制备 ①胶体金溶液的熬制
量取99 mL的超纯水装入250 mL的圆底烧瓶，放入搅拌子，置于磁力搅拌器上，加入1%氯金酸(上海杰一生物技术有限公司，货号JY-SJ111)溶液I mL，适当速度搅拌，打开加热开关，待溶液沸腾后迅速一次性加入1.6 mL 1%柠檬酸三钠溶液，氯金酸溶液由灰色逐渐变为酒红色，颜色稳定后继续加热10 min，待溶液冷却后，用微孔滤膜过滤，4°C保存备用，紫外扫描得到最大吸收峰为523nm的胶体金颗粒。
[0039]②抗兔瘟病毒VP60单克隆抗体的标记
用0.1 11101/1的1(尤03调节胶体金?!1值为9.0。每1 mL胶体金溶液加入6yg抗兔瘟病毒VP60单克隆抗体(山东绿都生物科技有限公司，货号LDANT1-VP60)，室温下120rpm摇30min，加入10%牛血清白蛋白2yL，室温下120rpm摇30 min，12000rpm离心20 min，弃上清，用
0.0lMPBS溶解沉淀，即得到标记好的抗兔瘟病毒VP60单克隆抗体。
[0040]③金标垫处理
选择聚脂纤维6613 (上海捷宁生物生物科技有限公司，货号聚脂纤维6613)作为金标结合垫。将金标垫浸泡在处理液A(0.01Mpbs，pH7.4, 0.2%Triton X-100) 5min，取出37°C烘干，备用。
[0041 ]④样品垫处理
选择DL42 (上海金标生物科技有限公司，货号DL42 )为样品垫，将样品垫浸泡在处理液B( 0.01 Mpbs pH7.4a%Triton X-100，1%BSA，0.05% NaN3)，5min，取出37°C烘干，备用。
[0042]⑤C，T线确定
选择Sartorius Cn 140膜(德国赛多利斯公司，货号Cnl40)，分别将兔瘟病毒VP60蛋白(山东绿都生物科技有限公司，货号LDVP60)和羊抗鼠二抗(山东绿都生物科技有限公司，货号LDksOOl)作为T线和C线划在NC膜上，浓度分别为1.3mg/mL和0.6mg/mL。
[0043]试验例I本发明兔瘟病毒抗体快速检测卡的使用
本发明检测卡的结构如图1所示，使用本发明时，采集全血液0.lml，用吸管滴到检测卡中的样品孔中，5-10分钟时判断结果。
[0044]结果判定如图2、3和4。
[0045](I)阳性(图3):若C线显色，而T线不显色，判为阳性，达到了可以预防强毒攻击抗体水平。
[0046](2)阴性(图2):若C线显色，T线同时显色，判为阴性或者抗体水平低。
[0047](3)无效(图4):在观察孔内，若C线不显色，则结果无效，建议重新测试。
[0048]试验例2本发明检测卡敏感性和准确性测试抽取100份注射过兔瘟疫苗的兔血清以及100份未注射过兔瘟疫苗的兔血清，分别用血凝实验和本检测卡进行检测复核。结果显示，两者的敏感性符合率为98%，准确性为99%。
【主权项】
1.一种兔瘟病毒抗体快速检测卡的制备方法，具体步骤为: (I)抗兔瘟病毒VP60单克隆抗体的制备 ①免疫程序 将昆虫细胞表达蛋白VP60免疫原与501佐剂按体积比1:0.5-1.5的比例混合，对8-10周龄Balb/c小鼠进行免疫，腿部肌肉注射，50yg/只，以后每隔两周免疫一次，免疫剂量、部位同上;5免后加强免疫，腹腔注射，不加佐剂，剂量加倍； ②细胞融合 将Balb/c小鼠体内的脾细胞与其腹腔内的骨髓瘤细胞按照细胞数量20:0.5-1.5的比例混合，800rpm离心5_8min，弃去上清，于30S内加入lmL50%PEG(W/W)，静置Imin，在第一个Imin内缓慢加入ImL无血清的DMEM培养基，在第二个Imin内缓慢加入2mL无血清的DMEM培养基，在第三个Imin内缓慢加入2mL无血清的DMEM培养基，在第四个Imin内缓慢加入5mL无血清的DMEM培养基，在第五个Imin内缓慢加入1mL无血清的DMEM培养基，800rpm离心1min，弃上清，用含20%小牛血清的完全培养基重悬细胞，细胞计数为3-6 X 15个/mL铺于含2-6 X14个/mL饲养细胞的细胞培养板，置于CO2培养箱中； ③杂交瘤筛选及克隆化 待细胞长至孔底的1/3时，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔，将阳性孔采用有限稀释法进行亚克隆，第6天，取细胞上清检测，最终选取抗兔瘟病毒VP60杂交瘤细胞株2F4，将杂交瘤细胞冻存于液氮罐中，所述的杂交瘤细胞株2F4于2015年6月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C201582，保藏地址为中国武汉-武汉大学； ④抗体制备及纯化 