专利名称：猪白细胞介素－2基因抗感染制剂的制备及应用的制作方法
技术领域：
1.生物技术 2.分子免疫学具体包括猪白细胞介素-2基因真核表达质粒的构建、壳聚糖纳米颗粒对藏猪白细胞介素-2基因真核表达质粒的分子包装及其增强动物免疫应答和免疫保护力的应用技术。
背景技术：
白细胞介素-2(IL-2)是细胞因子网络中关键性的细胞因子，主要由辅助T细胞、NK细胞和LAK细胞分泌；它能激活并促进T细胞、NK细胞、B细胞的分化成熟，诱导淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)活性，还能促进许多淋巴因子如干扰素，肿瘤坏死因子等的合成与释放以及抗体生成，显著增强机体免疫功能。IL-2已用于预防和治疗一些常规方法难以治疗的，如肿瘤、病毒感染等免疫抑制、免疫机能低下的疾病，如恶性黑色素瘤及肾细胞癌，其他肿瘤有神经胶质瘤、膀胱、卵巢肿瘤，视神经细胞癌、肺、头颈部、乳腺肿瘤、淋巴瘤、结肠癌及内皮癌等(Baigrie RJ，1992)。在兽医方面因其能提高疫苗的免疫效果，尤其是在基因工程亚单位苗的免疫效果而倍受重视，展现出广阔的应用前景。
IL-2跟IL-2R结合后才发挥作用，它与活化T细胞表面的IL-2Rα链、β链和γ链结合。首先β链和γ链结合成中等亲和力受体，再与低亲和力的α链受体结合，成为高亲和力受体。IL-2与三聚体结合后，发生信号传导，引起NK细胞与单核细胞的增殖反应及活化CTL。其中的信号传导机制尚不清楚，可能与一种酪氨酸激酶的激活相关。另外，IL-2Rα链易从细胞上脱落成可溶性IL-2Rα，可与细胞表面IL-2受体竞争型IL-2，对IL-2的生物学活性发挥起抑制作用。
IL-2的主要生物学活性包括1刺激T细胞生长IL-2最重要的作用是诱导T淋巴细胞增殖(从G0期进入S期)和分化。IL-2对T细胞的作用还包括增强CTL的细胞毒活性，增加细胞内pH，促进细胞移动，增强细胞间的接触和诱导细胞分泌细胞因子(IFN-γ、IL4、TNF和CSF等)。
2诱导细胞毒作用(1)接受了抗原预刺激信号的CD8+T细胞可以受IL-2的作用活化CTL，发挥细胞毒作用；在一定条件下，CD4+T细胞也可受IL-2的诱导而具有杀伤作用。
(2)NK细胞是唯一正常情况下表达IL-2R的淋巴细胞，因此始终对IL-2保持反应性。然而静止NK细胞上只表达IL-2R的β链和γ链，对IL-2的亲和力低，只能对高浓度的IL-2发生反应。一旦NK细胞活化，就表达IL-2R的α链，成为高亲和力的受体；大剂量IL-2诱导的LAK活性主要来源于NK细胞。
(3)使T细胞和NK细胞产生IFNγ、TNFβ和TGFβ等因子，促进非特异性细胞毒性；还可诱导产生某些B细胞生长因子以及造血因子等，从而发挥相应的生物学作用。
3对B细胞的作用IL-2对B细胞的生长及分化均有一定的促进作用。较高浓度的IL-2可诱导B细胞生长繁殖，促使抗体分泌，并诱使B细胞由分泌IgM向着分泌IgG2转换。
IL-2除了支持B细胞生长外，还能促进免疫球蛋白(IgM和IgG)的分泌，诱导J链合成从而加速IgM的装配和分泌。
4对巨噬细胞的作用高剂量的IL-2能激活单核巨噬细胞增殖和分化，并增强单核巨噬细胞杀伤肿瘤细胞的作用。单核-巨噬细胞受到IL-2的持续作用后，其抗原递呈能力、杀菌力、细胞毒性均明显增强，分泌某些细胞因子的能力也得到加强。
IL-2还能诱导NK细胞增殖，增强NK细胞的活性，诱导LAK细胞和TIL，并刺激它们产生细胞因子。
