专利名称：一种慢性乙型病毒性肝炎相关基因nlrx1的新突变蛋白、编码基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程及医学技术领域，具体涉及一种慢性乙型病毒性肝炎相关基因的新突变蛋白、编码基因及其应用。
背景技术：
慢性乙型病毒性肝炎(慢性乙肝)是由乙型肝炎病毒(HBV)感染而引起的以肝脏损害为主要表现的传染性疾病，是关系到我国乃至全球公共卫生的重大疾病。宿主的遗传背景在其易感性及免疫应答中起重要作用。而人群对乙肝免疫力的高低存在明显的个体差异。中国专利200810004159. 5公开了一种与肝细胞癌相关的乙型肝炎病毒基因组标志物以及预测HBV感染个体发展成肝细胞癌(HCC)的遗传素因的试剂盒。该试剂盒包括一种或更多种探针，当其与HBV基因组接触时，如果所述基因组为NLRXl基因型、且包括至少一种对应于某段核苷酸序列上的核苷酸(170C;和/或2170G2;和/或对41(;和/或799G) 时会选择性地与所述基因组杂交。
发明内容
本发明的目的在于提供一种慢性乙型病毒性肝炎相关基因的新突变蛋白。本发明的另一目的是提供上述慢性乙型病毒性肝炎相关基因的新突变蛋白的编码基因。本发明的又一目的是提供上述慢性乙型病毒性肝炎相关基因NLRXl的新突变蛋白、该突变蛋白的编码基因的应用。本发明通过以下技术方案实现上述目的
一种慢性乙型病毒性肝炎相关基因的新突变蛋白，是在慢性乙型病毒性肝炎相关基因NLRXl蛋白的氨基酸序列第707位精氨酸Arg突变为半胱氨酸Cys，本发明中用 p. Arg707Cys 表不。上述慢性乙型病毒性肝炎相关基因的新突变蛋白，氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。上述慢性乙型病毒性肝炎相关基因的新突变蛋白的编码基因。该编码基因的核苷酸序列优选如SEQ ID N0:2所示。慢性乙型病毒性肝炎相关基因的新突变蛋白在制备慢性乙型病毒性肝炎的检测试剂中的应用。慢性乙型病毒性肝炎相关基因的新突变蛋白的编码基因在制备慢性乙型病毒性肝炎的检测试剂中的应用。一种慢性乙型病毒性肝炎检测试剂盒，由以下成分组成核苷酸序列如SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:4所示的引物，PCR反应液，PCR产物纯化盒和测序反应液；
所述PCR反应液为溶解了 Tag DNA聚合酶、dNTPs、镁离子(如MgCl2)、PCR反应缓冲液(如IOXTaq Buffer),以上试剂均可直接购买相应商品，如(10mM)dNIPs购自上海生工生物工程技术服务有限公司；Tag DNA聚合酶及其配套的IOXTaq Buffer、MgCl2购自!^ermentas 公司。各试剂的用量及浓度均为本领域常规值，如Iu/μ L Tag DNA聚合酶lyL、2mmol/L 的 dNTP (即浓度均为 2mmol/L 的 4 种 dNTP 的混合物)3 μ L、25mmol/L MgCl2 3 μ LUOXTaq Buffer (内含(NH4)2SO4) 3 μ L、灭菌 ddH20 17yL。所述PCR产物纯化盒为纯化PCR产物的溶液和DNA吸附柱Labell ；所述纯化PCR 产物的溶液为lu/ μ L虾碱性磷酸酶(SAP，可购于!^ermentas公司)0. 6 μ L、20u/ μ L外切酶(位ο I，可购于Fermentas公司)0. 15 μ L和灭菌ddH20 1. 25-1. 75 μ L，或按上述比例配制的其他体积的混合液。纯化PCR产物的溶液优选2-2. 5 μ L0所述测序反应液为BigDye (购自ABI公司)和5Xkquence buffer (购自ABI 公司)的混合液，BigDye和5 Xkquence buffer的体积比优选为1:2，如1 μ LBigDye与 2 μ L5 X Sequence buffer 混合。