专利名称：抗乙肝病毒寡肽及其衍生物的制作方法
技术领域：
本发明属于天然药物化学成分提取分离鉴定和合成，具体地说是从中药鳖甲中提取分离具有抗乙肝、抗肝纤维化和抗肿瘤的2个活性寡肽，并通过人工合成的方法得到。
背景技术：
鳖甲来源于鳖科动物鳖Trionyx Sinensis Wiegmann的背甲。主产于湖北、湖南、 等地，具有软坚散结，养阴清热，潜阳熄风的功效。现代药理研究表明，其具有抗突变作用、 抗疲劳及免疫调节作用和保肝作用等。现有文献中普遍认为氨基酸为鳖甲的主要成分(龟板、鳖甲炮制前后化学成分的变化.中国药学杂志，1989，M(1)沈 观)，没有明确指出鳖甲的活性成分为寡肽类。经过试验研究，我们确定了鳖甲中主要含有寡肽类成分。现有国内外文献和技术中，除过发明人，没有对鳖甲的寡肽类成分进行提取、分离和鉴定。现有国内外文献和技术中，也没有对序列号为GAGPHGG和GAGPHG的寡肽进行合成，只是报道了大量的肽类合成方法。现有国内外文献和技术中，也没有对序列号为GAGPHGG和GAGPHG的寡肽进行任何形式的活性报道。
发明内容
本发明是以软坚散结中药鳖甲为研究对象，利用各种化学分析分离鉴定技术和方法，对鳖甲寡肽类成分进行系统地分离和鉴定，利用液相肽合成技术对单体寡肽类成分进行全合成，利用鸭乙肝模型、小鼠CCL4急性肝损伤模型、大鼠CCL4肝纤维化模型和S180实体荷瘤鸡小鼠模型，对单体寡肽类成分进行活性测定，以寻找抗乙肝病毒、抗肝纤维化、抗肿瘤的寡肽类先导化合物。为解决该技术问题，本发明研究了下述技术解决方案。1.鳖甲中寡肽类化学成分的鉴识、提取、分离和纯化2.鳖甲中寡肽类化学成分GAGPHGG和GAGPHG的鉴定
3.寡肽 GAGPHGG 和 GAGPHG 的合成4.寡肽GAGPHGG的抗鸭乙肝病毒活性测定5.寡肽GAGPHGG对小鼠急性肝损伤的保护作用6.寡肽GAGPHGG抗大鼠肝纤维化作用7.寡肽GAGPHGG的各类剂型的制备
具体实施例方式以下为本发明化合物的实施例，但这些实施例并不意味着对本发明的限制。实施例1鳖甲中寡肽类化学成分的鉴识、提取、分离和纯化
1.鳖甲肽类化合物的鉴识-双缩脲反应1.1仪器与试药DK-98- I型恒温水浴锅；RE-52A型旋转蒸发器；SHB- III型循环水式多用真空泵； 鳖甲药材购于同仁堂药店，经本人鉴定为鳖科动物鳖Trionyx Sinensisffiegman.的背甲； 阳离子交换树脂和kphadex LH-20均为进口分装，所用化学试剂均为分析纯。1.2方法与结果取鳖甲水提液2mL至试管中，加水稀释至5mL后加入4% NaOH溶液1滴和1 % CuS04溶液1滴，摇勻，随行空白对照，观察显色。鳖甲水提物溶液呈蓝紫色。1. 3 结论鳖甲水提物溶液与双缩脲反应阳性，表明鳖甲中确实有肽类化合物。2.鳖甲中寡肽类化合物的提取、分离和纯化2. 1仪器与试药(同1. 1仪器与试药)2. 2提取、分离和纯化取鳖甲粗粉QO目)200g，加2000ml蒸馏水回流提取3次，每次2小时，提取液浓缩至相对密度为1. 1-1. 13，依次加乙醇至醇浓度为20^^60^^80% ；取80%醇沉部分，水溶，上阳离子交换树脂，PH = 4-5的缓冲液洗脱，收集双缩尿试剂反应阳性部分，合并，冷冻干燥，水溶，继上kphadex LH-20凝胶柱层析，纯水洗脱，收集HPLC检测单一色谱峰流分， 合并，冷冻干燥，分别得到寡肽化合物1 OOmg)和化合物2 (IOmg)。