一种乙肝病毒前c-c基因疫苗的制备及应用的制作方法

专利名称：一种乙肝病毒前c-c基因疫苗的制备及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种乙肝病毒前C (Pre-C) -C基因疫苗及其应用，更涉及一种人工 突变型乙肝病毒前C (Pre-C) -C基因疫苗及其应用，属于HBVDNA疫苗的设计制造及 免疫效果检测的生物学领域。
背景技术：
慢性乙型肝炎严重危害人类健康，目前尚无特效治疗手段。乙肝病毒(HBV)感 染人体后发生慢性化的主要原因是被感染者缺乏有效的特异性细胞免疫应答，不能 清除体内病毒。由于DNA疫苗在诱导机体特异性细胞免疫方面具有独特优势，已作 为针对慢性乙肝具有潜力的免疫治疗手段被广泛研究。目前乙肝DNA疫苗研究的焦 点在于如何诱导足够强的特异性细胞免疫，以达到抑制或消灭病毒、治疗乙肝的目 的。
选择合适的目的基因和载体体外连接构建重组质粒，是研究治疗型HBV DNA疫苗 的关键基础步骤。对所选目的基因的要求是能够诱导机体产生较强的针对HBV抗 原的特异性细胞免疫反应。HBV的基因组是一环状的部分双螺旋结构，长约3.2kb。 基因组中已确定的开放读框有4个，分别编码病毒的核壳(C)和包膜(S)蛋白， 病毒DNA聚合酶及X蛋白。目前学者们公认，S基因和C基因是HBV DNA疫苗常用的备 选基因。而两者相比较而言，S基因疫苗多应用于预防，前c-c基因理论上则可能产 生较S基因更好的治疗效果。因为HBcAg (病毒核壳的组成部分P21c)存在于细胞内， 是最强的人类T细胞抗原，可以诱导出较强的MHC-I类限制性细胞毒T淋巴细胞(CTL) 反应。
ENHII是位于乙肝病毒基因组中前C-C区上游约200bp处的增强子，长约200bp， 序列高度保守，能够顺式作用增强乙肝病毒蛋白的表达。作用机理可能通过与某些 特定细胞因子结合的方式，已鉴定出有转式激活作用的多种细胞因子(C/EBP、 AP1、 HNF1等)，能够与ENH相互作用参与调节HBVDNA的转录，并表现出肝细胞特异性。
本发明针对DNA疫苗的诸多特性和优点，采用现代分子生物学技术和手段对 其进行了进一步的研究和改进。

发明内容
本发明的第一个目的在于公开一种以乙肝病毒前C (Pre-C) -C基因和自身复制 调控元件增强子II (ENHII)为目的基因构建的重组HBV DNA疫苗(VEC)。本发明的第二个目的在于公开一种以包含2个点突变(AA151+AA154)的乙肝病 毒前C (Pre-C) -C基因和自身复制调控元件增强子II (ENHII)为目的基因构建的 重组HBV DNA疫苗(VE2)。
本发明的第三个目的在于公开 一 种以包含4个点突变 (AA151+AA154+AA164+AA167)的乙肝病毒前C (Pre-C) -C基因和自身复制调控元 件增强子II (ENHII)为目的基因构建的重组HBV DNA疫苗(VE4)
本发明的第四个目的在于提供一种上述重组HBV DNA疫苗用于乙型肝炎的预防 和治疗。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的
一种乙肝病毒前C一C基因疫苗(VEC)，其包括插入核苷酸序列的乙肝病毒前C (Pre-C)-C基因和自身复制调控元件增强子II (E画)'其序列如序列表中SEQ ID No. l所示，该目的基因的真核细胞表达载体均为VR1012。
一种构建乙肝病毒前C一C基因疫苗(VEC)的方法，其步骤如下首先以血清 中的HBV DNA为模板，用套式PCR扩增出乙肝病毒ENHII (含cp)、前C/C基因，连入 T-easy载体，再通过双酶切及再连接将目的基因插入真核表达载体VR1012，克隆筛 选得到构建好的VEC质粒。
一种人工突变型乙肝病毒前C—C基因疫苗(VE2)，其采用单引物二次PCR法对 乙肝疫苗(VEC)重组质粒中的蛋白酶切位点151+154进行点突变。
一种人工突变型乙肝病毒前C一C基因疫苗(VE4)，其采用单引物二次PCR法对 乙肝疫苗(VEC)重组质粒中的蛋白酶切位点151+154+164+167进行点突变。
所述的蛋白酶为Furin蛋白酶。
一种构建人工突变型乙肝病毒前C一C基因疫苗(VE2)的方法，其步骤如下 首先合成2对引入点突变的引物，以VEC质粒DNA为模板，以单条引入突变位点的寡 核苷酸为引物，高保真聚合酶引导DNA合成，经PCR扩增后，再加入另一条互补引物 PCR扩增，然后用DpnI酶切除未突变的甲基化模板，转化细菌后克隆筛选得到突变 的基因；依次如上法实现2处点突变，形成改造后的突变型乙肝病毒前C-C基因疫苗 VE2 (151+154点突变)表达生成胞内型分子量P22的HBeAg前体蛋白。
一种构建人工突变型乙肝病毒前C一C基因疫苗(VE4)的方法，其步骤如下 首先合成4对引入点突变的引物，以变性的VEC质粒DNA为模板，以单条引入突变的 寡核苷酸为引物，高保真聚合酶引导DNA合成，经PCR扩增后，再加入另一条互补引 物PCR扩增，然后用DpnI酶切除未突变的甲基化模板，转化细菌后克隆筛选得到突 变的基因；依次如上法实现实现4处点突变，形成改造后的突变型乙肝病毒前C-C基 因疫苗VE4 (151+154+164+167点突变)，分别表达生成胞内型分子量P20的冊eAg前体蛋白。
所述的单引物二次PCR法是点突变的单引物二次PCR法，是改良的实现环状质粒 点突变的方法，该方法的特征为将PCR分为两步，先加入正向单引物扩增，引物 只能与一条反向模板链结合，生成正向的环状变异互补链，退火后，引物仍然只能
与反向模板链结合，PCR扩增效率不高，但能够得到少量确切的变异链。第二轮PCR
中，加入反向单引物，此引物可能与正向变异链结合，也可能与正向原模板链、正
向引物结合，但由于引物序列与正向变异链完全互补，正向引物又在第一轮PCR中
消耗一部分，故引物与正向变异链结合机率较高。
基于此，本发明人设计构建了含乙肝病毒前C-C基因和ENHII (包括cp)的重组 朋V DNA疫苗(VEC)，载体选用质粒VR1012，为美国FDA已批准用于人体基因治疗的 真核细胞表达载体，我国FDA近期也批准其作为HIV DNA疫苗载体用于人体，其具有 多克隆位点包括Pst I和BamH I等，含有CMV启动子，卡那霉素抗性基因等，为增强重组HBV DNA疫苗VEC的免疫效果，我们又在此基础上对VEC进行了点突变，构建了突变型HBV 前C-C /ENHII基因疫苗。其理论依据如下HBeAg与HBcAg具有共线性，是HBcAg的 分泌型。冊eAg与HBcAg共用前C/C基因指导合成，前C/C基因包含2个起始密码子， HBeAg前体是从第l个起始密码子起翻译出含有212个AA、分子量25kDa (P25)的前 C蛋白，其氮端的长19个氨基酸(AA—28^^ —10)的多肽为信号肽，引导P25转运入 内质网之后被切除，此时HBeAg前体裂解为中间产物P22蛋白(AA195)。 P22在细胞 腔膜系统中被Furin蛋白水解酶作用，于第AA167位切除羧基端的28个残基成为中间 产物P20，再于AA154位切除羧基残基产生P18，即形成成熟的HBeAg进入细胞的分泌 途径。与HBcAg相比，成熟的HBeAg (分泌型)在氨基端多10AA,羧基端少30余个 AA，约有70%共同序列。