上述慢性乙型病毒性肝炎检测试剂盒，优选核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID N0:4所示的引物浓度分别为3. 2ymol/L。本发明的慢性乙型病毒性肝炎的相关基因及其新突变p. Arg707Cys,是通过对“相对极端性状的”50例慢性乙肝患者及40例未注射过乙肝疫苗正常对照进行全基因组外显子测序，通过生物信息学分析及进一步的数据筛选找到最有可能的候选基因；然后再对所找到的候选基因进行大样本量的病例-对照(其中慢性乙肝患者17 例，未注射乙肝疫苗正常对照1636例)相关关系研究；最后通过相关基因的作用机理及统计学分析结果 (.NLRXl基因新突变与慢性乙肝相关的统计学/^值为5. 08X10_5，优势比(OR)为2. 34，说明两者有显著相关性)最终确定了基因新突变与慢性乙型肝炎相关。本发明的人基因核苷酸全长序列(包含突变位点)通常是用聚合酶链式反应 (PCR)进行合成。对于PCR扩增法，可根据基因的核苷酸序列，进行引物设计，并以所检测的患慢性乙型肝炎患者抽提的DNA作为模板，扩增目的序列。最后通过测序反应检测及确定相关基因的突变。由于前期的研究已经证明了慢性乙型肝炎与基因新突变的高度相关性，因此检测这个基因的突变可用于鉴定慢性乙型肝炎患者的宿主遗传背景的易感性及对免疫应答的反应能力，进一步地用于之后靶向个体化治疗。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果
我们通过全基因组外显子测序及大样本量的相关研究，发现了与慢性乙型病毒性肝炎的相关基因——NLRXl及其新突变。因此，找寻及检测慢性乙肝相关基因及其突变，不仅是了解及阐明本病的发病机理的必要途径，同时也为建立鉴定本病的基因诊断和个体化治疗提供了新的契机。在已了解与本病相关的基因及其突变之后，我们可以建立起基于 NLRXl基因及其变异的诊断技术，以期对临床上慢性乙肝患者进行基因水平的诊断，还可以对其临床用药情况予以指导和个体化治疗。由于基因的突变是导致本病遗传背景发生改变从而致使其易感性及免疫应答发生改变的重要因素，从长远看，对本病进行基因的突变检测使我们有可能在今后通过纠正突变的基因疗法或其它针对这一突变的生物学效应的方法去治疗本病。因此，从长远看，与本病相关的基因突变的发现在临床治疗方面有深远的意义和前景。
图1 -.NLRXl基因的部分测序结果，图中上部为野生型的测序结果，图下部为 NLRXl p. Arg707Cys杂合性突变的测序结果(箭头所示为突变位点)。
具体实施例方式以下实施例中如无特殊说明均为本领域常规试剂和试验方法。实施例1病例收集
来自中山大学附属第三医院传染科的17 例慢性乙型肝炎患者和来自同一地区的1636例未注射乙肝疫苗或自报疫苗注射史不明的健康自愿者，在取得上述患者、自愿者及家属知情同意后，取外周血于EDTA抗凝管中备用。用Qiagen公司生产的QIAamp DNA Blood Mini Kits (试剂盒)从抗凝外周血中提取DNA，TE溶解，_80°C保存，备用。实施例2 NLRXl基因的突变检测
NLRXl 基因的 mRNA 序列来自 Genbank (NM_170722)。Genomic DNA 序列来自 UCSC 数据库(http//genome, ucsc. edu/)禾口 Ensembl 数据库(http://asia. ensembl. org/index, html)。主要步骤
1. PCR 扩增PCR 反应体积为 30 μ L =IOXiTaq Buffer (内含(NH4)2S04) 3 μ L, 25mmol/ L MgCl2 3μ L,2mmol/L dNTP 混合物 3 μ L，3. 2 μ mol/L 上、下游引物各 1 μ L，lu/μ L Taq DNA聚合酶1 μ L，实施例1提取的DNA模板1 μ L，灭菌(MH2O补足体积至30 μ L。PCR反应条件95°C预变性:3min ；95°C 30s，引物特异性退火温度lmin，72°C 45s, 36个循环；最后 720C 延伸 IOmin0检测NLRXl基因突变位点的上游引物Pl (SEQ ID NO 3)的序列为 5，- CCCCATCAGAGCTCCTTGACC-3，，下游弓丨物 P2 (SEQ ID NO 4)的序列为5，-CTCCCGGCCCCTAAACTAGACT-3，。2.测序反应方案