实施例2寡肽GAGPHGG和GAGPHG的鉴定1.材料与仪器 化合物1 (自制)，经HPLC归一化法纯度测定大于98 % ；化合物2 (自制)，经HPLC归一化法纯度测定大于98 % ；Agilent 1100 LC-MSD series trap (双高压溶剂泵，在线真空脱气机，自动进样器，柱温箱，DAD检测器，ESI离子阱质谱检测器，美国安捷伦公司)；氨基酸自动分析仪(ABIPROCISETM492cLC)；三氟乙酸(TFA，美国Sigma公司)，乙腈(色谱纯，fisher公司)，盐酸(分析纯)2.鉴定化合物1 白色无定形粉末。双缩脲反应阳性，易溶于水，不溶于乙酸乙酯、丙酮、 氯仿等非极性溶剂。ESI-MS :574 (M+Na)，552 (M+H)。氨基酸种类的确定6N HCI水解后，硅胶薄层检识(薄层条件正丁醇-冰醋酸-乙醇-水G 1 1 2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以0. 5%茚三酮丙酮溶液，105°C加热至斑点显色清晰)，氨基酸的种类初步定为甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、脯氨酸(P)、组氨酸(H)。氨基酸序列分析，测序结果为GAGPHGG。化合物2 白色无定形粉末。双缩脲反应阳性，易溶于水，不溶于乙酸乙酯、丙酮、 氯仿等非极性溶剂。ESI-MS :517 (M+Na)，495 (M+H)。氨基酸种类的确定6N HCI水解后，硅胶薄层检识(薄层条件正丁醇-冰醋酸-乙醇-水G 1 1 2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以0. 5%茚三酮丙酮溶液，105°C加热至斑点显色清晰)，氨基酸的种类初步定为甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、脯氨酸(P)、组氨酸(H)。氨基酸序列分析，测序结果为GAGPHG。实施例3寡肽GAGPHGG和GAGPHG的合成1.材料与仪器
制备液相色谱仪；冷冻干燥机；RE-52A型旋转蒸发器；SHB- III型循环水式多用真
空泵；Agilent 1100 LC-MSD series trap (双高压溶剂泵，在线真空脱气机，自动进样器，柱温箱，DAD检测器，ESI离子阱质谱检测器，美国安捷伦公司)；氨基酸自动分析仪(ABIPROCISETM492cLC)；WANG树脂(天津南开和成科技有限公司)、S^hadex LH-20、保护氨基酸均为进口分装，化学试剂均为分析纯。2.合成2. 1GAGPHGG 的合成将Fmoc-G-OH(0. Imol)及 HOBT(0. Imol)溶于二氯甲烷(DCM)中，然后加入 DIC (0. Imol)，搅拌 lOmin，再加入已溶胀好的 Wang 树脂(0. 04mol)，加入 DMAP (0. 004mol), 密封反应容器，控温25° -28°，反应10h，停止反应，滤去反应液，用DMF洗剂反应树脂2 次，滤去DMF ；用20% PIP/DMF试剂反应15-20min脱保护后，用DCM洗剂树脂多次；加入试剂1(制备方法0. 4moIFmoc-G-OH及0. 4molH0BT溶于DCM中，然后加入0. Imol DIC, 搅拌lOmin)、0. 