发明人研究表明分泌型HBeAg (P18)诱导免疫耐受，而其胞内前体(P20、 P22) 则有可能诱导较HBcAg更强的细胞免疫HBeAg与HBcAg在T细胞识别水平上有高度交 叉反应性，胞内型HBeAg前体(P20、 P22)与HBcAg同源性更强，既可以通过MHC I 类抗原路径被CD8+CTL细胞识别，也可少量分泌通过MHC II类抗原路径被CD4+T细胞 识别，HBcAg则不能进入II类抗原路径。因此，胞内型HBeAg可通过两个途径被 HBeAg/HBcAg特异性T细胞发现，加强针对HBV的特异性细胞免疫。
如图l， 2所示，作用于朋eAg的蛋白水解酶，属于Furin家族成员，这类酶 的共同点是均位于TGN系统，作用于穿膜前蛋白。它的特异性识别序列为 RXXR， RXRR， RXRXXR, RXXXRR，其中R代表精氨酸残基。在HBeAg的氨基酸序列中， 氨基酸151， 154, 164， 167位均有Furin蛋白的作用位点。164/167位的切割使分 子量P22的HBeAg前体变为P20，再经151/154部位的切割使分子量P20变为P18 ，也可直接经P22切割形成P18。
本发明构建重组乙肝病毒前C-C基因疫苗VEC后，在其编码151/154、 164/167 位精氨酸的核酸位置上依次引入点突变，151CGA —GGA、 154AGG—GGG、 164CGC— GGC、 167 AGG—GGG，使该四点分别编码甘氨酸，从而使Furin蛋白酶水解位点失 活。改造后的突变型乙肝病毒前C-C基因疫苗VE2 (151+154点突变)、VE4 (151+154+164+167点突变)分别表达生成胞内型分子量P22、 P20的HBeAg前体蛋 白。
为了克服传统环状诱变法引物互相结合问题，我们将传统环状诱变法的一次 PCR改良为两次，即先加入正向单引物扩增，引物只能与一条反向模板链结合，生 成正向的环状变异互补链，第二轮PCR中，加入反向单引物，此引物可能与正向变 异链结合，也可能与正向原模板链、正向引物结合，但由于引物序列与正向变异链 完全互补，正向引物又在第一轮PCR中消耗一部分，故引物与正向变异链结合几率 较高。虽然单引物二次PCR法扩增效率理论上偏低，但通过转化细菌及克隆筛选后 总能得到变异成功的质粒，变异成功率明显提高，为质粒点突变提供了确切高效的 方法。当然由于本实验例数尚少，该法的突变效率有待扩大例数加以论证，并需在 更广范围的质粒点突变中运用得以验证，但仅就目前结果看，不失为一种值得推广 的高效便捷的实验方法。
经过上述实验，我们得到了 ENHlI-PreOC基因片段构建的HBV前C/C重组质 粒及其变异体，为进一步研究蛋白的功能和治疗性HBV DNA的效果打下了基础。
将经以上步骤获得的乙肝病毒前C-C基因疫苗及其2种突变体VE2、 VE4分别转染 入H印G2细胞，ELISA法检测细胞裂解液、细胞培养上清液，结果均有目的蛋白表达。 细胞裂解液的HBeAg含量VE4、 VE2高于VEC，上清中则反之，VEC细胞裂解液的HBeAg 含量低于上清，VE2、 VE4细胞裂解液的HBeAg含量高于上清；酶免疫细胞染色定位 见目的蛋白主要为胞浆内表达；蛋白免疫印记检测表达产物的分子量，结果表明 VEC、 VE2、 VE4的表达产物分别为P18、 P20、 P22左右预期蛋白。
分别用VEC、 VE2、 VE4于0、 7、 21天肌注方式免疫BALB/C小鼠，同时设VEC、 VE2、 VE4分别联合使用插入千扰素Y基因的VR1012质粒(VMY)组免疫动物组，ELISA法 检测小鼠抗HBc、抗朋elgG，发现免疫接种后第14天即可检测到抗体，第28天滴度 更高，VE2、 VE4组抗HBe水平高于VEC组，抗HBc水平无显著性差异。免疫结束后(第 28天)取小鼠脾细胞用ELISpot方法和CTL杀伤试验检测特异性细胞免疫功能，证实 3种质粒均能引发特异性细胞免疫反应，VE4、 VE2强于VEC;突变型强于野生型。联 用VMy免疫后能使VEC、 VE2、 VE4特异性细胞免疫反应增强。
本发明的优点是本发明在构建突变型疫苗的过程中，我们改良了实验方法，分次序贯加入引物，改良为二次PCR方法，通过转化细菌及克隆筛选后总能得到变 异成功的质粒，效果确切，为质粒点突变提供了确切高效的方法，就本研究结果看， 不失为一种值得推广的高效便捷的实验方法。实验研究证实，采用该方法研制的HBV EHNII-前C-C基因突变疫苗经点突变成功改建为VE2、 VE4，转染真核细胞后表达预 期分子量的P20、 P22蛋白，为治疗型乙肝疫苗的研制和改进提供了依据，奠定了基 础。VEC、 VE2、 VE4以肌注方式免疫Balb/c小鼠后，血清中均能够产生抗HBc和抗HBe 抗体，且VE4组抗HBe水平高于抗HBc，三者引发的抗HBc水平相当。细胞免疫分析表 明，VE4免疫组使小鼠脾淋巴细胞中Y干扰素产生细胞数增多更明显于VE2、 VEC组； 特异性CTL杀伤效应检测提示VE4、 VE2略强于VEC组，有统计学意义。上述结果表明 我们改建的VE2、 VE4在诱导小鼠特异性细胞和体液免疫方面确实存在优势。
联用VMy对三组抗HBc和抗HBe产生的早晚和滴度无影响，但ELISpot检测联用VM Y免疫后各组SFC数均升高明显；CTL杀伤效应均增强。说明VMy作为基因佐剂确实 能够使基因疫苗所引起的特异性细胞免疫增强。


图1. HBV前C-C基因合成HBcAg、 HBeAg过程 图2. HBV前C-C蛋白合成剪切示意图 图3.扩增EHNI1-PreC-C引物位置示意图 图4.套式PCR产物琼脂糖凝胶电泳图
图5.pGEM-T Easy/PCR产物重组质粒酶切后琼脂糖凝胶电泳分析图
pGEM-T Easy/PCR产物重组质粒，经Pst I 、 BamH I双酶切后琼脂糖凝胶电泳 分析。左侧为DNA Marker,右侧为T Easy/PCR产物重组质粒酶切，上方条带为载 体pGEM-T Easy, 2997bp，下方条带为HBV ENHII-PreC-C片断。
图6.重组质粒VEC酶切后琼脂糖凝胶电泳分析
图7.模板及4个变异质粒琼脂糖凝胶电泳结果
其中图中，M: Marker; 1:未变异前模板质粒VEC; 2:变异一个位点的VEl; 3: 变异两个位点的VE2; 4:变异三个位点的VE3; 5:变异四个位点的VE4。
M: Marker; 1:未变异前模板质粒VEC; 2:变异一个位点的VE1; 3:变异两个位