现在IL-2重组蛋白是应用较广泛的细胞因子免疫增强剂。重组人IL-2能提高伤寒杆菌活苗和荚膜多糖亚单位苗的免疫效果；重组牛IL-2与牛疱疹病毒I型活苗一起使用，血清中中和抗体滴度比单独使用疫苗组提高6倍；用牛疱疹病毒糖蛋白亚单位苗免疫牛，并注射IL-2，可显著提高特异性抗体滴度，特异性细胞毒反应和特异性淋巴细胞增殖反应；重组牛IL-1、IL-2能促进牛病毒性腹泻死苗的免疫效果；IL-2分别于狂犬病疫苗或疟疾疫苗联合使用，对相应抗原的攻击有保护作用。Ramshaw等(1981)、Flexner等(1987)先后报道将小鼠或人IL-2cDNA与含禽流感血凝素(HA)基因的痘病毒重组，获得表达IL-2的重组病毒。将这种重组病毒与不含IL-2基因的痘病毒同时接种裸鼠，结果显示，IL-2的插入并不影响HA的表达水平及免疫原性，但可以提高裸鼠的抗病力。Hazama等(Hazama et al.，1993)将IL-2基因与牛单纯性疱疹病毒糖蛋白D基因融合，真核细胞内表达融合蛋白，免疫小鼠后攻毒。结果该融合蛋白可以完全保护小鼠免疫病毒攻击，而以氢氧化铝为佐剂但不含IL-2的重组糖蛋白只产生部分保护，IL-2在体内的半衰期也因此延长大约4倍。这些结果表明采用此种方式获得，是研制新一代基因工程苗的另一途径。
rIL-2能显著增强人体免疫功能，只要每天注射10μg-100μg的rIL-2，四周后，NK细胞的高亲和受体即可从10％升至60-80％，能大大增强其免疫功能(Akuffo H，Kaplan G，etal.1990)，说明rIL-2是良好的免疫治疗因子，对维持人体正常健康以及防病治病有重要的作用。用逆转录病毒载体插入IL-2基因，再转化肝癌细胞株HAC，从而使之能持续分泌IL-2。将此IL-2基因转化了的HAC去接种大鼠腹腔或皮下，结果使动物生存期延长，田体积缩小，这些实验结果，说明IL-2的基因治疗在动物模型实验中取得了明显的效果(王立群，郑仲承，1996)。
rIL-2对感染性疾病有较好的治疗作用。rIL-2对麻疯病的治疗有很好的疗效，每天注射两次，每次10μg，经8天的疗效，可相当于WHO使用MDT一年的疗效；有人发现，rIL-2对结核杆菌(TB)有很强的抑制作用，对小鼠接种TB5或15天后，每天肌肉注射0.5-1.0万IU的rIL-2共10天，然后观察脾脏中TB细菌数目，结果rIL-2对TB的抑制作用能达到99％(Flexner C，Hugin A，et al，1987)；近年来性病有蔓延趋势，尖锐湿疣过去在性病中居第4位，现在上海的统计上升到第二位，它是由乳头状瘤病毒感染所致，可用激光治疗，但复发率高达30-60％，用rIL-2合剂肌肉注射与激光治疗相结合，可完全防止复发，疗效几乎100％。对AIDS病患者，使用低剂量rIL-2(10万IU/天)，治疗一个月，也获得一定的效果。rIL-2对严重结合免疫缺陷症(SCID)也有一定疗效(McElrach MJ，et al，1990)。
以上rIL-2的治疗作用，均由于rIL-2增强免疫功能所致，也证明用小剂量rIL-2能增强免疫功能，可产生良好的疗效。
rIL-2对肿瘤有较强的治疗作用。肌注rIL-2能增强癌症患者的免疫功能。在rIL-2的临床癌症患者中，大部份患者的免疫功能经rIL-2治疗而增强，rIL-2的这种免疫功能对防止癌症患者在手术、放化疗后的复发，转移而延长病人生命，有一定的作用。rIL-2与LAK合用治疗癌症，两者疗效均达50％，采用局部动脉灌注rIL-2及异体LAK，治疗肝癌、肺癌、胃癌、结肠癌、卵巢癌、肾癌共268人，灌注682例次，总有效率36.5％(肝癌38％)，症状改善率68.3％(肝癌70％以上)。
此外，IL-2有明显的镇痛作用。实验结果表明结果IL-2的镇痛作用非常明显(Li JZ，ZhouDH，et al.1993)，用电生理方法也得到证实(Zhao ZQ，Yang XY.1994)。故IL-2的镇痛现象，已明确无误，在临床应用IL-2时，它一般能使病人疼痛症状减轻，生活指标提高，可能与IL-2的这一镇痛作用有关。
总之，白细胞介素-2(interleukin 2，IL2)具有广泛的生物学活性，对免疫系统和免疫应答具有十分重要的调节效应，已在抗肿瘤与病毒病方面显示较好的疗效。在动物医学上因其能提高疫苗的免疫效果，尤其是在基因工程亚单位苗的免疫应答而倍受重视，显示出广阔的应用前景。但直接注射IL2时，因其体内的存留时间较短，大剂量重复给药不仅费用高，而且常伴有较重的毒副作用，因而寻找高效安全、效应持久和经济价廉的新型实用制剂，一直是研究IL2等细胞因子提高机体免疫应答的热点应用研究领域。