(1)预反应反应体积共3μ L :lu/μ L虾碱性磷酸酶(SAP) 0. 6μ L、20u/y L外切酶 (.Exo 1)0. 15 μ L (Fermentas 公司)、PCR 产物 0. 5_1· 0μ L、灭菌 ddH20 补足体积至 3 μ L。 反应混合物在PCR仪上反应，37°C温浴15min，85°C 15min灭活酶。反应完毕后反应混合物直接作为测序反应的模板用。(2)测序反应用ABI公司的96孔板，在GeneAmp 9700 PCR仪上进行。反应体积共 10μ L :3μ L 的预反应产物、2μ L 的 5Xkquence buffer (ABI 公司)、1 μ L 的 Big-Dye (ABI 公司)、lyL 的引物(3.2ymol/L)，3yL 的灭菌 ddH20。反应条件98°C 2min ；96 °C 10s，50°C 5s, 60°C 4min，30 个循环；最后 4°C保存。(3)测序纯化直接在96孔板上进行。a)测序反应完毕后，配无水乙醇6mL+3mol/L醋酸钠(pH5. 2)240 μ L混合溶液(即无水乙醇醋酸钠体积比=25:1)，每个样品中加入50yL混合溶液。用锡箔纸封闭，并振荡混勻。b)将测序产物放于_20°C避光静置20min以上。
c) 20°C,3700 rpm 离心 30min。d)倒去上清液，倒扣在四层吸水纸上，360rpm离心10s。e)配75%乙醇(无水乙醇7. 5mL+ddH20 2. 5mL混合溶液的比例)，每个样品中加入 90yL混合溶液。用锡箔纸封闭，并振荡混勻。f)将测序产物放于_20°C避光静置20min以上。g) 20°C,3700 rpm 离心 30min。h)倒去上清液，倒扣在四层吸水纸上，360rpm离心10s。i)室温通风处，避光晾干，30min以上。j)每个样品中加ddH20 10 μ L，用锡箔纸封闭，振荡后离心。k)待测样品放于4°C避光静置1. 5h以上，以充分溶解，上ABI3730测序仪进行测序。3.测序结果分析用ABI序列分析软件进行分析
发明人对来自中山大学附属第三医院传染科的17 例慢性乙型肝炎患者和来自同一地区的1636例未注射乙肝疫苗或自报疫苗注射史不明的健康自愿者进行基因的突变检测。结果如下
突变位点为发生在基因的氨基酸序列中第707位精氨酸突变为半胱氨酸 (p.Arg707Cys)，突变后的氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。其中有66例患者和30例正常对照存在杂合性突变。在17 例病例和1636例对照研究中，其风险等位基因的个数分别是66个和30个，优势比值(OR值)为2. 34 A值为5.08X10—5。多基因遗传病的研究中，通常是通过关联分析来确定其风险基因的，本实验结果中，/7值有显著差异，且OR值为2. 34， 说明该基因的突变是导致该病的危险因素。测序结果见图1。
实施例WLMl基因突变检测试剂盒的制备制备一试剂盒，具体成分见表1 表1
试剂名I具体成分
1__
上游引(SEQIDN0 :3),干粉20D,溶解后浓度:3. 2 μ mol/L,体积=IyL
物Pl__
下游引(SEQIDN0 :4),干粉20D,溶解后浓度3. 2 μ mol/L,体积1WL
物P2__
PCR 反 lu/wLTaqDNA聚合酶 IwL (购自 Fermentas 公司)、2_ol/LdNTf>3 μ L、25_ol/LMgCl23 μ L (TaqDNA 聚合酶配套试齐lj)、
应液 IOXTat^uffer (内含(NH4)2SO4, TaqDNA 聚合酶配套试剂)3 μ L、灭菌 ddH2017 μ L。_