点的VE2; 4:变异三个位点的VE3; 5:变异四个位点的VE4。 图8. VEC原基因及4个点突变质粒部分基因测序图 图9.VEC、 VE2、 VE4组细胞裂解液及培养液中HBeAg表达分布差别 图IO. VEC、 VE2、 VE4转染H印G2细胞后表达蛋白免疫印记检测结果(ECL法)
显微镜400 X图11. VEC、 VE2、 VE4、 VR1012载体转染H印G2细胞后表达产物酶免疫细胞染
色
图12各免疫组不同淋巴细胞稀释度的靶细胞特异性裂解百分比，横坐标l, 2， 3， 4 各代表淋巴细胞与靶细胞比值100， 33， 10， 3. 3
图13. ELISpot自动分析系统图(显微镜100X)，各组免疫后小鼠脾淋巴细胞 ELISpot检测斑点形成数
以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步阐述。
具体实施例方式
菌株、细胞、试剂及实验器材
限制性核酸内切酶Pst I及BamHPromage 公司
Taq酶，T4 DNA连接酶New England Biolab
pGEM-T Easy试剂盒Promage 公司
X-gal鼎国公司
IPTG鼎国公司
限制性核酸内切酶DpnlPromage 公司
高保真DNA聚合酶Pfu美国Stratagene公司
质粒提取试剂盒Promage 公司
DNA纯化试剂盒Promage 公司
隨Marker (1Kb Plus)Promage 公司
质粒大量提取试剂盒Promage 公司
卡那霉素鼎国生物公司
感受态DH5 a菌博大泰克生物公司
转化试剂A博大泰克生物公司
其余常用生化试剂(国产分析纯)上海华美生物公司等
HepG2细胞病毒研究室保存
DMEM北京天润善达公司
转染试剂一sofast北京天来生物公司
6孔细胞培养板美国Becton Dickinson Labware公司
24孔细胞培养板美国Becton Dickinson Labware公司
10ml细胞培养瓶北京
检测HBeAg ELISA试剂盒北京科卫试剂厂硝酸纤维膜
4XSDS蛋白上样液
预染蛋白Marker
ECL化学发光检测试剂盒
兔多克隆抗HBc
辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG 鼠单克隆抗HBc DAB显色试剂盒 SDS-PAGE试剂 15%分离胶(5ml) H20 l.Oml， 2%亚甲双 0.22ml, 20%SDS 25 ul,
TEMED 7. 5 y 1
5%积层胶(2.5ml) H20 1.69ml, 2%亚甲双 0.175ml, 20%SDS 12.5yl，
TEMED 6. 25 y 1
电泳缓冲液(5X) Tris碱 15. lg,
腦SDS 50ml, 免疫蛋白印迹转移缓冲液 Tris碱 5. 8g,
SDS 0.37ml，
H20 补至1000ml
免疫蛋白印迹检测试剂
10XTris缓冲盐(TBS) 1L NaCl 80g, 封闭缓冲液(150ml) H20 135ml，
PAH公司 Promage公司 New England 生物公司 Pierce 公司 北京中杉金桥生物公司 鼎国生物公司 美国 Santa cruze公司 北京中杉金桥生物公司
40%丙烯凝酰溶液 1 M Tris. CI (Ph8. 7) 10%过硫酸铵溶液
40%丙烯酰凝溶液 1 M Tris. CI (Ph6. 8) 10%过硫酸铵溶液
甘氨酸 H20
甘氨酸 甲醇
Tris碱 H20
脱脂奶粉
1. 875ml 1.875ml 30 y 1
0. 337ml 0. 312ml 12. 5y 1
94g
补至1000ml
2.9g 200ml
24. 2g
加至1L，盐酸调PH至7.6 7. 5g100%Tween-20
脱脂奶粉
10X TBS 15ml, 100%Tween-20
洗液(TBS/T) (200ml) 10 X TBS 20ml， H20 加至200ml
一抗稀释缓冲液(20ml) IX TBS 20ml, 100%Tween-20 20 细胞酶免疫组化试剂
4%多聚甲醛(1XPBS配制)， 3%TritonX-100 (IXPBS配制) 检测抗HBc ELISA试剂盒 检测抗HBe ELISA试剂盒 ELISpot试剂盒
Cytotox96非放射性细胞杀伤检测试剂盒 96孔细胞培养板 R-3无酚红1640培养液 Ficoll-Quates液 P815细胞 佛波脂(PMA)
其余常用生化试剂为国产分析纯
0. 15ml
200 u 1
lg
主要仪器
MJMini PCR扩增仪 LG15-W高速微量离心机 低温高速离心机 PH仪
D Y Y - III型稳压稳流电泳仪 THZ-C电热恒温摇床 超净工作台
SmartSpec Plus分光光度计 C02恒温孵箱
BHC-1360 IIA2型超净工作台
DYC型SDS — PAGE电泳及转移系统
3% HA
北京科卫试剂厂 北京科卫试剂厂 法国DiaClone公司 Promega公司 Millipore公司 北京天润善达公司 Promega公司 我院免疫研究室保存 美国Sigma-Aldric公司 上海华美公司等
美国Bio-Rad公司 北京
日本HITACHI公司 hlsnna公司 北京六一仪器厂 江苏太仓仪器厂 北京哈东联设备厂 美国Bio-Rad公司 德国Hsraeus公司 北京哈东联仪器公司 北京六一仪器厂SmartSpec Plus分光光度计
美国BIORAD公司
MS型酶标检测仪
TS- I型脱色摇床
江苏海门其林贝尔公司
LD5-2A离心机
北京通用离心机厂
MS酶标检测仪
芬兰LABSYSTEMS公司
C02恒温孵箱
德国Hereieus公司
超净工作台
北京哈东联
ELISpot酶联斑点分析仪
北京赛智创业公司
实施例l.乙肝病毒前C一C基因疫苗的构建
1.套式PCR扩增ENHII -PreC-C基因
选择病毒性肝炎患者的血液，乙型慢性(中度)，HBVDNA、 HBeAg阳性。提取 血清HBVDNA后测序，分型为adr亚型。慢性乙型肝炎患者肝素抗凝血3ml， 2000rpm 离心3min，分离血清。使用QIAGEN试剂盒，提取HBV DNA步骤如下
①血清200 n 1与蛋白酶20 u 1混匀，②加Buffer AL 200 y 1,混匀，③加无水酒 精200til，混匀，56。C孵育lOmin， lOOOOrpra离心lmin，过柱，弃离心液， 加 BufferAWl 500 u 1， 10000rpm离心lmin冲洗，弃离心液， 加BufferAW2 500" 1， 14000rpm离心5min冲洗，弃离心液，⑦14000rpm再次离心lmin,弃离心液，⑧加 无菌去离子水200yl， 12000rpm离心，洗脱HBV DNA。
