改良间接酶联免疫吸附法【
技术领域：
】[0001]本发明设及酶联免疫吸附法，尤其设及间接酶联免疫吸附法。【
背景技术：
】[0002]间接酶联免疫吸附法化LISA)是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗体W检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果，但应尽可能予W纯化，W提高试验的特异性。特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质，例如WE.Coli为工程酶的重组抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能与受过E.Coli感染者血清中的抗E.Coli抗体发生反应。另外如抗原中含有无关蛋白，也会因竞争吸附而影响包被效果。重组蛋白在原核表达中由于其物理特性（自身结构，酸碱性等）差异，难免有些无法达到预期纯度，而影响ELISA的准确性。【
发明内容】[0003]本发明的一个目的是提供一种利用低纯度抗原检测待测样本的间接酶联免疫吸附法。[0004]本发明提供的间接酶联免疫吸附法，包括如下步骤：[0005]1)将抗体加入孔板进行包被，得到包被抗体孔板；[0006]所述抗体为低纯度抗原中标签的抗体，所述低纯度抗原为蛋白与标签连接后的融合蛋白；[0007]2)将所述低纯度抗原加入所述包被抗体孔板各孔，进行抗原捕获，得到捕获抗原孔板；[000引3)依次将待测样本、酶标二抗加入孔板，反应，检测0D值，实现待测样本的间接酶联免疫吸附法检测。[0009]上述方法中，所述低纯度抗原为纯度小于或等于70%的抗原。[0010]上述方法中，所述标签为HIS标签；[0011]所述酶标二抗为碱性憐酸酶标记的山羊抗人IgG。[0012]上述的方法在检测待测样本是否为副肿瘤性天瘤疮样本中的应用也是本发明保护的范围；[0013]或上述的方法在检测待测人是否为副肿瘤性天瘤疮患者中的应用也是本发明保护的范围。[0014]本发明另一个目的是提供一种利用低纯度抗原检测或候选检测待测样本是否为副肿瘤性天瘤疮样本的方法。[0015]本发明提供的方法，包括如下步骤：[0016]1)将抗体加入孔板进行包被，得到包被抗体孔板；[0017]所述抗体为低纯度抗原中标签的抗体，所述低纯度抗原为蛋白与标签连接后的融合蛋白；[0018]2)将所述低纯度抗原加入所述包被抗体孔板各孔，进行抗原捕获，得到捕获抗原孔板；[0019]3)依次将待测样本、酶标二抗、显色反应液加入孔板，在特定波长读取待测样本0D值，根据所述待测样本0D值和空白0D值，确定待测样本是否为副肿瘤性天瘤疮样本；[0020]所述低纯度抗原为包斑蛋白或其截短体或其亚基与标签连接后的融合蛋白，所述低纯度抗原的纯度小于或等于70%。[0021]上述方法中，[0022]所述根据所述待测样本0D值和空白0D值，确定待测样本是否为副肿瘤性天瘤疮样本包括如下步骤:根据所述检测孔和所述空白对照孔的0D值用Medcalc软件计算cut-off值;若待测样本的0D值大于cut-off值，则待测样本为或候选为副肿瘤性天瘤疮患者;若待测样本的0D值不大于cut-off值，则待测样本不为或候选不为副肿瘤性天瘤疮患者。[0023]上述方法中，[0024]所述低纯度抗原的氨基酸序列为序列2;[0025]所述待测样本为离体血清；[00%]所述特定波长为405nm;[0027]所述cut-off值为0.031。[0028]上述方法中，[0029]所述抗体为鼠源抗his标签抗体；[0030]所述二抗为碱性憐酸酶标记的山羊抗人IgG。[0031]上述方法中，[0032]在所述包被后每加入一种物质解育完成后(显色反应除外)均要进行洗板的步骤。[0033]上述方法中，[0034]所述鼠源抗Ms标签抗体W鼠源抗Ms标签抗体溶液(溶剂为封闭液）的形式加入孔板；[0035]所述鼠源抗Ms标签抗体溶液的浓度为2.加g/ml;所述鼠源抗Ms标签抗体的加样量50微升/孔；[0036]所述序列2所示的低纯度抗原W序列2所示的低纯度抗原溶液(溶剂为封闭液）的形式加入孔板；[0037]所述序列2所示的低纯度抗原溶液的浓度为4.37加g/ml;所述序列2所示的低纯度抗原溶液的加样量50微升/孔；[0038]所述碱性憐酸酶标记的山羊抗人IgGW碱性憐酸酶标记的山羊抗人IgG溶液(溶剂为封闭液)的形式加入孔板；[0039]所述碱性憐酸酶标记的山羊抗人IgG溶液的浓度为0.167ug/ml;所述碱性憐酸酶标记的山羊抗人IgG溶液的加样量50微升/孔;所述洗板采用的洗涂液为pH值为7.5浓度为0.02M的PBST;[0040]所述封闭采用的封闭液为将脱脂奶粉加入pH值为7.5浓度为0.02M的PBST中得到的溶液，使脱脂奶粉的质量百分含量为5%。[0041]本发明的实验证明了，本发明的方法在低纯度抗原包被前包被可通过特异性免疫反应与之作用的抗体，使低纯度抗原被该特异性抗体捕获，实现提高抗原纯度的目的，同时降低了抗原包被所需的含量;通过实验发现运种改良方法包被的纯度60%的抗原比常规间接法包被的纯度60%的抗原实验结果相比，具有更高的敏感度及特异度，并且差异具有统计学意义。