004mol DMAP,反应10h，停止反应，滤去反应液，用DMF洗剂反应树脂2 次，滤去 DMF ；参照上述步骤，依次缩合 Rnoc-H-OH、Fmoc-P-OH、Fmoc-G-OH, Fmoc-A-OH, Fmoc-G-OH合成反应完毕，加入裂解液(TFA-硫代苯甲醚_1，2-乙二硫醇-苯甲醚，体积比为205 12.5 7.9 4. 6)，避光搅拌反应汕。过滤，适量TFA洗涤树脂。滤液加入冰冻的无水乙醚中，密封，陈化池。离心收集沉淀，适量冰冻无水乙醚洗涤。沉淀水溶，经 Sephadex LH-20凝胶柱脱盐后，继上制备型HPLC，收集单一色谱峰流分，合并，冷冻干燥，产率 15. 5%。ESI-MS 分析，出现 574 (M+Na)，552 (M+H)峰。HPLC 归一化法纯度分析 99. 0%。2. 2GAGPHG 的合成将Fmoc-G-OH(0. Imol)及 HOBT(0. Imol)溶于二氯甲烷(DCM)中，然后加入 DIC (0. Imol)，搅拌 lOmin，再加入已溶胀好的 Wang 树脂(0. 04mol)，加入 DMAP (0. 004mol), 密封反应容器，控温25° -28°反应10h，停止反应，滤去反应液，用DMF洗剂反应树脂2 次，滤去DMF ；用20% PIP/DMF试剂反应15-20min脱保护后，用DCM洗剂树脂多次；加入试剂1(制备方法0. 4moIFmoc-H-OH及0. 4molH0BT溶于DCM中，然后加入0. Imol DIC, 搅拌10min)、0.004mOl DMAP，反应10h，停止反应，滤去反应液，用DMF洗剂反应树脂2 次，滤去 DMF ；参照上述步骤，依次缩合 Fmoc-P-0H、Fmoc-G-OH, Fmoc-A-OH、Fmoc-G-OH 合成反应完毕，加入裂解液(TFA-硫代苯甲醚-1，2-乙二硫醇-苯甲醚，体积比为 205 12.5 7.9 4. 6)，避光搅拌反应池。过滤，适量TFA洗涤树脂。滤液加入冰冻的无水乙醚中，密封，陈化池。离心收集沉淀，适量冰冻无水乙醚洗涤。沉淀水溶，经 Sephadex LH-20凝胶柱脱盐后，继上制备型HPLC，收集单一色谱峰流分，合并，冷冻干燥，产率 20. 5%。ESI-MS 分析，出现 517 (M+Na)，495 (M+H)峰。HPLC 归一化法纯度分析 99. 0%。实施例4寡肽GAGPHGG抗鸭乙肝病毒活性测定1.材料1. 1动物1日龄北京鸭，购自北京前进种鸭饲养场；1. 2药物七肽GAGPHGG(自制测定大于98% )；阳性药物拉米夫定(葛兰素威康制药公司)。
1.3主要试剂鸭乙型肝炎病毒DNA (DHBV-DNA)强阳性鸭血清(采自上海麻鸭，-70°C保存)；a-32p-dCTP(北京福瑞生物技术工程公司)；缺口翻译药盒(普洛麦格公司)；S印hadex G-50,Ficoll PVP (瑞典 Pharmacia 公司；SDS (Merck 公司)；鱼精 DNA、牛血清白蛋白(中国科学院生物物理研究所)。2.方法2. IDHBV感染1日龄北京鸭，经腿胫iv DHBV-DNA强阳性鸭血清，感染后7d取血， 分离血清，-70°C保存。2. 2药物治疗试验DHBV感染鸭随机分组，七肽给药组分别为0. 5mg/Kg、lmg/Kg皮下注射，每2天一次，给药10d，病毒对照组，以生理盐水代替药物；阳性药物(拉米夫定) 组，Po药物50mg/kg，每天2次，连续10d。给药前、给药5、IOd和停药后3d，分别自鸭腿胫静脉取血，分离血清，-70°C保存待检。2. 3检测方法取上述待检鸭血清，每批同时点膜，测定鸭血清中DHBV-DNA的动态水平。