的核酸酶抑制剂，对应的DEPC地2〇体积依次为2. 5 y 1、2. 3 y 1、2. 1 y 1、1. 9 y 1、1. 7 y 1。反 应结束后根据Ct值如表15和巧光曲线如图14所示：
[0137] 表15不同核酸酶抑制剂浓度 [013引
[0139] 根据图中各个浓度的Ct值得出核酸酶抑制剂最优体积为1. 0 y 1，浓度为0. 25U/ y 1。
[0140] (lO)AMV反转录酶巧U/ y 1)浓度
[01川优化AMV反转录酶巧U/ y 1)，除去DEPC地20和本试剂，其余试剂体积不变和优 化溫度时一样的反应体积，在反应体系中分别加入1. 0 y 1、1. 2 y 1、1. 4 y 1、1. 6 y 1、1. 8 y 1 的AMV反转录酶，对应的DEPC地20体积依次为2. 5yl、2. 3yl、2.川1、1.9^1、1.7^1。反 应结束后根据Ct值如表16和巧光曲线如图15所示：
[0142] 表16不同AMV反转录酶浓度
[0143]
[0144] 根据图中各个浓度的Ct值得出AMV反转录酶最优体积为1. 0 y 1，浓度为0. 25U/ Ji lo
[0145] 根据W上优化的反应体系中各个成分，得到最优的反应体系如表17。
[0146] 表17最优反应体系（20 y 1体系）
[0147]
[0148] 最佳操作条件为：瞬时离屯、混匀，放入巧光定量的PCR仪，在64. 2°C溫度下反应 50min，每隔Imin收集一次巧光，设置50个循环，在80°C的条件下反应2min度stDNA聚合酶 变性，反应终止）。
[0149] 若进行定性检测，只需将上述反应体系中liil的SYBR Green I(20X)换成 1 y 1的DEPC水，放入64. 2°C的水浴锅中反应50min，反应结束后加入1 y 1的SYBR Green I (100 X )，观察颜色的变化，即可判断阴阳性。
[0150] 3.标准曲线构建和灵敏度确定
[0151] 3.1标准曲线构建
[0152]用核酸蛋白质检测仪测定体外转录的RNA浓度，初始浓度为ICfcopies/ y 1，将模 板依次10倍稀释，进行RNA扩增，扩增曲线如图16所示和不同模板浓度对应不同Ct值如 表18所示，构建标准曲线如图17所示。
[0153] 表18不同模板浓度对应不同Ct值
[0154]
[0155] 3. 2灵敏度确定
[0156] 根据标准曲线确定该定量RT-LAMP方法的灵敏度为2. 4X 104拷贝数；根据反应后 加入100XSYBR Green I颜色判断，定性RT-LAMP最低检测限度为24拷贝数，如图21C所 /J、-〇
[0157] 4. PstI 酶切 RT-LAMP 产物
[015引根据LAMP反应的原理，用PstI酶切产物后，有两种主产物，分别为18化p、3nbp， 如图18所示：1泳道为酶切主产物分别为18化p、3nbp，M泳道为DM Marker值L2000)。
[0159] 5.反应结果的可视化
[0160] 5. 1RT-LAMP的产物电泳检测
[0161] 取5 y 1产物电泳检测，结果如图19所示：1-8泳道分别对应的RNA模板拷贝数依 次为 2. 4X l〇s、2. 4X 107、2. 4X 106、2. 4X 105、2. 4X 104、2. 4X 103、2. 4X l〇2、24copies 反应 后的电泳图；M泳道为DM Marker值L2000)。由于RT-LAMP有多种产物，而且有巧光染料存 在，因此电泳条带具有阶梯式其有明显亮带。
[0162] 5. 2浑浊度
[0163] 由于焦憐酸儀沉淀产生，用肉眼就能观察到反应产物浑浊，瞬时离屯、有白色沉淀 生成，结果如图20所示。
[0164] 5. 3RT-LAMP产物中加入100XSYBR Green I后颜色变化
[0165] 由于双链DNA存在，在RT-LAMP产物中加入SYBR Green I (100X)，直接观察阳性 变为黄绿色，阴性为栋色，用来判断常规RT-LAMP的检测限度，结果如图21C所示，其中1-11 分别对应的 RNA 模板拷贝数依次为 2. 4Xl〇i°、2. 4X109、2. 4Xl〇s、2. 4X107、2. 4X106、 2. 4X 105、2. 4X 104、2. 4X 103、2. 4X 102、24、2. 4copies，1-10 颜色为黄绿色，11 为栋色，12 为阴性对照，颜色为栋色，因此常规RT-LAMP的检测限度为24拷贝数。在紫外灯照射下阳 性为绿色，阴性为无色，结果如图21A所示。
[0166] 6.特异性检测
[0167] W DHAV-3为阳性标准品，DHAV-1、DPV、大肠杆菌、沙口氏杆菌、鸭疫里默氏菌、健 康鸭胚尿囊液为阴性对照，进行RT-LAMP定量，对应的Ct值如表19和扩增曲线如图22所 /J、-〇
[016引表19特异性检测
[0169]
[0170] 最后说明的是，W上优选实施例仅用W说明本发明的技术方案而非限制，尽管通 过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可W在 形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
【主权项】