壳聚糖是天然生物多糖甲壳质的脱乙酰基衍生物，具有很好的生物相容性、可被体内多种酶类降解、降解产物安全无毒，并能被生物体完全吸收；而且由于其具有独特的聚阳离子特性，已有的研究结果显示它是一种具有很大潜力的缓释材料。近年来，在基因转染表达研究领域已出现了基于壳聚糖的纳米颗粒系统。大量研究表明，壳聚糖可包裹浓缩DNA，形成小的分散颗粒，将壳聚糖DNA复合物用于基因运载和转染表达时，能有效携带目的基因进入靶细胞中。包封于壳聚糖颗粒中的物质，其释放率主要决定于壳聚糖的生物降解和溶蚀，因此物质释放明显延长。初步研究结果发现基于壳聚糖的颗粒系统在生物医学方面具有广阔的应用前景。此外，壳聚糖还具有多种生物学功能，尤其是可作为药物增效剂。
由于壳聚糖纳米颗粒良好的生物相容性使其在DNA制剂的包裹应用中显示了广阔的前景，因此利用壳聚糖纳米颗粒包装VRIL2制备DNA制剂，并将其应用于提高机体细胞和体液免疫水平、增强抗感染能力的应用技术，在科研，医疗，动物保健，和产业化方面具有潜在的巨大价值。
本发明首次制备了包裹猪IL2基因(VPIL2)的壳聚糖纳米颗粒分子，以其分子包装猪IL2基因真核表达质粒VPIL2，发现对动物免疫机能和免疫保护效应有显著的增强作用，可用作高效安全和效应持久的新型动物免疫增强剂。
发明内容
本发明所要解决的技术问题具体包括猪白细胞介素-2基因真核表达质粒的构建、壳聚糖纳米颗粒对猪白细胞介素-2基因真核质粒的分子包装及其增强动物免疫应答和免疫保护力的应用技术。主要包括下列步骤1、猪白细胞介素2基因的克隆应用淋巴细胞分离技术，分离了藏猪外周血液淋巴细胞进行体外培养，在Con A的刺激下培养24-72h后，提取培养的淋巴细胞总RNA，应用RT-PCR扩增出藏猪淋巴细胞白细胞介素-2基因的cDNA，克隆到pMD18-T载体上，并进行了序列分析；将得到的序列在GenBank和EMBL数据库中进行了同源比较，证实本实验克隆到了藏猪白细胞介素-2的cDNA。
2、藏猪白细胞介素2基因的真核表达与活性检测将猪白细胞介素2基因亚克隆到真核分泌型表达载体VR1020上，命名为VRIL-2；猪淋巴母细胞增殖实验证明VRIL-2在转染Cos7细胞株后，能够表达出有生物活性的IL-2，可刺激猪淋巴母细胞显著增殖；此结果表明已成功构建了能正确表达TPIL-2的真核表达质粒，其表达产物具有正常的生物学活性，为研究其体内基因转移表达的免疫调节作用奠定了坚实基础。
3、壳聚糖纳米颗粒的制备和分子包装将壳聚糖溶液(pH5.5)和VRIL2质粒(含适当浓度三聚磷酸盐)溶液分别50℃水浴恒温20min，均匀混合质粒溶液和壳聚糖溶液5min，即得VRIL2质粒壳聚糖纳米颗粒样品液。取少量质粒壳聚糖纳米样品液于透射电子显微镜下观察纳米颗粒形态并拍照。另取纳米颗粒样品液适量，加双蒸水稀释后用Zetasizer 3000HS/IHPL纳米粒度分析仪测定粒径、分散度及Zeta电位，结果发现本法获得的颗粒直径主要在40-60nm之间，颗粒的zeta电位达到+25.6mV，表明所制备的CNP成功完成了VRIL2的分子包装。
4、藏猪白细胞介素-2基因抗感染制剂的应用试验动物用昆明鼠120只，随机分为8组，每组15只。采用肌肉注射法，通过注射小鼠两侧股四头肌免疫小鼠。注射裸质粒免疫组每只小鼠接种相应质粒30pmol；注射壳聚糖包装质粒的免疫组每只小鼠接种相应包装的质粒6pmol。5周后每只小鼠口服大肠杆菌K88和K99 0.4ml进行攻毒(3×109/ml)。大肠杆菌、沙门氏菌和猪蓝耳病疫苗特异性小鼠分组见表1，每组小鼠均按猪免疫剂量1/50股外侧肌肉注射免疫。非特异免疫小鼠分组除不注射疫苗外，其它均以特异疫苗免疫组相同。
小鼠免疫前及免疫后每周自尾静脉采血，分离血清，用以检测体液免疫应答(IgG、IgA及IgM的含量、特异性抗体的测定)、细胞免疫反应(细胞因子和外周血免疫细胞数量)的动态变化；并在小鼠免疫35天后，以大肠杆菌K88/K99口服攻毒实验小鼠，观察发病情况；49天时对所有小鼠进行解剖，观察各种器官的生理病变情况，检测免疫保护效应。
