专利名称：CpG寡聚核苷酸抗感染DNA制剂的制备及应用技术的制作方法
技术领域：
1.生物技术 2.分子免疫学背景技术21世纪人类健康问题日益突出，在以抗生素等化学药物有效治疗感染性疾病的同时，由此也产生了众多药源性疾病和细菌对抗生素的耐药性问题。目前由于过度依赖抗生素控制感染性疾病，导致病菌耐药性问题。近十多年来细菌对抗生素的耐多药、全耐药现象蔓延加剧，造成许多感染性疾病难以控制，如结核杆菌、0157大肠杆菌等引起的传染性疾病卷土重来，严重威胁着人类生命健康。目前迫切需要开拓全新的抗感染技术及药物，有效增强机体免疫抗感染能力，克服滥用抗生素的危害。近几年核酸分子免疫刺激序列的出现，为此带来了新的曙光。
免疫刺激序列(ISS)，即以非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpG)为基序构成的特定寡聚核苷酸序列，具有较强的免疫刺激活性。1995年Krieg等发现核酸中的免疫刺激活性成分是一些含有未甲基化5’-CG-3’二核苷酸的六碱基特征序列，核心碱基C和G为活性所必需，两端碱基也与其活性密切相关。自此以来，有关CpGODNA的研究逐渐成为分子免疫学研究的一个热点，并取得了许多进展。CpGODNA可刺激多种免疫活性细胞分泌多种细胞因子如IL-12、IL-6、TNF-α、IFN-α和IFN-β等，使机体产生快速的抗体应答及提高细胞免疫应答，CpG还能活化自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、B细胞和树突细胞，是一种强烈的非特异性免疫刺激剂。CpGODNA可激发多种免疫反应，具有免疫激活功能，可作为诱导Th1型特异性免疫反应的佐剂。多项动物实验结果表明，CpG-ODN可作为一种新型佐剂用于增强对蛋白质抗原的Th1型免疫反应，同时CpG-ODN与DNA疫苗一同用于接种注射，可增强免疫反应。
目前，已确定CpG序列对动物机体的免疫激活功能主要体现在以下两方面一是刺激B淋巴细胞增殖；二是激活单核细胞分泌细胞因子，进而导致自然杀伤细胞和Th1辅助T细胞激活，引发Th1特征的体液和细胞免疫反应。
CpGODNA的免疫刺激活性不仅与CpG基序和分子结构密切相关，而且具有动物种属特异性。目前CpG免疫刺激序列的应用研究主要集中在基因治疗、疫苗佐剂、肿瘤免疫等方面，而对其抗感染生物效应的研究较少。新近的研究表明，CpG基序除具有免疫调节功能外，对于控制胞内寄生细菌(李斯特菌，分支杆菌等)的感染也起重要作用，这一作用可依赖也可不依赖淋巴细胞，可望开发作为新型抗感染的免疫调节分子药物。
因免疫途径和免疫方式不同，所涉及的抗原呈递细胞、抗原呈递方式均有不同，故可产生不同类型、不同强度的免疫应答。肌内直接注射和口服是简便且有效的两种途径。肌肉注射不需要额外的设备，且能在肌肉细胞中长期表达外源基因，因此它不仅是免疫动物的有效手段，而且还可应用于基因治疗。考虑到今后应用的简便性，口服也是一种可选的免疫方式。由于肌肉注射主要通过Th1细胞激活方式诱导免疫应答，效率较低，需要注射的DNA剂量较大，而口服经消化道所需的DNA量更大。因此，选择有效的包裹方式将抗感染DNA制剂靶向投递到抗原提呈细胞，以诱导强的体液免疫和细胞免疫，在应用免疫增强剂防治传染性疾病中至关重要。壳聚糖是天然生物多糖甲壳质的脱乙酰基衍生物，具有很好的生物相容性、可被体内多种酶类降解、降解产物安全无毒，并能被生物体完全吸收；而且由于其具有独特的聚阳离子特性，已有的研究结果显示它是一种具有很大潜力的缓释材料。