen)中，并且在2YT培养基（Sambrook，J·，等，Molecular Cloning: A Laboratory Manual)中将细胞培养作为起始培养物。接种表达培养物，并且在37 °C和200rpm下在带挡板 的烧瓶中孵育所述表达培养物。一旦〇D600nm达到1，就通过添加IPTG至0.5mM的终浓度来诱 导蛋白质表达。在过夜表达之后，通过以4000g离心来收获细胞。对于包涵体的制备，将细胞 沉淀在IB重悬浮缓冲液（50mM Tris-HCl pH 7.5，100mM NaCl，5mM EDTA，0.5% 曲通 (Tr i ton)X-100)中重悬。向细胞浆液补充ImM DTT、0 · lmg/mL溶菌酶、1 OmM亮抑蛋白酶肽、 100μΜ PMSF以及ΙμΜ胃酶抑素。通过3个超声均化循环来溶解细胞，同时在冰上冷却所述细 胞。随后添加0.01mg/mL DNA酶，并且在室温下将匀浆孵育20分钟。通过以10，000g和4°C离 心来使包涵体沉降下来。将IB重悬浮在IB重悬浮缓冲液中，并且通过超声处理来均化，之后 进行另一次离心。总共最少3次用IB重悬浮缓冲液进行洗涤步骤，并且随后用IB洗涤缓冲液 进行2次洗涤，以产生最终的IB。
[0090] 对于蛋白质重折叠，以5mL/g湿润IB的比率将分离的IB重悬浮在增溶缓冲液 (100mM Tris/HCl pH 8.0,6M Gdn-HCl，2mM EDTA)中。将增溶作用在室温下孵育30分钟，直 到添加DTT至20mM的终浓度，并且将孵育另外继续30分钟。在增溶作用完成之后，通过以 8500g和4°C离心10分钟来使溶液变澄清。以0.5g/L的溶解蛋白质的最终蛋白质浓度快速稀 释在重折叠缓冲液(通常为：100 mM Tris-HCl pH 8.0,4.0M尿素，5mM半胱氨酸，ImM胱氨 酸）中来进行重折叠。重折叠反应常规最少孵育14小时。将所得蛋白质溶液浓缩，并且通过 与天然缓冲液(50mM柠檬酸盐-磷酸盐pH 6.4,200mM NaCl)渗滤交换缓冲液。通过在合适的 树脂材料(例如，Superdex 75,GE Healthcare)上进行尺寸排阻色谱法来纯化重折叠蛋白 质。通过尺寸排阻HPLC分析分离的单体部分，SDS-PAGE用于分析纯度，并且UV/Vis光谱法用 于分析蛋白质含量。将蛋白质浓度调节到所需水平，并且进行稳定性分析。
[0091] 结构模型的比较
[0092] 使用roB中获得的结构模型的实例（分别是PDB ID 1FVC和roB ID 2A9M)来对可变 结构域VU和VU的三维结构进行比较。VL框架区IV的封装的分析揭示了从147位向上的侧 链取向的差异。此外，在Vk和νλ结构中，氨基酸侧链在1 〇 1位的取向是不同的。如图4所示，中 心氨基酸（101位)的不同封装是显而易见的。在Vk的情况下，苯丙氨酸101在λ可变结构域中 指示在结构域的核心处，然而，101位处的谷氨酸被暴露于溶剂，并且V147(箭头)转而定位 到疏水核上。基于这种情况，产生含有氨基酸交换F101E的可变结构域(SEQ ID N〇:8，ll和 13)来容纳νλ框架IV的νλ特异性封装。 实施例2:测定scFv构建体的生物物理数据 [0093]热解折叠
[0094]测试的构建体的热解折叠的过渡中点是通过差示扫描荧光测定法(DSF)来测定， 基本上如Niesen(Niesen等，Nat Protoc. 2(2007)2212-21)所述。DSF测定在qPCR仪（例如， MX3005p，Agilent Technologies)上进行。将样品稀释在25yL总体积的含有最终浓度为5x SYPR0橙的缓冲液(柠檬酸盐-磷酸盐pH 6.4,0.25 M NaCl)中。在缓冲液探索性实验中，针 对所有构建体，测定解折叠温度的pH依赖性并且观察可比pH特征。一式三份测量样品，并且 设定程序使得从25°C至96°C的温度斜升。获取荧光信号，并且用GraphPad Prism(GraphPad Software Inc ·)分析原始数据。
[0095]应激稳定性研究
[0096]经两周且在37°C储存下通过尺寸排阻-高效液相色谱法（SE-HPLC)分析蛋白质的 低聚性，并且通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析蛋白质的降解。在 研究之前，将样品浓缩为1、10和40g/L，并且确定t0时间点。通过在Shodex KW-402.5-4F (Showa Denko)上分离样品并评价所得色谱图来量化单体含量。为了计算蛋白质单体的相 对百分比，将单体峰的面积除以不可归于样品基质的峰的总面积。用Any kD Mini-Protean TGX凝胶(Bio-Rad Laboratories)进行SDS-PAGE分析来评定蛋白质降解，并且利用考马斯 亮蓝来染色。在不同的时间点通过用配备有Nanoquant平板的Infinity reader M200Pro (Tecan Group Ltd.)进行UV-Vis光谱法来监测蛋白质浓度。 实施例3:来自市售人源化小鼠单克隆抗体的scFv构建体的构建