本研究首次将猪白细胞介素-2基因用壳聚糖纳米颗粒包装后通过肌肉注射的方式免疫小鼠，检测了壳聚糖包装猪白细胞介素-2基因及未包装猪白细胞介素-2基因对小鼠的体液免疫和细胞免疫水平的影响情况，并对常规疫苗在不同的形式的猪白细胞介素-2基因分子免疫佐剂协同作用下细胞免疫和体液免疫应答的变化，进行了较为系统的分析。结果显示猪白细胞介素-2基因能显著提高小鼠的免疫应答水平，以壳聚糖纳米颗粒作为免疫基因包装分子，具有减少质粒用量、增强体液免疫和细胞免疫的优点。
在应用中发现，猪白细胞介素-2基因裸质粒和壳聚糖包装猪白细胞介素-2基因质粒肌肉注射的方式都能有效提高免疫小鼠对常规疫苗的免疫应答水平，两种方式的作用效果差异不大。CNP包裹组的质粒用量仅为未包裹组的1/5，但获得了与VRIL2直接免疫组相似或较强的免疫应答反应，其原因可能是壳聚糖纳米颗粒包裹质粒DNA后，有效地防止了VRIL2被体内其它组织蛋白的吸附和体液核酸酶对DNA的降解，同时又促进VRIL2进入细胞，使质粒DNA缓慢释放，将目的基因DNA转运到靶细胞中，发挥基因转录表达，分泌更多的细胞因子，增强对免疫应答的上调效应，提高体液和细胞免疫水平。这在将来的实际应用上有较大的价值，意味着较少的质粒用CNP包裹后也可刺激较强的免疫反应，减少质粒用量，降低成本。这些结果提示壳聚糖纳米颗粒包裹猪白细胞介素-2基因接种可提高机体细胞免疫和体液免疫水平，增强免疫应答及免疫保护力，可望作为猪的新型高效抗感染免疫调节剂，具有潜在的广泛应用前景。
图1a 壳聚糖纳米颗粒透射电镜图(×50000)图1b 壳聚糖纳米颗粒粒径分布图2a TPIL-2 RT-PCR电泳图谱(1.0％琼脂糖凝胶)1DL2,000 MTPIL-2cDNA图2b pMTPIL-2酶切电泳图谱(1.0％琼脂糖凝胶)Lane1DL2000marker Lane2BamHI/EcoRI消化 Lane3BamHI消化Lane4EcoRI消化 Lane5空质粒图2.c 真核表达RT-PCR电泳图谱(1.0％琼脂糖凝胶)1DL2,000marker 2VR1020对照 324h 448h 572h表达产物图3a 疫苗免疫组小鼠血清中沙门氏菌特异性抗体含量图3b 疫苗免疫组小鼠血清中大肠杆菌特异性抗体含量图3c 疫苗免疫组小鼠血清中蓝耳病特异性抗体含量图4a 疫苗免疫组小鼠血清中IgG含量图4b 疫苗免疫组小鼠血清中IgM含量图4c 疫苗免疫组小鼠血清中IgA含量图5a 疫苗免疫组小鼠血清中IL-2含量图5b 疫苗免疫组小鼠血清中IL-4含量图5c 疫苗免疫组小鼠血清中IL-6含量图6a 疫苗免疫组小鼠白细胞数量变化图6b 疫苗免疫组小鼠单核细胞数量变化图6c 疫苗免疫组小鼠淋巴细胞数量变化图6d 疫苗免疫组小鼠中性粒细胞数量变化图7a 非特异免疫组小鼠血清中IgA含量图7b 非特异免疫组小鼠血清中IgG含量图7c 非特异免疫组小鼠血清中IgM含量图7d 非特异免疫组小鼠血清中大肠杆菌特异性抗体含量图8a 非特异免疫组小鼠血清中IL-2含量图8b 非特异免疫组小鼠血清中IL-4含量图8c 非特异免疫组小鼠血清中IL-6含量图9a 非特异免疫组小鼠白细胞数量变化图9b 非特异免疫组小鼠淋巴细胞数量变化图9c非特异性免疫组小鼠单核细胞数量变化图9d 非特异免疫组小鼠中性粒细胞数量变化
具体实施例方式
1、藏猪IL2基因(TPIL-2基因)的克隆从健康藏猪耳静脉无菌采血10mL，分离藏猪外周血淋巴细胞，加入10ug/ml Con A刺激，在CO2培养箱中37℃培养72h，分时段(24、48、70h)提取藏猪总RNA，设计一对藏猪IL-2基因cDNA扩增引物。引物序列如下引物1CGGGATCCCAG TAA CCT CAA CTC CTG CCA CAAT，引物2GCCAA TTCCAA GTC AGT GTT GAG TAG ATG CTTT。