单克隆抗体的生产:采用动物体内腹水诱生法； 单克隆抗体的纯化:采用SPA柱法对腹水进行纯化，即得本发明抗兔瘟VP60单克隆抗体； (2 )兔瘟病毒抗体快速检测卡的制备 ①胶体金溶液的熬制 采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金； ②抗兔瘟病毒VP60单克隆抗体的标记 用0.1 mol/I^K2C03调节胶体金pH值为9.0，每I mL胶体金溶液加入6yg抗兔瘟病毒VP60单克隆抗体，室温下120rpm摇30 min，加入10%牛血清白蛋白20yL，室温下120rpm摇30min，12000rpm离心20 min，弃上清，用0.0lMPBS溶解沉淀，即得到标记好的抗兔痕病毒VP60单克隆抗体； ③金标垫处理 选择聚脂纤维6613作为金标结合垫，将金标垫浸泡在处理液A中5min，处理液A为0.0lMpbs，pH7.4，0.2%Triton X-100，取出37°C烘干，备用; ④样品垫处理 选择DL42为样品垫，将样品垫浸泡在处理液B中5min，处理液B为0.01 Mpbs，pH7.4，1%Triton X-100，1%BSA，0.05% NaN3), 5min，取出37°C烘干，备用； ⑤C，T线确定 选择Sartorius Cnl40膜，分别将兔瘟病毒VP60蛋白和羊抗鼠二抗作为T线和C线划在NC膜上，浓度分别为1.3mg/mL和0.6mg/mL。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(I)中将昆虫细胞表达蛋白VP60免疫原与501佐剂按体积比1:0.8-1.3的比例混合。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(I)中将昆虫细胞表达蛋白VP60免疫原与501佐剂按体积比1:1的比例混合。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(I)中将Balb/c小鼠体内的脾细胞与其腹腔内的骨髓瘤细胞按照细胞数量20:1的比例混合，800印111离心71^11。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(I)中将Balb/c小鼠体内的脾细胞与其腹腔内的骨髓瘤细胞按照细胞数量20:0.8-1.3的比例混合，800rpm离心6min。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(I)中杂交瘤细胞株2F4于2015年6月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C201582，保藏地址为中国武汉-武汉大学。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金的具体步骤为: 方法为量取99 mL的超纯水装入250 mL的圆底烧瓶，放入搅拌子，置于磁力搅拌器上，加入1%氯金酸溶液I mL，适当速度搅拌，打开加热开关，待溶液沸腾后迅速一次性加入1.6mL 1%柠檬酸三钠溶液，氯金酸溶液由灰色逐渐变为酒红色，颜色稳定后继续加热10 min,待溶液冷却后，用微孔滤膜过滤，4°C保存备用，紫外扫描得到最大吸收峰为523nm的胶体金颗粒。8.如权利要求1-7任一项所述方法制备的兔瘟病毒抗体快速检测卡。
【专利摘要】本发明涉及一种兔瘟病毒抗体快速检测卡及其制备方法，具体步骤为：（1）抗兔瘟病毒VP60单克隆抗体的制备，包括免疫程序、细胞融合、杂交瘤筛选及克隆化、抗体制备及纯化；（2）兔瘟病毒抗体快速检测卡的制备，包括胶体金溶液的熬制、抗兔瘟病毒VP60单克隆抗体的标记、金标垫处理、样品垫处理、C,T线确定。本发明可以快速、灵敏、准确的检测兔瘟病毒抗体，克服了国内检测兔瘟抗体主要以红细胞血凝，酶联免疫检测的问题。CCTCC：C20158220150611
【IPC分类】G01N33/569
【公开号】CN105486861
【申请号】CN201510380893
【发明人】武玉香, 沈志强, 曲光刚, 唐世云, 孟卫芹
【申请人】山东绿都生物科技有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年7月2日