所得HBVDNA测序，确定为at/r亚型，如图3所示，作为模板，分别以c5out、 c3out为引物，5'端外套引物C5out5' TTACGCGGTCTCCCCGTCTG 3' 、 3'端外套引 物C3out3' AAAGTTTCCCACCTTATGAG 5';采用PCR方法扩增模板lul、 3' 、 5 '端引物(25y M)各1 u 1、 5mMdNTP2u 1、 10XPCR Buffer 5n 1、 T即酶1 y 1、 H20 39ul， 94。C变性3min—94。C变性lmin， 52。C退火lmin， 72。C延伸lrain，共35个 循环一72。C延伸10min。以扩增产物为模板(取5u 1)，再以5'端内套引物c5in5 'AAACTGCAGACCTCTGCACGTCGCATG 3 '、 3 ' 端内套引物 c3in3 ' CGCGGATCCTCCAAGGGATACTAACAT 5'为引物，采用前述PCR方法扩增，扩增产物即 HBV ENHII-PreC-C基因。如图4所示，经提取CHB患者血清HBVDNA并套式PCR扩增， 获得PCR产物HBV ENH II -PreOC片断，经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定大小800 900bp，符合 预期长度，图4左侧为DNA Marker,右侧为HBV ENHII-PreC-C片断。 2.重组质粒的构建
(1)构建pGEM-T Easy/PCR产物重组质粒PCR产物3 u 1， pGEM-T Easy载体1 u 1， 2XBuffer 5iil，T4DNA连接酶lul，混匀后室温(2(TC-25°C，下述室温均为此温度)放置lh， 4'C过夜。
(2) pGEM-T Easy/PCR产物重组质粒转化感受态DH5 a菌-60。C保存，取出后置 冰浴中备用。上述连接产物共10ul加入100ul感受态细菌中(同时设阳性及阴 性对照)轻轻混匀，冰浴20min，室温10min，加LB 400 " 1, 37°C 250rpra摇床30min， 取100y 1转化菌涂于含氨苄青霉素(25u g/ml) 、 X-gal和工PTG的固体LB培养板， 待表面液体晾干后，将培养板倒置于37'C孵箱中培养过夜(12-18h)。
(3) pGEM-T Easy/PCR产物重组质粒克隆筛选及扩增提取挑取培养板中阳性菌 落，置于3ml含氨苄青霉素(25u g/ml)的LB中，37°C 250rpm摇床过夜(12-18h)。 取1.5ml菌液提取质粒，使用Promage质粒提取试剂盒，按说明书操作，步骤如下
① 12000rpm离心5min，弃上清。
② 加Resuspension Solution 250 ul，混匀重悬菌体。
③ 力口 Cell Lysis Solution 250 u 1，混勾lmin，力卩Alkaline Protezse Solution 10 y 1，混匀lmin。
④ 力卩Neutrilization Solution 350 ul，混匀lmin。
⑤ 13000rpm离心10min,取上清过柱。
⑥ 13000rpm离心柱lmin，弃离心液。
⑦ 加Wash Solution 750ii 1， 13000rpm离心，弃离心液，再加Wash Solution 250 yl， 13000rpm离心，弃离心液。
⑧ 加无菌去离子水100 H 1， 13000rpm离心lmin，洗脱质粒。
(4) pGEM-T Easy/PCR产物重组质粒酶切，回收目的片断用T7、 SP6引物测序
pGEM-T Easy/PCR产物重组质粒，确认连接片断为所需目的基因后，Pst I 、 BamH I双酶切Pst I 2u 1+BamH I 2u 1+BSA In 1+质粒30" 1+ 10XBuffer 10u 1+H20 55 U 1， 37。C水浴2h。如图5所示，pGEM-T Easy/PCR产物重组质粒，经Pst I 、 BamH I 双酶切后琼脂糖凝胶电泳分析，左侧为DNA Marker,右侧为T Easy/PCR产物重组质 粒酶切，上方条带为载体pGEM-T Easy，，下方条带为HBV ENHII-PreC-C片断，琼 脂糖凝胶电泳分析确认酶切片断大小为2997bp，使用DNA纯化试剂盒纯化回收，步 骤如下
① 酶切产物100u 1加入琼脂糖凝胶加样孔中。
② 电压80V，电泳15min。
③ 紫外线灯下切胶，取酶切片断，称重。
加等量(mg/ml)Membrane Binding Solution, 6Q。C水浴10min。⑤ 12000rpm离心，过柱，弃离心液。
⑥ 力口 700 u 1Memb頭e Wash Solution, 12000rpm离心lmin，弃离心液。
⑦ 力口 500 u 1Membrane Wash Solution, 14000rpm离心3min，弃离心液。
⑧ 加无菌去离子水50 ii 1, 12000rpm离心lmin,洗脱目的片段DNA。 (5)构建重组质粒VEC:
Pst I 、 BamHl双酶切载体VR1012，连接步骤(4)中双酶切后的目的片段和VR1012 载体T4DNA连接酶lul， 10XBuffer lu 1，酶切片断+酶切载体共8u 1 (根据电 泳结果评估载体与酶切片断浓度，按片断载体^3:1比例加样)。连接产物lOn 1， 按前述方法转染感受态DH5a菌，涂于含卡那霉素的半固体LB培养板上，12-18h 后挑取阳性菌落。按前述方法提取质粒，如图6所示，载体VR1012插入基因片段为 HBV ENHII-PreC-C,经限制性核酸内切酶Pst I 、 BamH I双切后，琼脂糖凝胶电泳分析 确认酶切片断大小为4913bp，证实连接片断为所需目的基因，左侧为DNA Marker; 右侧为重组质粒VEC酶切，上方条带为载体VR1012，，下方条带为HBV ENHII -PreC-C片断。电泳分析确认酶切大小正确后测序，插入片段HBVENHII-PreC-C其核 苷酸与氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示，其中，SEQ ID No. 2 是由核苷酸SEQ ID No. 1得到的蛋白质序列。 实施例2.突变型乙肝病毒前C一C基因疫苗的构建 单引物二次PCR法扩增依次实现VEC质粒的4个核苷酸位点突变
1. 合成4对引入点突变的引物151CGA —GGA、 154AGG—GGG、 164CGC—GGC、 167 AGG—GGG,突变点位于引物中心。
第一对引物
151正向5' ACTACTGTTGTTAGA^GACGAGGCAGGTCCC3'， 151反向3' TGATGACAACAATCT^CTGCTCCGTCCAGGG5'; 第二对引物