以总RNA为模板，在50μl反应体系中加10×RT-PCR反应缓冲液5μl，25mM MgCl210μl，10mM dNTP5μl，RNase Inhibitor(40units/μl)1μl，AMV RNase XL(5units/uL)1μl，AMV-Optimized Taq(5units/uL)1μl，5′和3′引物各20uM，总RNA1~2μl，补水至50μl。RT-PCR循环参数为50℃，30min；94℃，2min，然后进行30个PCR循环(94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s)后继续在72℃延伸10min，4℃保存。
回收cDNA片段，克隆到pMD-T18载体中，转化感受态细胞，筛选和鉴定含重组质粒的菌落，小规模提取质粒DNA，酶切及电泳观察质粒DNA，确定重组质粒中的插入片段的大小同目的片段的大小一样后(附图2a.b)，进行序列测定。序列测定结果采用DNAtools 5.1进行分析。
用M13通用引物对含有目的基因片断的pMTPIL-2质粒进行正反向测序，通过重叠序列的拼接，得到了完整的TPIL-2基因的cDNA序列，并用DNAtools 5.1对其编码氨基酸进行了分析，发现其ORF为465个碱基，编码154个氨基酸，分子量为17.4kD。
2、藏猪IL2基因真核表达质粒的构建及表达活性检测提取VR1020质粒，经BamHI/BglII酶切后，加入回收的BamHI/BglII酶切的TPIL-2cDNA片段2μl，1μl T4DNA连接酶16℃水浴过夜连接。转化的菌落与含50μg/ml Amp的LB培养基上，37℃过夜培养。然后通过重组子的快速鉴定，经过质粒大小的比较，选取有插入片断的菌落，提取质粒，用BamHI/BglII分别做双酶切筛选鉴定重组子，证实获得TPIL2的真核表达质粒-VRIL2(见附图2c)。
使用法国PT公司的JetPEITM细胞转染试剂进行质粒DNA转染Cos7细胞实验，参照试剂说明书进行。培养48小时，检测基因表达产物活性。以RT-PCR检测基因在真核细胞中表达；制备猪淋巴母细胞，MTT比色法检测TPIL-2生物学活性，分别使用转染后24小时、36小时和72小时细胞培养液上清进行分析，结果发现VTPIL-2重组质粒真核表达产物对猪淋巴细胞均有显著的增殖刺激活性，24h表达样品(OD5700.284)、36h表达样品(OD5700.431)和72h表达样品(OD5700.496)均明显高于VR1020对照孔的OD5700.067(P＜0.01)；这些证明，VTPIL-2能在真核细胞正确转染表达具有生物学活性的TPIL-2，对猪淋巴细胞具有增殖免疫激活作用。
3、壳聚糖纳米颗粒的制备和包装VRIL2质粒分子用离子交联法制备质粒壳聚糖纳米颗粒。将壳聚糖溶液(pH5.5)和VRIL2质粒(含适当浓度三聚磷酸盐)溶液50℃水浴分别恒温20min，然后均匀混合质粒溶液和壳聚糖溶液5min，即得VRIL2质粒壳聚糖纳米颗粒样品液。取少量质粒壳聚糖纳米样品液于透射电子显微镜下观察纳米颗粒形态并拍照。另取纳米颗粒样品液适量，加双蒸水稀释后用Zetasizer 3000HS/IHPL纳米粒度分析仪测定粒径、分散度及Zeta电位。
透射电镜观察结果表明壳聚糖纳米颗粒多呈球形(见说明书附1)。纳米粒度分析仪测定结果为平均粒径为45nm；多分散度为0.190，表明纳米颗粒直径较均匀(见说明书附2)；颗粒的zeta电位达到+25.6mV，说明这种纳米颗粒比较稳定，能有效地包裹带大量负电荷的质粒分子，有利于颗粒分子进入细胞。凝胶阻滞实验也发现VRIL2几乎全部被CNP所包裹。这些表明本实验成功地制备了CNP，完成了VRIL2的分子包装。
4、壳聚糖纳米颗粒包装猪白细胞介素-2基因对疫苗特异性免疫应答的调节试验动物分组昆明鼠60只，随机分为4组，每组15只。采用肌肉注射法，通过注射小鼠两侧股四头肌免疫小鼠。