[0097] 为了证实所提出的概念对抗体可变结构域的稳定作用具有广泛适用性，基于包含 Vk轻链的市售人源化小鼠单克隆抗体产生两个单链Fv构建体。对于第一构建体，原始可变 结构域序列按公开的情况用于IgG的氨基酸序列，而对于第二构建体，使用修改的序列，其 中可变轻链结构域的框架区IV被置换为来自λ种系基因的相应序列。在 scFv构建体中，可变 结构域通过具有20个氨基酸的柔性(Gly4Ser)4接头(SEQ ID NO: 1)来联接，从而产生如在模 型构建体scFvl至scFvl0(参见表2)中所使用的NH2-VL-接头-VH-⑶0H的构型。如上所述进 行scFv分子的表达和重折叠，并且重折叠蛋白质通过在蛋白质L树脂上进行亲和色谱法来 纯化。通过SE-HPLC对纯化的蛋白质的分析揭示了构建体的可生产性的显著差异，所述显著 差异表现为含有VL中的λ框架IV的构建体的显著提高的单体含量(参见图5)。此外，具有原 始序列和含有VL中的λ框架IV的分子的构建体的热解折叠分析分别产生69.9°C和71.2°C的 解折叠中点。这个观察与第[0082]段中所描述的结果一致。 实施例4:具有较短接头序列的scFv构建体的构建
[0098] 为了分析接头序列的影响，以与上文在实施例1中所描述相同的方式使用较短的 具有15个氨基酸的(Gly4Ser)3接头(SEQ ID N0:34)来制得替代构建体。除了接头，两个构建 体scFvll和scFvl2分别对应于构建体scFvl和scFv5(参见表2)。如上文在实施例2中所描述 进行应激稳定性研究。如表4中所示，较短接头含有VL中的λ框架IV的构建体scFvl2相对于 具有共有κ轻链scFvll的构建体显示出增加的稳定性。分子的总稳定性低于具有较短接头 的相应构建体。众所周知的是，通过使用20聚体或25聚体接头替代15聚体接头能增加scFv 稳定性（参见 W0m和Pliickthun，J.Mol .Biol .305(2001)989-1010)。因此，这些发现与利 用20聚体接头的结果是一致的，并且证实可变结构域的稳定性通过将λ框架IV引入VL中来 提尚。 表1:蛋白质序列表
(在SEQ ID NO: 23至33中，⑶R区以粗体和斜体表示） 表2:不同scFv构建体的可变结构域的组合
表3:通过差示扫描荧光测定法测定所有构建体的热解折叠的过渡中点 构建沐ID Tm scFv 1 70.19 ±0.22 scFv2 66.82 ±0.37 scFV3 65.44 ±0.15 scFv4 74.31 ±0.04 scFv5 70.86 士 0,16 scFv6 75.19 ±0.13 scFv? 68.42 ±0.05 scFv 8 75.45 ±0.36 scFv9 71.15 士0.27 scFv 10 71.25 ±0.29 scFv 11 70.34 士 0.20 scFv 12 70.18 ±0.03 表4:储存期间的单体损失 SEQID 37°C 下 1#L 37°C 下 10g/L 37°C 下 40g/L scFv! -16.8% -44.3% -34.7% scFV2 -1.9% -20.1% -39.6% scFv3 -23.0% -64.7% -81.σΧ> scFv4 -0.9% -9.2% -14.0% st:Fv5 -1.6% -11.4% -17.0% scFv 6 -0.8% -4.0% -6.5% scFV7 -0.6% -13.1% -25.4% scFv8 0.1% -0.2% -3.1% st:Fv9 -1,3% -10.1% -22.9% scFv 10 -0.5% -14.4% -26.7% scFvll -563% -77.7% -80.2% scFvi2 -5.7% -41.3% -65.9% 注意:斜体条目来自具有VK-类型框架IV区的scFv构建体 表5:B〇rras等(上述引文）中所列的克隆列表和序列变化 下文所列的所有克隆都具有FW1.4gen的序列（SEQ ID N0:4)，但区别在于下文以粗体 表示的位置(根据Borras等(上述引文)对位置编号)_
[0099] 本发明在范围上不受本文描述的特定实施方案的限制。事实上，本领域的技术人 员将根据前述说明理解本发明中除了本文描述的那些修改之外的各种修改。这类修改意图 落在所附权利要求书的范围内。
[0100] 在相应专利法的允许范围内，本文引用的所有专利、申请、出版物、测试方法、参考 文献以及其他材料以引用的方式并入本文。
【主权项】
1. 一种抗体VL结构域，其包含：（i)人VK框架区I至π I; (i i)⑶R结构域⑶R1、CDR2以及 CDR3;以及(iii)框架区IV，所述框架区IV选自： a. 用于框架区IV的人νλ种系序列，特别是选自以下序列的νλ种系序列：SEQ ID NO.16 至22; b. 基于νλ的序列，其为(bi)来自用于框架区IV的人νλ种系序列的共有νλ序列，特别是 SEQ ID NO.17;或(bii)来自用于框架区IV的重排人νλ序列的共有νλ序列，特别是选自以下