【具体实施方式】[0042]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。[0043]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。MaxiSo;rp96孔板(ThermoFisher467466)、抗6组氨酸化is)鼠单克隆抗体（全式金生物有限公司肌501-01)、0.051閒9.6碳酸盐缓冲液（〔85)、脱脂奶粉（80232100)、含0.05%Tween20的PH7.5憐酸盐缓冲液(PBST)、试验用含组氨酸标签的重组蛋白、待测样品、检测待测样品中抗体的特异性酶标二抗（lifetechnologyiesG-21060)、EレP-NPP显色试剂盒(sangonbiotechPW014)〇[0044]抑值为9.6浓度为0.051的碳酸盐缓冲液化85):1.59邑碳酸钢(北京化工厂50148)和2.93g碳酸氨钢(北京化工厂S0037)，溶于1L去离子水(millipore水机自制），0.45um滤器(mi11iporeSLHV033RB)过滤，调节抑值，得到抑值为9.6浓度为0.05M的CBS。[0045]抑值为7.5浓度为0.021的？851':将?85粉剂(北京中杉金桥生物公司化1-9062)和Tween20(Amresco0777)溶于化去离子水，PBS粉剂的浓度0.02M，Tween20的体积百分含量为0.05%，调节抑值，得到抑值为7.5浓度为0.02M的PBST。[0046]封闭液:将脱脂奶粉加入上述pH值为7.5浓度为0.02M的PBST中得到的溶液，使脱脂奶粉的质量百分含量为5%。[0047]实施例1、间接酶联免疫吸附法[004引一、抗原EVPL-N1的制备[0049]EVPkNl蛋白的氨基酸序列为序列2第6-146位氨基酸，其编码基因的核巧酸序列为序列1第16-438位核巧酸。[(K)加]1、重组载体的构建[0051]将序列表中序列1第16-438位核巧酸(为N1基因）所示的EWL-N1蛋白编码基因插入祀ASY-E2表达载体(全式金生物有限公司CE201-01)进行平端连接，得到的重组载体，命名为pEASY-E2-EVPレNl实现EV化-N1蛋白与载体上的MGIGP和Ms标签共表达，得到重组EVPL-N1〇[0化2]重组EWL-Nl的氨基酸序列为序列2,第1-5位为载体上的MGIGP，第6-146位为EVPL-N1蛋白，第147-158位为his标签；[0化3]重组EV化-N1的编码基因的核巧酸序列为序列1，第1-15位为载体上的MGIGP编码核酸，第16-438位为EVPL-N1蛋白编码基因，第439-477位为his标签编码基因。[0化4]2、重组克隆感受态的构建[0055]将重组载体pEASY-E2-EVPレNl导入大肠杆菌Transl-Tl(全式金生物有限公司CD5010-01)中，得到重组菌Trans1-T1-EVPkNl。[0化6]提取重组菌的质粒送去测序，质粒为祀ASY-E2-EVPL-N1的为阳性重组质粒。[0化7]3、EVPL-N1蛋白表达[005引将上述的阳性重组质粒转化至表达感受态细胞Transetta(DE3)ChemicallyCompetentCell(全式金生物有限公司CD801-01)，在固态LB上挑取单克隆后摇菌，分装冻存。复苏表达感受态细胞，过夜培养后1:50接种至液态LB，37°C，200巧m/min，摇至0D600=0.6，加入终浓度0.05mM的诱导剂IPTG(Isopropyl-P-D-thiogalactopyranoside,全式金生物有限公司6。101-01)，37°(3,200巧111/111111，诱导5小时。4°0，10000巧111离屯、10111111收集菌体，并重悬至含蛋白酶抑制剂（罗氏Completetablets邸TA-free，EASYpack04693132001)的结合缓冲液(50mMNa出P04,300mM化Cl，PH7.4)中，得到菌体悬浮液。[0化9]4、纯化重组EVPL-N1蛋白[0060]菌体悬浮液冰浴中用超声破碎仪裂解(300W功率，超声5s停10s，持续20min)菌体，4°C，14000g，20min离屯、，取上清0.45um滤器过滤，加入咪挫，使其终浓度为lOmM/L，使用儀柱亲和层析技术纯化，将准备好上清加入儀柱(Ni-NTAHisBindResins默克公司70666-3，流速Im1/miη)4°C，100巧m，摇1小时，含15mM咪挫的漂洗缓冲液（5OmM化H2P04，30OmMNaCl，P服.0，15mM咪挫）漂洗，250mM咪挫的洗脱缓冲液（50mM化出P04,300mMNaCl，PH8.0，250mM咪挫)洗脱目的蛋白。[0061]收集2倍柱体积的洗脱液即为分子质量为18.0KD重组EVPL-N1蛋白。[0062]将重组EVPkNl蛋白进行SDS-PAGE电泳，目的蛋白EVPkNl的分子质量为18.0邸；结合缓冲液100倍EV化-N1蛋白体积，4°C条件下透析2次除去咪挫，WBSA标准品（Pierce?BovineSerumA化uminSl:andardAmpules,23209,2mg/mL)为当前第1页1 2