近年来，在基因转染表达研究领域已出现了基于壳聚糖的纳米颗粒系统。大量研究表明，壳聚糖可包裹浓缩DNA，形成小的分散颗粒，将壳聚糖DNA复合物用于基因运载和转染表达时，能有效携带目的基因进入靶细胞中。包封于壳聚糖颗粒中的物质，其释放率主要决定于壳聚糖的生物降解和溶蚀，因此物质释放明显延长。初步研究结果发现基于壳聚糖的颗粒系统在生物医学方面具有广阔的应用前景。此外，壳聚糖还具有多种生物学功能，尤其是可作为药物增效剂。
由于壳聚糖纳米颗粒良好的生物相容性使其在DNA制剂的包裹应用中显示了广阔的前景，因此利用壳聚糖纳米颗粒包装CpG寡聚核苷酸制备DNA制剂，并将其应用于提高机体细胞和体液免疫水平、增强抗感染能力的应用技术，在科研，医疗，动物保健，和产业化方面具有潜在的巨大价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是利用壳聚糖为包裹材料制备CpG寡聚核苷酸DNA制剂，并将此制剂用于抗感染的应用技术。该方法包括下列步骤1、CpG寡聚核苷酸序列及其引物的设计、合成CpG序列设计及合成
CpG序列(见说明书第12页序列表)合成了含有11个CpG基序、长度为88个碱基的CpG寡聚核苷酸序列，其特点为含有2个5’-AACGTT-3’，2个5’-GTCGTC-3’，2个5’-GACGTT-3’，2个5’-ATCGAT-3’，1个5’-GTCGTT-3’，1个5’-GGCGTT-3’，1个5’-GACGTC-3’的特征序列。
CpG序列引物设计及合成5’端CGCTGCAGAACGTTGTC3’端CGCTGCAGAACGACATCG2、免疫用CpG寡聚核苷酸制备以合成的CpG序列为模版，利用PCR(多聚酶连链式反应)扩增，扩增产物溶解于灭菌生理盐水，用紫外分光光度计测其浓度。
3、CpG寡聚核苷酸体外刺激动物血液免疫细胞增殖反应体外培养猪、牦牛及黄牛的淋巴细胞，制备靶细胞，分别将CpG寡聚核苷酸、CpG寡聚核苷酸和大肠杆菌疫苗、CpG寡聚核苷酸和副伤寒疫苗加入靶细胞中，利用MTT法检测了该CpG寡聚核苷酸及其协同疫苗对动物免疫细胞增殖活性的影响，发现该CpG寡聚核苷酸及其协同疫苗均能显著刺激猪、牦牛及黄牛淋巴细胞的增殖活性。
4、纳米粒的制备利用离子交联法，以分子量150000，脱乙酰度95％以上的壳聚糖制备纳米包装颗粒，将CpG寡聚核苷酸按一定比例加入壳聚糖溶液，磁力搅拌使其充分混合，制备CpG寡聚核苷酸壳聚糖纳米颗粒，并测定了纳米粒的形态、粒径及Zeta电位。
结果显示制备的CpG寡聚核苷酸壳聚糖纳米颗粒表面带有正电荷，平均粒径为45nm；多分散度为0.190；zeta电位为+25.6mV。
5、CpG寡聚核苷酸壳聚糖纳米颗粒抗感染制剂的应用昆明鼠120只，随机分为8组，每组15只。其中4组为非特异性免疫组，4组为疫苗免疫组。以肌肉注射和口服两种方式免疫小鼠，口服组CpG寡聚核苷酸免疫剂量为30pmol/头小鼠，壳聚糖纳米颗粒包装组为6pmol/头动物；疫苗免疫组每只小鼠接种1/40头份以及相应CpG寡聚核苷酸30pmol或壳聚糖纳米颗粒包装的相应CpG寡聚核苷酸6pmol。五周后每只小鼠口服大肠杆菌K88和K99 0.4ml进行攻毒(3×109/ml)。