注射裸质粒免疫组每只小鼠接种相应质粒30pmol注射壳聚糖包装质粒的免疫组每只小鼠接种相应包装的质粒6pmol。5周后每只小鼠口服大肠杆菌K88和K99 0.4ml进行攻毒(3×109/ml)。大肠杆菌、沙门氏菌和猪蓝耳病疫苗特异性小鼠分组见表1，每组小鼠均按猪免疫剂量1/50股外侧肌肉注射免疫。
表1 疫苗免疫小鼠分组组别 免疫程序A1裸VRIL2肌注接种小鼠+疫苗A2CNP包裹VRIL2肌注接种小鼠+疫苗C1CNP包裹VR1020肌注接种组小鼠+疫苗C2裸VR1020肌注接种组小鼠+疫苗注CNP壳聚糖纳米颗粒体液免疫反应的检测小鼠免疫前及免疫后每周自尾静脉采血，分离血清，用以检测体液免疫反应。
IgG、IgA及IgM的含量测定实验鼠血清分别作105(IgG)和104(IgM、IgA)稀释包被Costar酶标板，用特异性的兔抗鼠IgG、IgM和IgA重链抗体(美国Bethyl公司生产)作一抗，酶标羊抗兔IgG为二抗(华美生物工程公司)，TMB(四甲基联苯胺)为底物，测定小鼠血清中IgG、IgM和IgA含量。
特异性抗体的测定制备K88和K99大肠杆菌、沙门氏菌和蓝耳病病毒抗原，分别用折3种抗原包被Costar酶标板，实验鼠血清100倍稀释为一抗，TMB(四甲基联苯胺)为底物，SABC法(武汉博士德公司生产)测定小鼠免疫5周攻毒后血清中抗大肠杆菌、沙门氏菌和蓝耳病病毒特异性抗体含量。
细胞因子的检测小鼠免疫前及免疫后每周自尾静脉采血，实验鼠血清100倍稀释包被Costar酶标板，兔抗鼠IL2、IL4、IL6 IgG抗体(武汉博士德生物工程公司提供)为一抗，TMB(四甲基联苯胺)为底物，SABC法检测血清中IL2、IL4及IL6含量，观测小鼠细胞免疫应答情况。
免疫小鼠外周血免疫细胞数量的动态变化小鼠免疫前及免疫后每周自尾静脉采血，常规法计白细胞总数；血涂片Giemsa染色，镜检分类计数中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞。
免疫保护效应的检测小鼠免疫35天后，以大肠杆菌K88/K99口服攻毒实验小鼠，观察生长情况；49天时用常规方法对所有小鼠进行解剖，观察各种器官的生理病变情况。
数据分析上述各种数据均用方差分析进行差异显著性比较，以P＜0.05为差异显著性标准。
实验结果(1)小鼠血清中特异性抗体含量测定结果见说明书附3。图3(a)(b)(c)显示了伤寒疫苗、大肠杆菌和蓝耳病疫苗、与相应VRIL2联合免疫后实验动物特异性抗体变化情况。结果显示小鼠在免疫一周后，就检测到特异性抗体的产生；在同时免疫VRIL2后，实验小鼠的上述特异性抗体比对照组显著提高(P＜0.05)。用壳聚糖纳米颗粒包装VRIL2后与疫苗联合注射免疫小鼠，在核酸用量仅为未包装组1/5的情况下，VRIL2对提高实验动物对疫苗特异性免疫应答效果同样显著；其中肌肉注射对蓝耳病疫苗、大肠杆菌、伤寒疫苗特异性抗体水平的明显提高。
(2)小鼠血清IgG、IgM、IgA含量测定结果见说明书附4。图4(a)(b)(c)显示了VRIL2与蓝耳病疫苗、伤寒疫苗及大肠杆菌疫苗免疫小鼠后血清中免疫球蛋白的变化情况。结果表明在同时免疫了VRIL2后，实验动物的IgG、IgA与IgM含量均比对照组显著增多(P＜0.05)。其中壳聚糖纳米颗粒包装VRIL2后，再与蓝耳病疫苗、伤寒疫苗及大肠杆菌疫苗联合注射小鼠，虽然在DNA的使用量上只有未包装组的1/5，但其IgG、IgA、IgM含量较对照组明显增加(P＜0.05)，与未包装免疫鼠差异不显著(P＞0.05)。
(3)血清中细胞因子的检测结果见说明书附5。图5(a)(b)(c)结果表明VRIL2与蓝耳病疫苗、伤寒疫苗及大肠杆菌疫苗联合免疫小鼠后，小鼠血清中IL-2、IL-4和IL-6的含量较对照组高。用壳聚糖纳米颗粒包裹VRIL2组与未包装组相比较，包装的DNA只有未包裹组1/5的用量，但是对免疫小鼠血清中IL-2、IL-4和IL-6的含量的提升作用较明显。