154正向5' GTTAGAGGACGAGGC^GGTCCCCTGAAGAA3' 154反向3' CAATCTCCTGCTCCG^CCAGGGGATCTTCTT5'; 第三对引物
164正向5' AGAACTCCCTCGCCT^GCAGACGAAGGTCTC3' 164反向3' TCTTGAGGGAGCGGA^CGTCTGCTTCCAGAG5'; 第四对引物
167正向5' TCGCCTGGCAGACGA^GGTCTCAATCGCCGC3' 167反向3' AGCGGACCGTCTGCT^XAGAGTTAGCGGCG5' (斜体加粗为引入的变异点)2. 第一轮PCR:以VEC质粒为模板，加入5'端引物151正，PCR法扩增，反应 体积和条件如下模板(VECO. 1 n g/ u 1 ) 2 n 1 、引物151正(25 y M) 2 u 1 、d證(5mM)2 ii 1 、10 X PCR Buffer2.5 u 1 、 Pfu 酶 ltxl、 H2016.5ul，反应条件94。C变性lmin—94。C变性lmin， 52'C退火lmin， 72。C延伸12min，共20个循环，72。C延伸10min。
3. 第二轮PCR:以步骤(1)中PCR反应产物为模板，加入3'端引物151反， PCR法扩增，反应体积和条件如下模板2y 1、引物151反(25uM) 2 u 1、 dNTP(5mM) 2ul、 10XPCR Buffer2. 5ul、 Pfu酶lul、 H20 16. 5ul，反应条件与第一轮PCR 相同。
4. PCR产物选择性酶切第二轮PCR产物25^1加入Dpnl酶2yl， 10X Buffer2. 5ii 1， 37。C水浴2h。
5. 151点突变质粒的转化-6(TC冻存的DH5a菌100 y 1置冰浴融化，将步骤(2) 中PCR产物10 u 1与试剂A20 u 1 、双蒸去离子水70 ii 1共同加入到感受态细菌中， 轻轻混匀，冰浴20min，室温10min，力口LB 400ul， 37。C摇床200 rpm复苏30min， 取转化菌液300ul涂于含卡那霉素(50ug/ml)的固体LB培养板，待表面液体晾 干后倒置于37X:孵箱中过夜。
6. 变异151质粒(VE1)扩增和提取挑取培养板中的阳性单菌落，置于5ml含卡 那霉素(5 Oixg/ml)的LB中，37。C200rpnn摇床过夜(12-18h)。取1. 5ml菌液提 取质粒，使用Promage质粒提取试剂盒，按说明书操作。取所提质粒与模板质粒电 泳鉴定，条带位置一致即测序。
7. 其它质粒点突变如上述步骤得到变异151质粒(VE1)后，在突变质粒的基础 上再用另外3对引物依次实现另外3个核苷酸位点突变，分别为变异151、 154质 粒(VE2)，变异151、 154、 164质粒(VE3)、变异151、 154、 164、 167质粒(VE4)。
8. 大量提取质粒使用QIAGEN公司大量提取质粒试剂盒提取VEC、 VE2、 VE4 (测序 确定突变成功)质粒，步骤如下
(1) 挑取阳性菌落，放入含卡那霉素(50yg/ml)的LB培养液5ml中，37'C摇 床250rpm摇振10h。
(2) 将上述菌液2ml转入含卡那霉素(50ug/ral)的LB培养液500ml中，37°C 摇床250rpm摇振16h。
(3) 取出500ml菌液，5000rpm 4。C离心15rain，弃上清。
(4) 加Buffer PI 50ml重悬菌液，吹打混匀后加入Buffer P2 50ml，颠倒4下 混匀，室温放置5 min，再加Buffer P3 50ral，颠倒4下混匀，冰浴20min。
(5) 16000rpm4。C离心30min，上清移入另离心管，再16000rpm 4'C离心20min，将上清过柱(BufferQBT 35ml预处理)。
(6) BufferQW 200ml过柱，清洗。
(7) BufferQF 35ml过柱，洗脱DNA。
(8) 加入异丙醇24. 5ml，混匀，14000rpm 4。C离心30min，弃上清。
(9) 加70X酒精7ml，混悬后14000rpm室温离心15min，弃上清。
(10) 加500 ul去离子水溶解DNA，精密分光光度仪测浓度及260/280nm比值。 如图7所示，通过模板及4个变异质粒琼脂糖凝胶电泳结果可知，4个变异后质
粒与模板条带位置基本一致。如图8所示，从VEC原基因及4个点突变质粒部分基因 测序图可知，VE1、 VE2、 VE3、 VE4四个质粒的拟变异位点均如预期变异成功，而其他氨 基酸无变异。图8中标注的"i"表示变异位点。突变后的插入片段HBV ENHH-PreC-C其 核苷酸与氨基酸序列如序列表中SEQIDNo. 3和SEQIDNo. 4所示，其中，SEQIDNo.4 是由核苷酸SEQ ID No.3得到的蛋白质序列，其突变位点在序列表中使用斜体加粗 大写字体标出。
实施例3乙肝病毒前C一C基因疫苗及其突变体的真核细胞转染
1. 真核细胞转染
传代H印G2细胞于5块六孔培养板，每板分别用VEC、 VE2、 VE4、 VR1012空载 体(阴性对照)转染各一孔，另2孔作空白对照；传代H印G2细胞于一块24孔细 胞培养板，分别用VEC、 VE2、 VE4、 VR1012空载体(阴性对照)转染各4孔，剩余 8孔为空白对照。每组检测数值的均值作为该组的检测数据。
H印G2细胞复苏，2次传代后以1CT细胞/L的浓度加入细胞培养瓶，10ml/瓶， 严格按转染试剂说明书操作
(1) 无菌条件下10 y g质粒溶于600 u 1无血清及抗生素的DMEM中，10 y 1 sofast转 染试剂溶于600 ul无血清及抗生素的DMEM中。
(2) 将质粒复合物滴加到转染试剂复合物中，边滴加边混匀。
(3) 室温放置20rain后，将DNA-转染试剂复合物滴加到细胞培养瓶中。
(4) 37'CC02孵箱中培养48h后取出细胞，培养液移入透析袋中，用PEG20000浓縮至 原体积的1/50。细胞至于冰上，加少量PBS后用细胞刮收集细胞，离心1000gX3min 后弃上清，加PBS200y l混悬细胞，冻融3次后取上清(细胞裂解液)。
2. 细胞裂解液、细胞培养液检测HBeAg: 使用ELISA试剂盒，双抗体夹心原理，按试剂盒步骤操作如下
(1) 常规方法HBeAb包被NEUNC板。
(2) 细胞裂解液或培养液(浓縮后)50y 1，阴性对照、阳性对照、空白对照各50u 1， 每一标本加2孔。(3) 加酶抗体复合物50y 1，混匀，37。C孵箱放置30min。
(4) 洗涤液300 u 1/孔洗4次，拍干。
(5) 加显色剂A50y 1,显色剂B50iU,混匀，37'C孵箱放置10min。
(6) 加终止液50 u 1。
(7) 450 A m波长分光光度计测OD值。2孔均值为该标本检测值。 ELISA法检测转染后细胞裂解液及浓缩培养液，VEC、 VE2、 VE4转染组均有HBeAg