小鼠免疫前及免疫后每周自尾静脉采血，分离血清，检测了壳聚糖包装CpG寡聚核苷酸及未包装CpG寡聚核苷酸对小鼠的体液免疫(IgG、IgA及IgM的含量、特异性抗体的测定)和细胞免疫水平(细胞因子和外周血免疫细胞数量)的影响情况，并对常规疫苗在不同形式的CpG寡聚核苷酸分子免疫佐剂协同作用下细胞免疫和体液免疫应答的变化，进行了较为系统地分析。在小鼠免疫35天后，以大肠杆菌K88/K99口服攻毒实验小鼠，观察发病情况；49天时对所有小鼠进行解剖，观察各种器官的生理病变情况，检测免疫保护效应。
结果发现以CpG寡聚核苷酸壳聚糖纳米颗粒作为免疫增强剂时，小鼠的IgG、IgA、IgM含量和血清IL-2、IL-4、IL-6等细胞因子水平比对照组显著升高；同时，白细胞、淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞等免疫细胞数量也明显增加；与常规疫苗联合使用，同样可以显著提高实验动物的IgG、IgA、IgM含量，IL-2、IL-4、IL-6等细胞因子水平，免疫细胞数量；对疫苗的特异性免疫应答也显著加强。其中壳聚糖纳米颗粒包装CpG寡聚核苷酸注射组和口服组血清中IgG、IgA、IgM含量和细胞因子IL-2、IL-4、IL-6的增加尤为显著；与对照组相比，肌注未包装CpG寡聚核苷酸组体液免疫和细胞免疫的各项指标也有提高。壳聚糖纳米颗粒包装CpG寡聚核苷酸后，虽然DNA用量仅为未包装组的1/5，但免疫组体液免疫和细胞免疫应答水平显著提高，与对照组差异显著(P＜0.05)。虽口服壳聚糖纳米颗粒包装CpG寡聚核苷酸组小鼠各项免疫指标比对照组有显著增高，但其CpG寡聚核苷酸的用量比肌注壳聚糖包裹组的用量高5倍。
这些结果表明CpG寡聚核苷酸能显著提高小鼠的免疫应答水平，以壳聚糖纳米颗粒作为免疫投递系统，具有减少质粒用量、增强体液免疫和细胞免疫的优点。在应用中发现，口服免疫和肌肉注射的方式都能有效提高免疫小鼠对常规疫苗的免疫应答水平，两种方式的作用效果差异不大，但肌肉注射DNA剂量仅为口服免疫剂量的1/5时就能达到相近的增强效果。这些结果提示壳聚糖纳米颗粒包裹含免疫刺激序列CpG的寡聚核苷酸序列可提高机体细胞免疫和体液免疫水平，增强免疫应答及免疫保护力，可望作为有效的新型抗感染免疫调节剂，具有潜在的广泛应用前景。
图1CpG寡聚核苷酸壳聚糖纳米颗粒透射电镜图(放大倍数50000)图2壳聚糖纳米颗粒粒径分布图3非特异性免疫组小鼠血清中IgG含量图4非特异性免疫组小鼠血清中IgA含量图5非特异性免疫组小鼠血清中IgM含量图6非特异性免疫组小鼠血清中IL-2含量图7非特异性免疫组小鼠血清中IL-4含量图8非特异性免疫组小鼠血清中IL-6含量图9非特异性免疫组小鼠白细胞数量变化图10非特异性免疫组小鼠单核细胞数量变化图11非特异性免疫组小鼠淋巴细胞数量变化图12非特异性免疫组小鼠中性粒细胞数量变化图13疫苗免疫组小鼠血清中IgG含量图14疫苗免疫组小鼠血清中IgA含量图15疫苗免疫组小鼠血清中IgM含量图16疫苗免疫组小鼠血清中沙门氏菌特异性抗体含量图17疫苗免疫组小鼠血清中乙肝疫苗特异性抗体含量图18疫苗免疫组小鼠血清中大肠杆菌特异性抗体含量图19疫苗免疫组小鼠血清中IL-2含量图20疫苗免疫组小鼠血清中IL-4含量图21疫苗免疫组小鼠血清中IL-6含量图22疫苗免疫组小鼠白细胞数量变化图23疫苗免疫组小鼠单核细胞数量变化图24疫苗免疫组小鼠淋巴细胞数量变化图25疫苗免疫组小鼠中性粒细胞数量变化具体实施方式
1、CpG寡聚核苷酸序列及其引物的设计、合成CpG序列设计及合成CpG序列(见说明书第12页序列表)该序列含有11个CpG基序，其特点为含有2个5’-AACGTT-3’，2个5’-GTCGTC-3’，2个5’-GACGTT-3’，2个5’-ATCGAT-3’，1个5’-GTCGTT-3’，1个5’-GGCGTT-3’，1个5’-GACGTC-3’的特征序列。