1. 3型鸭肝炎病毒荧光定量RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括根据3型鸭肝炎病 毒VP3基因部分核苷酸序列（如SEQ ID No.l所示）设计的一对外引物、一对内引物以及 一对环引物，所述外引物序列如SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3所示，内引物序列如SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5所示，环引物序列如SEQ ID No. 6和SEQ ID No. 7所示。2. 如权利要求1所述的3型鸭肝炎病毒荧光定量RT-LAMP检测试剂盒，其特征在 于，所述试剂盒还包括3型鸭肝炎病毒RNA阳性标准品、BstDNA聚合酶、20XThermo Pol Reaction Buffer、AMV 反转录酶、核酸酶抑制剂、dNTPs、甜菜碱、Mg'SYBR Green I 和 DEPC H2O03. 如权利要求2所述的3型鸭肝炎病毒荧光定量RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于， 所述试剂盒中以下成分在反应体系中的终浓度为=BstDNA聚合酶0. 4U/ y L，AMV反转录酶 0. 25U/ y L，核酸酶抑制剂0. 25U/ y L，dNTPs 0. 5 y M，外引物各0. 25 y M，内引物各2 y M，环 引物各 I y M，甜菜碱 0? 5M，Mg2+7. 5mM，SYBR Green 11 X 或 5 X 04. 如权利要求2所述的3型鸭肝炎病毒荧光定量RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，所 述试剂盒按反应体系体积为20 y L计，包括：8U/ y L的BstDNA聚合酶I y L，20 X Thermo Pol Reaction Buffer 2 y L，5U/ y L 的 AMV反转录酶 I y L，5U/ y L 的核酸酶抑制剂 I y L，2. 5 y M 的dNTPs 4 y L，外引物的混合物0. 5 y L，内引物的混合物4 y L，环引物的混合物2 y L，4M的 甜菜碱2.51^，300禮的]\%2+0.51^，20\5￥81?6代6111或100\5￥81?6代611111^，801^/ y L阳性标准品RNAO. 5 y L ;所述外引物、内引物及环引物中每个引物的浓度均为10 yM，相 应引物混合的体积比为1:1。5. 如权利要求1~4任一项所述的3型鸭肝炎病毒荧光定量RT-LAMP检测试剂盒，其 特征在于，所述试剂盒以Ct值为纵坐标，以3型鸭肝炎病毒阳性标准品RNA模板拷贝数的 对数为横坐标，建立标准曲线进行定量检测。6. 如权利要求5所述的3型鸭肝炎病毒荧光定量RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，所 述3型鸭肝炎病毒RNA阳性标准品的制备包括如下步骤：首先以含3型鸭肝炎病毒的尿囊 液抽提RNA，反转录合成cDNA，然后以外引物进行PCR扩增得到217bp的目的片段，将目的 片段进行回收，构建重组质粒PGEM-T/VP3,测序鉴定后通过体外转录将DNA转录为RNA，琼 脂糖凝胶电泳检测目的片段大小为291bp，核酸蛋白质检测仪测定RNA浓度，将RNA模板依 次10倍稀释得到阳性标准品。7. 如权利要求6所述的3型鸭肝炎病毒荧光定量RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，所 述PCR扩增条件如下：94°C预变性4min ;94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，共35 个循环；72°C延伸IOmin。8. 权利要求1~7任一项所述3型鸭肝炎病毒荧光定量RT-LAMP检测试剂盒在非疾病 诊断中用于3型鸭肝炎病毒的定性或定量检测。9. 权利要求1~7任一项所述3型鸭肝炎病毒荧光定量RT-LAMP检测试剂盒在非疾病 诊断中定量检测3型鸭肝炎病毒的方法，其特征在于，先制备3型鸭肝炎病毒RNA阳性标准 品，然后以阳性标准品RNA为模板，加入引物和试剂，瞬时离心混匀，置于荧光定量PCR仪中 61~65°C条件下反应50min，每隔Imin收集一次荧光，设置50个循环，在80°C条件下反应 2min后停止反应，通过构建标准曲线对结果进行定量分析。10. 如权利要求9所述3型鸭肝炎病毒荧光定量RT-LAMP检测试剂盒在非疾病诊断中 定量检测3型鸭肝炎病毒的方法，其特征在于，荧光定量PCR仪中的反应温度为64. 2°C。
【专利摘要】本发明公开了一种3型鸭肝炎病毒荧光定量RT-LAMP检测试剂盒及其应用和方法，该试剂盒包括根据3型鸭肝炎病毒VP3基因部分核苷酸序列(如SEQ？ID？No.1所示)设计的一对外引物、一对内引物以及一对环引物，所述外引物序列如SEQ？ID？No.2和SEQ？ID？No.3所示，内引物序列如SEQ？ID？No.4和SEQ？ID？No.5所示，环引物序列如SEQ？ID？No.6和SEQ？ID？No.7所示。该方法不仅能够定性、更能够定量检测3型鸭肝炎病毒，操作简单，快捷。
【IPC分类】C12Q1/70, C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105002169
【申请号】CN201510447928
【发明人】程安春, 赵雄艳, 汪铭书, 杨乔, 陈孝跃
【申请人】四川农业大学
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2015年7月27日