(4)免疫小鼠外周血免疫细胞数量的动态变化结果见说明书附6。用蓝耳病疫苗、伤寒疫苗及大肠杆菌疫苗联合VRIL2免疫小鼠，小鼠外周血免疫细胞数量的变化情况(见图6(a)(b)(c))。结果同样发现肌肉注射VRIL2均对实验小鼠外周血免疫细胞有较好的提升能力；只是攻毒后小鼠中性粒细胞数量较对照组稍低。用壳聚糖纳米颗粒包装VRIL2，不仅可以将DNA用量减少至未包装用量的1/5，还有效增加了小鼠外周血免疫细胞数量。
6、壳聚糖纳米颗粒包装猪白细胞介素-2基因对小鼠非特异性免疫应答的影响试验动物分组昆明鼠60只，随机分为4组，每组15只，非特异免疫小鼠分组见表2。采用肌肉注射法，通过注射小鼠两侧股四头肌免疫小鼠；注射裸质粒免疫组每只小鼠接种相应质粒30pmol；注射壳聚糖包装质粒的免疫组每只小鼠接种相应包装的质粒6pmol。5周后每只小鼠口服大肠杆菌K88和K99 0.4ml进行攻毒(3×109/ml)，观察各试验动物的免疫抗病力变化。
表2 非特异免疫小鼠分组组别免疫程序A1 裸VRIL2肌注接种小鼠B1 CNP包裹VRIL2肌注接种小鼠C1 CNP包裹VR1020肌注接种组小鼠C2 裸VR1020肌注接种组小鼠注CNP壳聚糖纳米颗粒动物接种包装质粒制剂后免疫机能的变化检测免疫小鼠体液免疫反应的检测(IgG、IgA及IgM的含量、特异性抗体的测定)细胞因子的检测和外周血免疫细胞数量的动态变化均与上述特异性免疫应答试验相同。
免疫保护效应的检测小鼠免疫35天后，以大肠杆菌K88/K99口服攻毒实验小鼠，观察生长情况；49天时用常规方法对所有小鼠进行解剖，观察各种器官的生理病变情况。
数据分析上述各种数据均用方差分析进行差异显著性比较，以P＜0.05为差异显著性标准。
实验结果(1)小鼠血清IgG、IgM、IgA含量和攻毒后特异性抗体的测定结果见说明书附7。从图7(a)(b)(c)(d)可见，小鼠在注射VRIL2后，其血清中IgG、IgA、IgM含量比对照组显著增高；其中壳聚糖纳米颗粒包装VRIL2注射组血清中IgG、IgA、IgM含量的增加尤为显著；与对照组相比，肌注未包装VRIL2组IgG、IgA、IgM含量也有提高。壳聚糖纳米颗粒包装VRIL2后，虽然DNA用量仅为未包装组的1/5，但免疫组血清中的IgG、IgA、IgM含量仍显著提高，与对照组差异显著(P＜0.05)。第6周大肠杆菌攻毒后，免疫组小鼠IgG、IgA、IgM较对照组血清中IgG、IgA、IgM含量显著增加(P＜0.05)；大肠杆菌特异性抗体水平也明显高于空白质粒对照组小鼠(P＜0.05)。
(2)血清中细胞因子的检测结果见说明书附8。由图8(a)(b)(c)可知，VRIL2免疫组小鼠血清中IL-2、IL-4和IL-6的含量均较对照组明显升高(P＜0.05)，壳聚糖纳米颗粒包装VRIL2组与未包裹组相比，小鼠血清中IL-2、IL-4和IL-6的含量的提高幅度差异不显著(P＞0.05)。
(3)免疫小鼠外周血免疫细胞数量的动态变化结果见说明书附9。免疫小鼠外周血免疫细胞数量的动态变化是考察小鼠细胞免疫应答的一个重要指标。图9结果显示VRIL2免疫小鼠后，免疫小鼠外周血白细胞、单核细胞、淋巴细胞数量较对照组都有显著增加，中性粒细胞在攻毒前也较对照组明显升高，但攻毒后中性粒细胞数量则较对照组低(P＜0.05)；用壳聚糖纳米微粒包装VRIL2后免疫小鼠，发现在使用DNA量减少5倍的情况下，可以达到同样的提高免疫细胞数量的效果。
攻毒小鼠免疫保护率的观察免疫后35天以致病性大肠杆菌口服攻击实验小鼠，攻毒3周后剖解实验小鼠和检测免疫学变化；结果发现CNP包裹VRIL2组小鼠的细胞和体液免疫应答均显著强于对照小鼠，VRIL2接种小鼠活动如常，均健康存活，3周后剖解消化道和呼吸道均未见明显的眼观病变。而对照小鼠均发病，精神委顿，行动迟缓、被毛耸立；剖解后发现胃、十二指肠、空肠粘膜等处出血、肝脾肿大等病变。这些结果显示壳聚糖纳米颗粒包裹VRIL2接种能显著增强小鼠对大肠杆菌感染的免疫抵抗力，提高其免疫保护率。