Cp序列引物设计及合成5’端CGCTGCAGAACGTTGTC3’端CGCTGCAGAACGACATCG2、免疫用CpG寡聚核苷酸制备以合成的CpG序列为模版，利用PCR(多聚酶连链式反应)扩增，扩增产物溶解于灭菌生理盐水，用紫外分光光度计测其浓度。
3、CpG寡聚核苷酸体外刺激动物血液免疫细胞增殖反应无菌条件下取猪、牦牛及黄牛外周血，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离血液淋巴细胞。然后在6孔培养板中每孔加入2×107/ml单细胞悬液2ml，培养48h。制备靶细胞，用含20mg/ml α-MM的RPMI1640完全培养基调整靶细胞浓度为8×106/ml。96孔细胞培养板每孔加入靶细胞50ul，再分别加入CpG寡聚核苷酸(0.6μg/孔)，CpG寡聚核苷酸(0.6μg/孔)和大肠杆菌疫苗(1/500头份)，CpG寡聚核苷酸(0.6μg/孔)和副伤寒疫苗(1/500头份)，每个样品设4个重复孔，并设RPMI 1640完全培养基空白对照，置5％CO2、37℃细胞培养箱培养120h。MTT法检测CpG寡聚核苷酸及其协同疫苗对动物免疫细胞增殖活性的影响。
表1 CpG体外刺激动物血液免疫细胞增殖反应结果(OD570)
结果见表1。表1显示CpG，CpG和大肠杆菌疫苗，CpG和副伤寒疫苗三组处理均能显著刺激淋巴细胞的增殖，与对照组差异显著(P＜0.05)。其中，CpG和大肠杆菌疫苗的刺激效果最为明显，三组处理对猪淋巴细胞增殖刺激活性较强，对黄牛淋巴细胞增殖刺激活性次之，对牦牛淋巴细胞增殖刺激活性较弱，差异不显著(P＞0.05)。
4、纳米粒的制备以分子量150000，脱乙酰度95％以上的壳聚糖分散在1％醋酸溶液中(A液)；将CpG寡聚核苷酸溶解于三聚磷酸盐溶液(B液)。将A液、B液置于50℃水浴分别恒温20min，将DNA溶液按一定比例(氨基摩尔数与DNA的磷酸酯基摩尔数比)加入壳聚糖溶液，磁力搅拌使其充分混合，静置过滤得到粒径40-60nm的复合物微粒。即是CpG寡聚核苷酸壳聚糖纳米颗粒样品液。
5、纳米粒的形态、粒径及Zeta电位测定取少量CpG寡聚核苷酸壳聚糖纳米样品液于透射电子显微镜下观察纳米颗粒形态并拍照。另取纳米颗粒样品液适量，加双蒸水稀释后用Zetasizer3000HS/IHPL纳米粒度分析仪测定粒径、分散度及Zeta电位。
透射电镜观察结果表明壳聚糖纳米颗粒多呈球形(见说明书附1)。纳米粒度分析仪测定结果为平均粒径为45nm；多分散度为0.190(见说明书附2)；zeta电位为+25.6mV，说明纳米粒表面带有正电荷。
6、实验动物的免疫昆明鼠120只，随机分为8组，每组15只。其中4组为非特异性免疫组，4组为疫苗免疫组。采用肌肉注射法，通过注射小鼠两侧股四头肌免疫小鼠。
口服组CpG寡聚核苷酸免疫剂量为30pmol/头小鼠，壳聚糖纳米颗粒包装组为6pmol/头动物；疫苗免疫组每只小鼠接种1/40头份以及相应CpG寡聚核苷酸30pmol或壳聚糖纳米颗粒包装的相应CpG寡聚核苷酸6pmol。五周后每只小鼠口服大肠杆菌K88和K99 0.4ml进行攻毒(3×109/ml)。动物免疫分组见表2，表3。表2为非特异性免疫组分组情况，表3为疫苗免疫组分组情况。