按缺口翻译试剂盒说明书方法，用32p标记DHBV-DNA探针，作鸭血清斑点杂交，放射自显影膜片斑点，测定吸光度(A)值G90nm)，计算血清DHBV-DNA密度，以杂交斑点A值作为标本DHBV-DNA水平值。2. 4药效计算计算每组不同时间点血清DHBV-DNA水平的χ士 s，各组用药前后比较采用配对t检验，计算DHBV-DNA抑制率，比较各组鸭血清DHBV-DNA抑制率的动态变化。 给药组与病毒对照组比较，采用成组t检验。DHBV-DNA抑制率=(给药前A值-给药后A 值)/给药前A值X 100%3 结果DHBV 2DNA感染鸭各组用药前后血清DHBV-DNA水平半定量结果见表1。低剂量组(0. 5mg/kg)给药后与病毒对照组比较，鸭血清DHBV-DNA水平无显著性降低；高剂量组 (lmg/kg)给药后IOd和停药后3d与病毒对照组比较，鸭血清DHBV-DNA抑制率显著提高，停药后鸭血清DHBV-DNA持续降低。表1七肽对DHBV感染鸭血清DHBV-DNA水平的影响(χ士 s，η = 6)
权利要求
1.两个寡肽，无论是L型氨基酸还是D型氨基酸，其特征在于序列号为GAGPHGG和 GAGPHG。
2.根据权利要求1所述寡肽GAGPHGG和GAGPHG，其特征在于从中药鳖甲中分离得到， 或用液相合成方法得到，或用固相合成方法得到。
3.根据权利要求2所述寡肽GAGPHGG和GAGPHG，其特征在于从中药鳖甲中分离得到 鳖甲粗粉(醋)，加6-10倍量水，回流提取1-3次，每次1-2小时，提取液浓缩至相对密度为1. 1-1. 13，依次加乙醇至醇浓度为20% ,60^^80%;取80%醇沉部分，水溶，上阳离子交换树脂，PH = 4-5的缓冲液洗脱，收集双缩尿试剂反应阳性部分，合并，冷冻干燥，水溶，上 Sephadex LH-20凝胶柱层析，纯水洗脱，收集HPLC检测单一色谱峰流分，合并，冷冻干燥， 分别得到寡肽GAGPHGG和GAGPHG。
4.根据权利要求2所述寡肽GAGPHGG和GAGPHG，其特征在于用常规液相方法合成得到。
5.根据权利要求2所述寡肽GAGPHGG和GAGPHG，其特征在于用常规固相方法合成得到。
6.根据权利要求3 5所述方法得到的寡肽GAGPHGG和GAGPHG，可与药学上适用载体混合，制备成各种剂型，用于治疗乙肝的药物。
7.根据权利要求3 5所述方法得到的寡肽GAGPHGG和GAGPHG，可与药学上适用载体混合，制备成各种剂型，用于治疗肝纤维化，改善肝功能的药物。
8.根据权利要求3 5所述方法得到的寡肽GAGPHGG和GAGPHG，可与药学上适用载体混合，制备成各种剂型，用于治疗提高免疫的药物。
9.根据权利要求3 5所述方法得到的寡肽GAGPHGG和GAGPHG，可与药学上适用载体混合，制备成各种剂型，用于治疗抗病毒的药物。
10.根据权利要求3 5所述方法得到的寡肽GAGPHGG和GAGPHG，可与药学上适用载体混合，制备成各种剂型，用于治疗抗肿瘤的药物。
全文摘要
本发明是从中药鳖甲中分离得到2个寡肽类成分，其序列号为GAGPHGG、GAGPHG，并合成之。作为药物，其在抗乙肝病毒、抗肝纤维化、抗肿瘤和提高免疫方面具有广泛的开发前景。
文档编号A61P31/12GK102268066SQ201010187949
公开日2011年12月7日 申请日期2010年6月1日 优先权日2010年6月1日
发明者李强, 雷海民 申请人:雷海民