阳性表达，而VR1012载体对照转染组及空白对照组HBeAg阴性。酶标仪测得反应表 达强度的光密度如表1所示。
表1. ELISA法检测细胞裂解液及培养液HBeAg值
转染质粒细胞裂解液HBeAg (x士oO培养液HBeAg (x±
空白0. 182±0. 190. 148±0. 028
VR10120. 196±0. 480. 192±0. 045
VEC2. 202±0. 1222. 582±0. 135
VE22. 806±0. 211. 846±0. 164
VE42. 978±0. 181. 510±0. 281
方差分析表明细胞裂解液中VEC、 VE2、 VE4组表达量明显高于载体对照及空白 对照，其中VE4组表达量最高，VE2稍低，VEC组表达量最低，其中VEC与VE4， VEC 与VE2组存在显著性差异(尸<0.01)， VE2与VE4组无显著性差异(尸〉0.05)。培 养液中VEC、 VE2、 VE4组含量也明显高于载体对照及空白对照，其中VEC组含量最 高，VE2稍低，VE4组最低，其中VEC与VE4组、VEC与VE2组均存在显著性差异(尸 <0. 05=， VE2与VE4组无显著性差异(尸〉0. 05)。
如图9所示，VEC、 VE2、 VE4组细胞裂解液及培养液中HBeAg值不同，t检验均 存在显著性差异，均尸<0.05。 3.免疫印迹检测(Western blot):
制作聚丙烯酰胺凝胶，培养瓶中细胞冻融上清液20u 1加4X蛋白上样液6u 1， 煮沸5min。加样，20"1/孔，电压80V电泳8h。取1张硝酸纤维膜，剪成与聚丙 烯酰胺凝胶等大，去离子水浸透，放于凝胶上，两侧各放与聚丙烯酰胺凝胶等大的 6层3腿滤纸，加转膜液润湿，赶出气泡。至于电泳转移系统中，电流24mA转移 lh。转膜后取出硝酸纤维膜，用25ml TBS室温洗涤硝酸纤维膜5min。用TBS/T 15ml 洗涤5minX 3次。20ml封闭缓冲液摇床80rpm室温孵育lh， TBST 10ml冲洗4次。加鼠单克隆抗朋c稀释液10ml (1: 5000， 一抗稀释缓冲液稀释)，摇床50rpm 4°C 过夜，TBST 10rol洗涤5minX3次。将膜放入10ml含HRP-结合的羊抗鼠IgG 二抗
(1: 2000)的封闭缓冲液中室温轻轻晃动lh。用TBS/T 15ml洗涤5minX3次。ECL 法蛋白检测按ECL试剂盒说明操作，将膜上液体滴尽，置于塑料薄膜上，混合各 0. 5ml Pico Luminol/Enhancer液及0. 5 ml peroxide液，滴力卩于膜上，室温放置 5min。将膜上液体滴尽，保持湿润放入塑料袋，X线片曝光3 5min。
蛋白印迹法检测H印G2细胞裂解液，VEC、 VE2、 VE4转染组可见阳性条带，VR1012及 空白对照组未见。VEC、 VE2、 VE4转染H印G2细胞后表达蛋白免疫印记检测结果(ECL 法)结果如图10所示，VEC、 VE2、 VE4阳性条带分别位于18、 20、 22KDa ， VR1012 转染组、空白组未见阳性条带。
4.酶免疫细胞染色
H印G2细胞复苏，2次传代后以5Xl()4细胞/孔的浓度加入细胞培养板，转染程 序同细胞培养瓶转染方法，每组用lug质粒、lulsofast转染试剂转染。染色步 骤如下
37X:C02孵箱中放置48h后倒掉细胞培养板中的细胞培养液,PBS洗5miriX3次， 4%多聚甲醛(PBS配制)200" 1/孔，4。C冰箱放置30min固定，PBS 200 u 1/孔洗 2minX3次。3XHA封闭内源性过氧化物酶，室温下10min (试剂盒，2滴每孔)， PBS 200u 1/孔洗2minX3次。滴加3%TritonX-100 2滴/孔，37。C30min， PBS 200 y 1/孔洗2minX3次。脱脂奶粉(50g/L)封闭，PBST 200u 1/孔洗2minX3次。 加兔多克隆抗HBc (5g/L， 1: 200稀释)200lil/孔，湿盒内放置37。Clh， PBS 200 y 1/孔洗2minX3次。滴加试剂1 (polymer helper) 2滴/ L， 37。C20min， PBS 200 lU/孔洗2minX3次。加辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG (1: 375稀释)，室温放 置lh， PBS 200u 1/孔洗2minX3次。DAB显色5min，无菌蒸馏水冲洗终止显色。 结果如图12所示，在400倍的显微镜下，24孔板酶免疫细胞染色观察细胞内目的 抗原的表达情况，VEC、 VE2、 VE4转染组均可见棕黄色阳性细胞，且以胞浆内表达 为主，VEC转染组还可见到胞外间质少量着色，三者表达量差别不大，而载体及空 白对照无着色。
本实施例将构建好的VEC、 VE2、 VE4质粒分别转染真核细胞，体外培养48h后采 用ELISA法检测细胞裂解液，结果三者均成功表达目的蛋白HBeAg，细胞免疫组化示 主要为胞浆表达。三者的表达产物在细胞裂解液和细胞培养液中的分布有差异。细 胞裂解液的ELISA检测中，VEC转染组HBeAg的表达量略低，而在细胞培养液中表达 量高于VE2、 VE4两组，考虑原因可能为VEC转染细胞后主要合成分泌型HBeAg， HBeAg 蛋白分泌入培养液后使其胞内含量减少；VE2、 VE4转染组合成的HBeAg蛋白则为胞内型，分泌出细胞的量偏少，主要存在于细胞内。
通过本实施例，我们验证了VE2、 VE4在真核细胞能够成功表达预期蛋白，为进 一步免疫动物，了解该疫苗刺激机体产生特异性免疫的能力打下了基础。 实施例4.突变型乙肝病毒前C-C基因疫苗的免疫效果研究
1. 免疫动物
35只雌性6 8周龄Balb/c小鼠，18 25克，SPF级。随机分为7组，每组5只， 分别为VEC、 VE2、 VE4免疫组、VR1012空载体免疫对照组；my+VEC、 my+VE2、 m Y+VE4免疫组。质粒100ng (2ug/y 1)，胫骨前肌肌注，于O, 1， 3周分别注射3次， 每次注射前l天割尾取血150iU，分离血清。首次免疫28天后釆血处死小鼠，取脾 制单细胞悬液。
2. 小鼠体液免疫检测
使用ELISA试剂盒，竞争抑制法检测小鼠血清中HBcAg/朋eAg，步骤如下常规 方法HBcAg/HBeAg包被NEUNC板。小鼠血清50wl，阴性对照、阳性对照、空白对照 各50yl。加酶复合物50ul，混匀，37。C孵箱放置30min。洗涤液300 u 1/孔洗4次， 拍干。加显色剂A50ul，显色剂B50ul，混匀，37'C孵箱放置10min。加终止液50 u 1。 450入m波长分光光度计测OD值。