表2 非特异性免疫小鼠分组组别 免疫程序A1CpG肌注接种组小鼠A2CNP包裹CpG肌注接种组小鼠B CNP包裹CpG口服接种组小鼠C 生理盐水注CNP壳聚糖纳米颗粒表3疫苗免疫小鼠分组组别 免疫程序YA1 CpG肌注接种组小鼠+疫苗YA2 CNP包裹CpG肌注接种组小鼠+疫苗YBCNP包裹CpG口服接种组小鼠+疫苗YC生理盐水+疫苗注CNP壳聚糖纳米颗粒7、壳聚糖纳米颗粒包装CpG寡聚核苷酸对小鼠非特异性免疫应答的影响小鼠免疫前及免疫后每周自尾静脉采血，分离血清，用以检测各项免疫指标。
(1)IgG、IgA及IgM的测定含量实验鼠血清分别作105(IgG)和104(IgM、IgA)稀释包被Costar酶标板，用特异性的兔抗鼠IgG、IgM和IgA重链抗体(美国Bethyl公司生产)作一抗，酶标羊抗兔IgG为二抗(华美生物工程公司)，TMB(四甲基联苯胺)为底物，测定小鼠血清中IgG、IgM和IgA含量。
结果见说明书附3、图4、图5。从图可见，小鼠在注射CpG寡聚核苷酸后，其血清中IgG、IgA、IgM含量比对照组有显著增高；其中壳聚糖纳米颗粒包装CpG寡聚核苷酸注射组和口服组血清中IgG、IgA、IgM含量的增加尤为显著；与对照组相比，肌注未包装CpG寡聚核苷酸组IgG、IgA、IgM含量也有提高。壳聚糖纳米颗粒包装CpG寡聚核苷酸后，虽然DNA用量仅为未包装组的1/5，但免疫组血清中的IgG、IgA、IgM含量仍显著提高，与对照组差异显著(P＜0.05)。虽口服壳聚糖纳米颗粒包装CpG寡聚核苷酸组小鼠血清中IgG、IgA、IgM含量比对照组有显著增高，但其CpG寡聚核苷酸的用量比肌注壳聚糖包裹组的用量高5倍。第6周大肠杆菌攻毒后，免疫组小鼠IgG、IgA、IgM较对照组血清中IgG、IgA、IgM含量有显著增加。
(2)细胞因子的检测小鼠免疫前及免疫后每周自尾静脉采血，实验鼠血清100倍稀释包被Costar酶标板，兔抗鼠IL2、IL4、IL6 IgG抗体(武汉博士德生物工程公司提供)为一抗，TMB(四甲基联苯胺)为底物，SABC法检测血清中IL2、IL4及IL6含量，观测小鼠细胞免疫应答情况。
结果见说明书附6、图7、图8。由图可知，CpG寡聚核苷酸免疫组小鼠血清中IL-2、IL-4和IL-6的含量均较对照组明显升高(P＜0.05)，壳聚糖纳米颗粒包装CpG寡聚核苷酸组与未包裹组相比，小鼠血清中IL-2、IL-4和IL-6的含量的提高幅度差异不显著(P＞0.05)。口服壳聚糖纳米颗粒包装CpG寡聚核苷酸也能有效提高血清中IL-2、IL-4和IL-6的含量。
(3)免疫小鼠外周血免疫细胞数量的动态变化小鼠免疫前及免疫后每周自尾静脉采血，常规法计白细胞总数；血涂片Giemsa染色，镜检分类计数中性粒细胞、单核细胞核、淋巴细胞。
结果见说明书附9、10、11、12。免疫小鼠外周血免疫细胞数量的动态变化是考察小鼠细胞免疫应答的一个重要指标。图5结果显示CpG寡聚核苷酸免疫小鼠后，免疫小鼠外周血白细胞、单核细胞、淋巴细胞数量较对照组都有显著增加，中性粒细胞在攻毒前也较对照组明显升高，但攻毒后中性粒细胞数量则较对照组低；用壳聚糖纳米微粒包装CpG寡聚核苷酸后免疫小鼠，发现在使用DNA量上减少5倍的情况下，可以同样达到的提高免疫细胞数量的效果。
8、壳聚糖纳米颗粒包装CpG寡聚核苷酸对疫苗特异性免疫应答的调节(1)IgG、IgA及IgM的测定含量实验鼠血清分别作105(IgG)和104(IgM、IgA)稀释包被Costar酶标板，用特异性的兔抗鼠IgG、IgM和IgA重链抗体(美国Bethyl公司生产)作一抗，酶标羊抗兔IgG为二抗(华美生物工程公司)，TMB(四甲基联苯胺)为底物，测定小鼠血清中IgG、IgM和IgA含量。
