2% (m/v) BSA 的 PBST
[0018] (5)辣根过氧化物酶（HRP)标记的鼠抗猪酶标二抗（购自武汉科前动物生物制品 有限责任公司）
[0019] (6)底物显色液A !Na2HPO4 · 12H20 14. 6g，柠檬酸9. 33g，过氧化氢脲0· 52g，加蒸 馏水溶解并定容至1000 ml，调pH至5. 0~5. 4,用0. 22 μ m滤膜过滤除菌，无菌分装
[0020] (7)底物显色液B :四甲基联苯二胺20mg，无水乙醇10ml，加蒸馏水溶解并定容至 1000 ml ;0. 22 μ m滤膜过滤除菌，无菌分装
[0021] (8)终止液：2. 5ml氢氟酸加到900ml蒸馏水中，定容至1000ml，用0. 22 μπι滤膜 过滤除菌，无菌分装
[0022] (9)标准阳性血清
[0023] (10)标准阴性血清
[0024] 4.本发明检测方法在检测猪流行性腹泻病毒抗体时的操作步骤：
[0025] (1)待检血清用血清稀释液做160倍稀释，每孔加入100 μ L，同时设立标准阴阳性 血清对照，37°C作用lh，弃去血清样品，每孔加入200 μ L洗涤液进行洗涤，共洗涤3次，每次 5min〇
[0026] (2)每孔加入IOOyL HRP标记的鼠抗猪酶标二抗，37°C作用Ih后弃去，每孔加入 200 μ L洗涤液进行洗涤，共洗涤3次，每次5min。
[0027] (3)每孔依次加入50 μ L显色液A和50 μ L显色液B，避光反应10min后每孔加入 50 μ L终止液。
[0028] (4)在酶标仪中读取OD63tllJI，计算S/P值，S/P =(检测样品OD 63Qnm-阴性对照 〇〇630ηιη V(阳性对照 〇〇630ηιη 阴性对照 〇〇630ηιη)。
[0029] (5)结果判定：当S/P值< 0. 026时判为阴性；当S/P值彡0. 043时判为阳性；当 0. 026 < S/P值< 0. 043时判定为可疑，需要重新检测，再次检测S/P值彡0. 026时判为阳 性，S/P值< 0. 026时判为阴性。
[0030] 本发明制备的杂交瘤细胞株N2D1可以在制备猪流行性腹泻病毒抗体的单克隆抗 体中的应用。
[0031] 同时本发明制备的杂交瘤细胞株N2D1分泌的单克隆抗体可以在制备猪流行性腹 泻病毒抗体捕获ELISA试剂盒中的应用。
[0032] 在本发明中，申请人已经公开了本试剂盒中的核心试剂，如杂交瘤细胞株N2D1分 泌的单克隆抗体，重组PEDV N蛋白，以及酶标板和其他试剂如：洗涤液、血清稀释液、封闭 液、辣根过氧化物酶（HRP)标记的鼠抗猪酶标二抗、底物显色液Α、底物显色液Β、终止液、标 准阳性血清和标准阴性血清，按本领域的公知常识组装试剂盒。
[0033] 本发明优点与创新点：
[0034] (1)本发明建立的检测方法灵敏性高，所需要的样品量少，样品处理简单快速，整 个检测过程操作简便快速，成本低廉。
[0035] (2)本发明采用单克隆抗体吸附抗原蛋白的方式建立的，与传统的间接ELISA检 测方法相比能够减少杂质蛋白和无活性蛋白的吸附，降低非特异性反应。检测方法特异 性好，与常见的几种猪病毒性病原如猪圆环病毒（porcine circovirus，简称PCV)、猪繁 殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，简称 PRRSV)、猪传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis of swine，简称 TGEV)、 猪轮状病毒（Porcine rotavirus,简称 PoRV)、猪伪狂犬病病毒（pseudorabies virus, 简称PRV)、口蹄疫病毒（foot and mouth disease virus,简称FMDV)、猪乙型脑炎病毒 (Japanese encephalitis virus,简称 JEV)、猪细小病毒（porcine parvovirus,简称PPV) 等的阳性血清均无交叉反应。
[0036] (3)本发明与PEDV血清中和试验的符合率高，检测结果可靠，适合生产实践中样 品的大规模检测。
[0037] 本发明与相关的两个专利文献（专利申请号201310701145X和专利申请号 2014102242274)报道检测方法的差异分析比较如表1所示：
[0038] 表1本发明与相关专利文献的主要特征和效果的比较
[0039]
【主权项】
1. 一株分泌抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株N2D1，保藏在中国 典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO !C2014174。
2. 权利要求1所述的杂交瘤细胞株N2D1在制备猪流行性腹泻病毒抗体的单克隆抗体 中的应用。
3. 权利要求1中所述的杂交瘤细胞株N2D1分泌的单克隆抗体在制备猪流行性腹泻病 毒抗体捕获ELISA试剂盒中的应用。
4. 一种检测猪流行性腹泻病毒抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含有由 保藏号为CCTCC NO :C2014174的杂交瘤细胞株N2D1分泌的抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单 克隆抗体。
【专利摘要】本发明属于动物免疫学技术领域。具体涉及猪流行性腹泻病毒抗体捕获ELISA检测方法及应用。本发明以抗猪流行性腹泻病(PEDV)N蛋白的单克隆抗体包被酶标板，捕获原核表达的PEDV N蛋白作为抗原建立检测猪血清中猪流行性腹泻病毒抗体的捕获ELISA方法。本发明具有快速简便、特异灵敏等特点，适用于在体外检测猪血清中的猪流行性腹泻病毒抗体。其中分泌抗PEDV N蛋白单抗的杂交瘤细胞株N2D1保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2014174。本发明还公开了在体外猪流行性腹泻病毒抗体检测中的应用。CCTCC NO：C201417420140923
【IPC分类】G01N33-543, C07K16-10, G01N33-577, C12N5-20
【公开号】CN104862285
【申请号】CN201510242555
【发明人】方六荣, 肖少波, 董楠, 王荡, 曾松林, 罗锐
【申请人】华中农业大学
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2015年5月12日