结果VEC、 VE2、 VE4以肌注方式免疫Balb/c小鼠后，于免疫后第2周末用ELISA 法血清中可检测到抗朋c和抗HBe，免疫结束后滴度升高，结果见表2，单因素方差 分析表明，VE4、 VE4+VMY组血清抗Hbe抗体效价较其它免疫组高，各组间抗HBc水 平无显著性差异。按cutoff值校正后对比抗朋e与抗HBc水平，各组抗HBe均高于抗 HBc水平。联合使用VMY免疫，对抗HBc和抗HBe产生的时间和效价无影响。 表2 VEC等免疫小鼠血清中抗HBc和抗Hbe抗体测定结果
免疫组别抗HBc (x)抗HBe (x)
说明
VR10121.981.99*
VEC0. 350, 18
VE20.270. 16
VE40. 330. 08*
VEC+VM Y0. 260. 15
VE2+ VM y0. 310. 16
VE4+ VMy0. 220. 07*
*与其它免疫组比较/ <0.01
氺与VEC、 VE2比较p<0. 05
承与VEC+VM y 、 VE2+VM y比较p <0. 053.小鼠细胞免疫检测
首次免疫28天后采血处死小鼠，取脾制单细胞悬液。脾脏淋巴细胞分离及准备 摘眼球放血处死小鼠后，每组小鼠70%乙醇浸泡消毒后，沿腹部正中线剪开腹腔， 无菌取脾脏，置不完全1640培养液平皿中，剪开包膜，刮出脾细胞，吹打成单个细 胞悬液，400目尼龙网过滤，1200r/min， 5min离心，弃上清。用O. 155M的NH4C1破 坏红细胞(0. 155M NH4CL) 5min后，1200r/min， 5min离心，弃上清，1640培养液 轻旋细胞沉淀，加入等体积Fico11-Quates液2000 r/min， 20min离心分离脾脏淋巴 细胞。并用R-3无酚红1640培养液调整细胞浓度为107ral。 (1)小鼠脾淋巴细胞CTL杀伤效应检测
根据文献报道(Chen A，Wang L,Zhang J. J Virol, 2005，79(9):5568-76. Schirmbeck R. Reimann J . Molecular Immunology, 2002， 39:249—259. Sette AD， Oseroff C， SidneyJ， et al. J Virol, 2001,75:1389-1397)合成HBcAg各2条抗原多肽Balb/c小鼠MHCII类抗原表 位 HBcAg (AA131-139)AYRPPNAPI ， MHC I 类抗原表位 HBcAg (AA81-96)SRELWSYVNV丽GL ，培养P815细胞，吹打悬浮，显微镜下估计细胞数， 使细胞浓度为107ml个。加入对Balb/c小鼠具有特异性的MHC抗原表位肽HBcAg (131-139)、 HBcAg (81-96)，使其浓度各为10ug/ml， 37。C孵育lh。调节孵育后的 P815细胞浓度为107ml个。按Cytotox96 LDH Kit操作程序操作加样
A. 空白组(淋巴细胞自裂解组)稀释96孔板，每组淋巴细胞设4个浓度梯度 106， 3.3X 105, 105， 3.3X104。每个梯度设3个平行孔。加样方法第一稀释度的3 孔各加150ul 1X10'淋巴细胞，剩余3个稀释度平行孔中分别加入100n 1 R-3无酚 红培养基，从第一稀释度中取出50y l加入到第2稀释度，混匀后取出50iil加入到 第3稀释度，按此法逐级稀释，使每孔体积为100u 1。再于每孔加入100ul R-3无 酚红培养基，使每孔体积为200ii1。
B. 实验组稀释96孔板，每组淋巴细胞设4个浓度梯度，每个梯度设3个平行孔。 加样方法如空白组。再于每孔加入100yl浓度为10Vml个的P815细胞，使每孔体积 为200ul。加样后4个浓度梯度的效应细胞靶细胞分别为100:1、 33:1、 10:1、 1:1。
C. 特定对照组每组4个平行孔。
空白体积对照组200ul R-3无酚红培养基，于收上清前45min加入20ul裂 解溶液(10)
培养基对照组200^1 R-3无酚红培养基
靶细胞自发裂解100" 1 P815 (浓度107ml个)和100ul R-3无酚红培养基 靶细胞最大裂解100" 1 P815 (浓度10Vml个)和100ul R-3无酚红培养基，于收上清前45rain加入20yl裂解溶液。
于37°。5%0)2孵箱中培养4-5小时，96孔板250g离心4分钟后，将上淸50ul移至另 一平底96孔板(上淸可于-2CTC保存过夜)。取AssayBuffer 12ral (用过立即冻存于 -2(TC)加入Substrate瓶中，避光。每孔加入50yl，室温半小时。确保每孔中无 气泡。 一小时内酶标仪于490或492nm处读数。
根据公式计算各淋巴细胞稀释度的靶细胞特异性裂解百分比。靶细胞特异性裂 解百分比二 (实验组-淋巴细胞自裂解组-靶细胞自裂解组)/ (靶细胞最大裂解-靶 细胞自裂解)。绘制曲线，横坐标为淋巴细胞稀释度，纵坐标为靶细胞特异性裂解 百分比，该曲线反映疫苗在小鼠体内诱导的对HBV特异性CTL的情况。用单因素方
差分析比较各免疫组之间有无显著性差异。
酶标仪分析CTL杀伤检测结果，根据公式计算各淋巴细胞稀释度的靶细胞特异性 裂解百分比。以淋巴细胞稀释度为横坐标，靶细胞特异性裂解百分比为纵坐标绘制 曲线如图12，用单因素方差分析比较各免疫组之间有无显著性差异。结果显示MVY 试验组中，VEC、 VE2、 VE4各免疫组均表现出特异性CTL杀伤效应，VE4强于VE2、 VEC，联用VMy免疫后三组CTL杀伤效应均增强，且VE4+VM y强于VE2+VM y 、 VEC+VM Y 。
(2)小鼠脾淋巴细胞ELISpot检测按试剂盒说明操作
① 70W乙醇100y 1/孔室温10min。弃乙醇，1XPBS 100ul/孔洗3次。
② 100ul特异性捕获抗体滴入10ml 1XPBS，混匀，100ul/孔包被，4。C孵育过 夜。
③ 弃包被液，1XPBS 100" 1/孔洗1次，2%脱脂奶粉-PBS100nl/孔，室温孵育2h。 轻摇倒空拍干，1XPBS/孔洗1次。
④ 加入脾细胞悬液107ml 100y 1/孔，试验组加入抗原肽各0.2tig/孔，阳性对照 加入PMA各0.5ng/孔，阴性对照加入DMEM。 96孔板用膜封好，37'CC02孵箱孵育合 适时间(5-20h)。勿移动。
⑤ 轻摇倒空，轻轻拍干，0. l%Tween- PBS 100 u 1/孔4。Cl0min， 0. l%Tween-PBS 100 W 1/孔洗3次。
1%BSA- PBS 100ul/孔，盖膜封96孔板，37°C C02孵箱孵育l. 5h。倒空孔板， 0. l%Tween- PBS 100yl/孔洗3次。
⑦ 链亲和素碱磷酶稀释液100yl/孔，盖膜封96孔板，37t:C02孵箱孵育l h。
⑧ 倒空孔板0. l%Tween- PBS 100ul/孔洗3次，彻底拍干。
⑨ 加入100u 1/孔BCIP/NBT，室温2-5min显色。蒸馏水每孔洗三遍，干后ELISpot 自动分析系统读孔。200810115677.4