PCR产2-2. 5μ L纯化PCR产物的溶液(内含Iu/μ L虾碱性磷酸酶(SAP,购自Fermentas公司)0. 6 μ L、20u/μ L外切酶(SroI,购自物纯化 Fermentas 公司)0. 15 μ L 和灭菌 ddH201. 25-1. 75 μ L), DNA 吸附柱 Labell
测序反含IwLBigDye和2μ L的5 X Sequencebuffer (均购自ABI公司)
应液 _
上述试剂盒的使用方法抽取待检测患者的血液2mL，使用常规方法(或特定的DNA提取试剂盒)从血液中提取DNA。将基因突变检测试剂盒中的PCR引物稀释至3. 2 μ mo 1/ L，以所提取的DNA为模板与所提供的引物进行PCR反应。使用检测试剂和所提供的PCR产物纯化盒对PCR产物进行纯化。将纯化的产物进行测序反应后直接测序。观察测序所得到的序列是否存在错义突变，即SEQ ID NO :1所示氨基酸序列第707位精氨酸(Arg)是否发生突变。
权利要求
1.一种慢性乙型病毒性肝炎相关基因的新突变蛋白，其特征在于在慢性乙型病毒性肝炎相关基因NLRXl蛋白的氨基酸序列第707位精氨酸突变为半胱氨酸。
2.根据权利要求1所述慢性乙型病毒性肝炎相关基因的新突变蛋白，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
3.权利要求2所述慢性乙型病毒性肝炎相关基因的新突变蛋白的编码基因。
4.根据权利要求3所述慢性乙型病毒性肝炎相关基因的新突变蛋白的编码基因，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
5.权利要求1所述慢性乙型病毒性肝炎相关基因的新突变蛋白在制备慢性乙型病毒性肝炎的检测试剂中的应用。
6.权利要求4所述慢性乙型病毒性肝炎相关基因的新突变蛋白的编码基因在制备慢性乙型病毒性肝炎的检测试剂中的应用。
7.—种慢性乙型病毒性肝炎检测试剂盒，其特征在于由以下成分组成核苷酸序列如 SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:4所示的引物，PCR反应液，PCR产物纯化盒和测序反应液；所述PCR反应液为溶解了 Tag DNA聚合酶、dNTPs、镁离子的PCR反应缓冲液(内含 (NH4)2SO4)；所述PCR产物纯化盒由纯化PCR产物的溶液和DNA吸附柱Labell组成，所述纯化PCR 产物的溶液为Iu/ μ L虾碱性磷酸酶、20u/ μ L外切I和灭菌ddH20的混合液；所述测序反应液为BigDye和5Xkquence buffer的混合液。
8.根据权利要求7所述慢性乙型病毒性肝炎检测试剂盒，其特征在于所述核苷酸序列如SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:4所示的引物浓度分别为3. 2 μ mol/L。
全文摘要
本发明公开了一种慢性乙型病毒性肝炎相关基因NLRX1的新突变蛋白、编码基因及其应用。本发明的慢性乙型病毒性肝炎相关基因NLRX1的新突变蛋白是在慢性乙型病毒性肝炎相关基因NLRX1蛋白的氨基酸序列第707位精氨酸突变为半胱氨酸，同时得到了该突变蛋白的编码基因，建立了基于NLRX1基因及其突变体的诊断试剂盒，该试剂盒可以对临床上慢性乙肝患者进行基因水平的诊断，还可以对其临床用药情况予以指导和个体化治疗。从长远看，对慢性乙型病毒性肝炎进行NLRX1基因的突变检测使我们有可能在今后通过纠正突变的基因疗法或其它针对这一突变的生物学效应的方法去治疗本病，在临床治疗方面有深远意义和应用前景。
文档编号G01N33/68GK102558312SQ201210031359
公开日2012年7月11日 申请日期2012年2月13日 优先权日2012年2月13日
发明者彭亮, 李奇斌, 王一鸣, 袁萍, 裴元元, 赵强, 高志良, 黄玮俊 申请人:中山大学