<110>四川今朝生物科技有限责任公司<120>藏猪白细胞介素-2抗感染DNA制剂的制备及应用<160>1<210>1<211>465<212>DNA<213>藏猪(Tibet Sus scrofa)<220>
<400>1atgtataaga tgcagctctt gtgttgcatt gcactaaccc ttgcactcat ggcaaacggt 60gcacctactt caagctctac aaagaacaca aagaaacaac tggagccatt gctgctggat 120ttacagttgc ttttgaagga agttaagaat tacgagaatg ctgatctctc caggatgctc 180acatttaaat tttacatgcc caagcaggct acagaattga aacaccttca gtgtttagta 240gaagaactca aagctctgga gggagtgcta aatttaggtc aaagcaaaaa ctctgactca 300gcaaatatca aggaatcaat gaacaatatc aacgtaacag ttttggaact aaagggatct 360gaaacaagtt tcaaatgtga atatgatgat gagacagtaa ctgctgttga atttctgaac 420aaatggatta ccttttgtca aagcatctac tcaacactga cttga 46权利要求
1.猪白细胞介素-2基因抗感染制剂的制备及应用，其特点为包括猪白细胞介素-2基因真核表达质粒的构建、壳聚糖纳米颗粒对猪白细胞介素-2基因真核表达质粒的分子包装、此DNA制剂应用于猪增强机体免疫应答及抗感染免疫力的应用技术。
2.根据权利要求1所述的猪白细胞介素-2基因抗感染制剂的制备，其特征在于所述的猪白细胞介素-2基因构建入VR1020真核表达质粒。
3.根据权利要求1所述的猪白细胞介素-2基因真核表达质粒的制备，其特征在于所述的DNA制剂的包裹材料是分子量为150000，脱乙酰度95％以上的壳聚糖，用离子交联法制备质粒壳聚糖纳米颗粒分子。
4.使用权利要求1要求的壳聚糖纳米分子包装猪白细胞介素-2基因表达质粒作为新型动物抗感染基因分子免疫调节剂的应用技术，其特征在于以下几方面a)将制备的猪白细胞介素-2基因表达质粒纳米颗粒以肌注方式免疫动物，比较了对细胞和体液免疫应答水平的影响；b)以制备的壳聚糖纳米颗粒猪白细胞介素-2基因表达质粒接种动物，结果表明该纳米颗粒基因制剂能有效提高实验动物非特异性细胞和体液免疫水平，增强其非特异性免疫力；c)以制备的猪白细胞介素-2基因表达质粒纳米颗粒联合疫苗(猪蓝耳病疫苗、伤寒疫苗及大肠杆菌疫苗)共免疫实验动物，结果表明壳聚糖纳米颗粒猪白细胞介素-2基因表达质粒可显著促进动物对疫苗的细胞免疫和体液免疫应答反应，增强动物的免疫抗病能力。
全文摘要
本发明公开猪白细胞介素－2基因抗感染DNA制剂的制备及应用技术。用离子交联法制备质粒壳聚糖纳米颗粒，将猪白细胞介素－2基因真核质粒(VPIL2)溶解于三聚磷酸盐溶液与分子量150000，脱乙酰度95％以上的壳聚糖醋酸溶液50℃水浴分别恒温20min，然后按适当比例均匀混合质粒溶液和壳聚糖溶液5min，得到VPIL2质粒壳聚糖纳米颗粒液，粒径40－60nm，Zeta电位+25.6mv，无细胞毒性，能抵抗核酸酶对DNA的降解。以壳聚糖纳米颗粒包装VPIL2质粒，将此DNA纳米颗粒制剂以肌肉注射的方式单独或协同疫苗免疫实验动物，可显著提高试验动物的细胞和体液免疫应答水平，明显增强试验动物的抗感染免疫保护力，提供了壳聚糖纳米颗粒包装VPIL2质粒作为新型动物抗感染分子免疫增强剂的应用技术。
文档编号A61P37/00GK1720998SQ200410040210
公开日2006年1月18日 申请日期2004年7月14日 优先权日2004年7月14日
发明者高荣, 武梅, 李惠, 王泽洲, 李江凌, 吕学斌, 吴凯源, 付满良, 杨毅, 王丽焕 申请人:四川今朝生物科技有限公司