结果见说明书附13、14、15。图13、14、15显示了CpG寡聚核苷酸与乙肝疫苗、伤寒疫苗及大肠杆菌疫苗免疫小鼠后，小鼠血清中免疫球蛋白的变化情况。结果表明在同时免疫了CpG寡聚核苷酸后，实验动物的IgG、IgA、IgM含量比对照组有显著提高。其中壳聚糖纳米颗粒包装CpG寡聚核苷酸后，再与乙肝疫苗、伤寒疫苗及大肠杆菌疫苗联合注射小鼠，结果显示这种免疫方法虽然在DNA的使用量上只有未包装组的1/5，但是可以协同疫苗免疫，其IgG、IgA、IgM含量较对照组明显增加(P＜0.05)，与未包装免疫鼠差异不显著(P＞0.05)。口服与肌注壳聚糖纳米颗粒包装CpG寡聚核苷酸组血清中IgG、IgA、IgM含量增加幅度相似，但口服组DNA所需剂量大。
(2)特异性抗体的测定制备乙肝抗原、沙门氏菌抗原、大肠杆菌抗原包被Costar酶标板，实验鼠血清100倍稀释为一抗，TMB(四甲基联苯胺)为底物，SABC法测定小鼠血清中乙肝特异性抗体、伤寒特异性抗体、大肠杆菌特异性抗体含量。
结果见说明书附16、17、18。图16、17、18显示了乙肝疫苗、伤寒疫苗及大肠杆菌疫苗与相应CpG寡聚核苷酸联合免疫动物后实验动物特异性抗体变化情况。结果显示动物在免疫一周后，就检测到特异性抗体的产生；在同时免疫CpG寡聚核苷酸后，实验小鼠的上述特异性抗体比对照组显著提高(P＜0.05)。用壳聚糖纳米颗粒包装CpG寡聚核苷酸后与疫苗联合注射免疫小鼠，在核酸用量仅为未包装组1/5的情况下，CpG寡聚核苷酸对提高实验动物对疫苗特异性免疫应答效果同样显著。其中肌肉注射方式对乙肝疫苗、伤寒疫苗特异性抗体地提升效果较好，而对于大肠杆菌特异性抗体增加则是口服免疫的方式更能取得较好的特异性免疫应答结果。
(3)细胞因子的检测小鼠免疫前及免疫后每周自尾静脉采血，实验鼠血清100倍稀释包被Costar酶标板，兔抗鼠IL2、IL4、IL6 IgG抗体(武汉博士德生物工程公司提供)为一抗，TMB(四甲基联苯胺)为底物，SABC法检测血清中IL2、IL4及IL6含量，观测小鼠细胞免疫应答情况。
结果见说明书附19、20、21。图结果显示CpG寡聚核苷酸与乙肝疫苗、伤寒疫苗及大肠杆菌疫苗联合免疫小鼠后，小鼠血清中IL-2、IL-4和IL-6的含量较对照组高。用壳聚糖纳米颗粒包裹CpG寡聚核苷酸组与未包装组相比较，包装的DNA只有未包裹组1/5的用量，但是对免疫小鼠血清中IL-2、IL-4和IL-6的含量的提升作用稍强一些。口服组与肌注组的差异不显著(P＞0.05)。
(4)免疫小鼠外周血免疫细胞数量的动态变化小鼠免疫前及免疫后每周自尾静脉采血，常规法计白细胞总数；血涂片Giemsa染色，镜检分类计数中性粒细胞、单核细胞核、淋巴细胞。
结果见说明书附22、23、24、25。用乙肝疫苗、伤寒疫苗及大肠杆菌疫苗联合CpG寡聚核苷酸免疫小鼠，小鼠外周血免疫细胞数量的变化情况结果同样发现口服和肌肉注射CpG寡聚核苷酸均对实验小鼠外周血免疫细胞有较好的提升能力；只是攻毒后小鼠中性粒细胞数量较对照组稍低。用壳聚糖纳米颗粒包装CpG寡聚核苷酸，不仅可以将DNA用量减少至未包装用量的1/5，还有效增加了小鼠外周血免疫细胞数量。口服和肌肉注射的免疫方式均能有效增加免疫细胞的数量，但肌注的方式DNA用量较口服方式少4/5。