说明书第19/22页
用ELISpot分析仪计数小鼠脾淋巴细胞悬液抗原肽刺激后斑点形成细胞(SFC) (如图13所示)个数均值，结果见表3。 VE4免疫组的SFC值最高，大于VE2、 VEC， 秩和检验有统计学意义，联合使用VMy免疫小鼠后各组SFC数均升高，与单独免疫 组比较有显著性差异，
表3 VEC 、 VE2、 VE4免疫及联用VMY免疫后小鼠脾淋巴细胞SFC数
免疫组别 SFC数(x土d) p 说明
VR10127, 17±1. 72<0.01与所有组比较
VEC56. 83±5. 19<0. 05与VE4组比较
VE264. 33±8. 16>0. 05与VEC组比较
VE480, 67±8. 50<0. 05与VE2组比较
VEC+VM y112.00±12. 99<0. 01与VEC组比较
VE2+ VMy117.33±11.29<0. 01与VE2组比较
VE4+ VMy130. 17±8. 84<0, 01与VE4组比较
本实施例动物实验结果显示VEC、 VE2、 VE4以肌注方式免疫Balb/c小鼠后，血 清中均能够产生抗HBc和抗HBe抗体，且VE4组抗HBe水平高于抗HBc，三者引发的抗 HBc水平相当。细胞免疫分析表明，VE4免疫组使小鼠脾淋巴细胞中Y干扰素产生细 胞数增多更明显于V'E2、 VEC组；特异性CTL杀伤效应检测提示VE4、 VE2略强于VEC组， 有统计学意义。上述结果表明我们改建的VE2、 VE4在诱导小鼠特异性细胞和体液免 疫方面确实存在优势。
联用VM Y对三组抗HBc和抗朋e产生的早晚和滴度无影响，但ELISpot检测联用VM
Y免疫后各组SFC数均升高明显；CTL杀伤效应均增强。说明^1Y作为基因佐剂确实
能够使基因疫苗所引起的特异性细胞免疫增强。
上述实验结果表明人工突变型乙肝病毒前C-C基因疫苗在诱导小鼠特异性细胞
和体液免疫方面均有优势，可用于乙型肝炎的免疫治疗。序列表
〈110〉中国人民解放军第三零二医院
〈120〉一种乙肝病毒前C—C基因疫苗的制备及应用
〈130〉
<140〉
〈141〉
〈213〉插入片段HBV ENHII -PreC-C的核苷酸序列 〈400>
ctgcagacctctgcacgtcgcatgg犯accaccgtgaacgcccaccaggtcttgcccaag60
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ctctcttttttgccttctgacttctttccttctattcgcgatctcctcgacaccgcctca420
gctctgtatcgggtggccttsgagtctccgg犯cattgtttacagcactc480
aggc犯gctatcctgtgttggggtg站Ugatgaatctggccacctgggtggg犯gt犯t540
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1.一种乙肝病毒前C-C基因疫苗，其特征在于，其包括真核细胞表达载体VR1012上插入核苷酸序列的乙肝病毒前C-C基因和自身复制调控元件增强子II。
2. —种构建乙肝病毒前C一C基因疫苗的方法，其步骤如下首先以血清中的 HBV DNA为模板，用套式PCR扩增出乙肝病毒ENHII、前C/C基因，连入T-easy载体， 再通过双酶切及再连接将目的基因连入真核表达载体VR1012，克隆筛选得到乙肝病 毒前C一C基因疫苗质粒。
3. —种人工突变型乙肝病毒前C一C基因疫苗，其特征在于，其采用单引物二 次PCR法对权利要求1或2中的乙肝病毒前C一C基因疫苗重组质粒中的蛋白酶切位点 151+154进行点突变。
4. 根据权利要求3所述的人工突变型乙肝病毒前C一C基因疫苗的构建方法，其 步骤如下首先合成2对引入点突变的引物，以变性的乙肝病毒前C一C基因疫苗质 粒质粒DNA为模板，以单条引入突变的寡核苷酸为引物，高保真聚合酶引导DNA合成， 经PCR扩增后，再加入另一条互补引物PCR扩增，然后用DpnI酶切除未突变的甲基化 模板，转化细菌后克隆筛选得到突变的基因；依次如上法实现151+154 2处点突变，形成改造后的突变型乙肝病毒前c-c基因疫苗。
5. —种人工突变型乙肝病毒前C一C基因疫苗，其采用单引物二次PCR法对权利 要求1或2中的乙肝病毒前C一C基因疫苗质粒重组质粒中的蛋白酶切位点 151+154+164+167进行点突变。
6. 根据权利要求5所述的人工突变型乙肝病毒前C一C基因疫苗的构建方法，其 步骤如下首先合成4对引入点突变的引物，以变性的乙肝病毒前C一C基因疫苗质 粒DNA为模板，以单条引入突变的寡核苷酸为引物，高保真聚合酶引导DNA合成，经 PCR扩增后，再加入另一条互补引物PCR扩增，然后用DpnI酶切除未突变的甲基化模 板，转化细菌后克隆筛选得到突变的基因；实现151+154+164+167 4处点突变，形成改造后的突变型乙肝病毒前c-c基因疫苗。
7. 根据权利要求3-6所述的人工突变型乙肝病毒前C一C基因疫苗，其中所述 的蛋白酶切位点的点突变，其具体的操作步骤为以乙肝病毒前C一C基因疫苗质 粒为模板，加入5'端引物151正、Pfu酶行第一轮单引物PCR ，以上述PCR反应 产物为模板，加入3'端引物151反再行第二轮PCR扩增；Dpnl酶切第二轮PCR 产物，转化入感受态DH5ct细菌，卡那霉素LB培养板筛选阳性单菌落，提质粒测 序；如上述步骤在突变质粒的基础上再依次实现另外3个核酸位点突变，分别变异 151、 154质粒，变异151、 154、 164质粒、变异151、 154、 164、 167质粒。
8、 一种如权利要求1-6中任一项所述的疫苗在治疗和预防乙型炎型肝中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种乙肝病毒前C-C基因疫苗及其应用，更涉及一种突变型乙肝病毒前C-C基因疫苗及其应用，首先以乙肝病毒前C-C基因和自身复制调控元件增强子Ⅱ为目的基因，使用真核表达载体，构建乙肝ENH Ⅱ/前C-C基因疫苗重组质粒，然后采用单引物二次PCR法，对乙肝VR1012/ENH Ⅱ/前C-C基因疫苗重组质粒中的蛋白酶切位点依次进行4处点突变，得到151+154、151+154+164+167点突变的2种突变型重组乙肝ENH Ⅱ/前C-C基因疫苗。该重组HBV DNA疫苗能有效诱导特异性细胞免疫，可用于乙型肝炎的预防和治疗。
文档编号A61K48/00GK101612405SQ20081011567
公开日2009年12月30日 申请日期2008年6月26日 优先权日2008年6月26日
发明者俊 侯, 周先志, 敏 张, 沈宏辉, 王志杰, 燕 胡, 貌盼勇, 兢 赫, 辛绍杰 申请人:中国人民解放军第三〇二医院