9、攻毒小鼠器官病变的检测小鼠免疫35天后，以大肠杆菌K88和K99口服攻毒实验小鼠，观察小鼠的生长情况；49天时用常规方法对所有小鼠进行解剖，观察各种器官的生理病变情况。
攻毒3周后剖解实验小鼠发现，CpG寡聚核苷酸接种小鼠均健康存活，肝、脾、十二指肠、等消化道和呼吸道组织器官未出现明显病变，而对照小鼠均发病，精神萎靡，被毛耸立，粪便稀软，带棕褐色；解剖观察发现，对照组小鼠均出现以胃、十二指肠、空肠粘膜等处出血、肝脾肿大等为主的病变。
10、数据分析上述各种数据均用方差分析进行差异显著性比较，以P＜0.05为差异显著性标准。
CpG序列表<110>四川今朝生物科技有限责任公司<120>CpG寡聚核苷酸抗感染DNA制剂的制备及应用技术<160>1<210>1<211>88<212>DNA<213>人工序列<220>
<400>1cgctgcagaa cgttgtcgtc aacgttgtcg tcaagcttga cgttatcgat ggcgttgacg 60ttgacgtcat cgatgtcgtt ctgcagcg88
权利要求
1.CpG寡聚核苷酸抗感染DNA制剂的制备及应用，其特点为利用壳聚糖包装CpG寡聚核苷酸制备DNA纳米颗粒制剂，并将此DNA制剂应用于抗感染增强猪、黄牛、牦牛等动物机体免疫应答的技术。
2.根据权利要求1所述的CpG寡聚核苷酸抗感染DNA制剂的制备，其特征在于所述的DNA制剂的基质是人工合成的含有CpG特征序列的寡聚核苷酸，该序列含有11个CpG基序，其特点为含有2个5’-AACGTT-3’，2个5’-GTCGTC-3’，2个5’-GACGTT-3’，2个5’-ATCGAT-3’，1个5’-GTCGTT-3’，1个5’-GGCGTT-3’，1个5’-GACGTC-3’的特征序列。。
3.根据权利要求1所述的CpG寡聚核苷酸抗感染DNA制剂的制备，其特征在于所述的DNA制剂的包裹材料是分子量为150000，脱乙酰度95％以上的壳聚糖。
4.使用权利要求1要求的壳聚糖包装CpG纳米颗粒作为猪、黄牛、牦牛等动物新型抗感染分子免疫调节剂的应用技术，其特征在于以下几方面(1)以小鼠为实验动物，将制备的壳聚糖CpG纳米颗粒以两种不同的投递方式(口服和肌注)免疫小鼠，比较了不同免疫途径对免疫效果的影响；(2)以制备的壳聚糖CpG纳米颗粒非特异性免疫实验动物，结果表明壳聚糖CpG纳米颗粒能有效提高实验动物细胞和体液免疫水平，增强其非特异性免疫力；(3)以制备的壳聚糖CpG纳米颗粒联合疫苗(乙肝疫苗、伤寒疫苗及大肠杆菌疫苗)共免疫实验动物，结果表明壳聚糖CpG纳米颗粒可显著增强实验动物对疫苗的细胞免疫和体液免疫应答反应。
全文摘要
本发明提供了一段能刺激动物免疫细胞增殖活性的CpG寡聚核苷酸序列，并提供了利用壳聚糖包装此段CpG寡聚核苷酸以制备抗感染DNA纳米颗粒制剂的方法，公开了该CpG纳米颗粒作为新型抗感染分子免疫增强剂的应用技术。该方法包括壳聚糖纳米颗粒包装CpG寡聚核苷酸，将此制备DNA纳米颗粒制剂以肌肉注射或口服的方式单独或协同疫苗免疫实验动物，检测实验动物的细胞和体液免疫指标，提供了壳聚糖纳米颗粒包装CpG寡聚核苷酸作为新型动物抗感染分子免疫增强剂的应用技术。
文档编号A61K9/14GK1720922SQ200410040209
公开日2006年1月18日 申请日期2004年7月14日 优先权日2004年7月14日
发明者武梅, 高荣, 吕学斌, 王泽洲, 李江凌, 李惠, 吴凯源, 付满良, 杨毅 申请人:四川今朝生物科技有限公司