人类子痫前期发生相关的外周血白细胞miRNA标志物及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于基因工程及临床医学领域，本发明的目的是提供人类子痫前期发生相关的外周血白细胞miRNA标志物。本发明的另一个目的是提供上述miRNA标志物的应用。选自has-miR-15a-3p、has-miR-31-3p、has-miR-451a、has-miR-122-5p中的多种。所述的外周血白细胞miRNA标志物由has-miR-15a-3p、has-miR-31-3p、has-miR-451a和has-miR-122-5p构成。外周血白细胞miRNA标志物在制备人类子痫前期诊断或监测试剂中的应用。所述试剂是能够测定这些外周血白细胞microRNA标志物在外周血白细胞中表达量的试剂。本发明采用符合子痫前期和健康对照人群的样本进行验证，证明这几种标志物表达量存在显著性差异并具有稳定性，以说明该标志物具有特异性，可作为标志物使用。
【专利说明】人类子痫前期发生相关的外周血白细胞miRNA标志物及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程及临床医学领域，具体涉及人类子痫前期发生相关的外周血白细胞miRNA标志物及其应用。
【背景技术】
[0002]子痫前期(Preeclampsia，PE)是妊娠期常见的特发性多脏器损害性疾病，其特征是妊娠20周后出现高血压、蛋白尿和浮肿，进而可能会导致胎盘早剥、DIC、子痫、HELLP综合征、肾功能衰竭、脑血管意外和心功能衰竭等严重并发症的发生。PE妊娠期发生率在全球范围内是2%~8%，并且是目前孕产妇、胎婴儿发病率和死亡率的主要原因。PE的临床表现有明显的异质性，这使得临床获得有效的治疗难度明显加大。
[0003]目前主要有两个理论来解释PE的病理生理学改变。首先是血管炎性病变学说，包括胎盘缺氧，氧化应激，炎症反应，血小板聚集异常增强和全身性血管内皮功能障碍等。其中血管内皮功能的障碍被认为甚至会一直延伸到产后数周。其次是免疫功能异常学说，如细胞免疫异常、母胎免疫异常，保护性免疫功能失调等。PE发生的原因可能包括遗传因素、免疫因素和生物因素等多个方面。这一特点说明在临床实践中不仅不容易获得较为可靠的生物标志物，而且很难确定既有利于孕妇又要保证胎儿成熟的有效的疗法。虽然已有一些对患者外周血循环中相关细胞因子的研究，如血管内皮生长因子(VEGF)、可溶性内皮糖蛋白(sEng)，可溶性血管内皮生长因子受体(sFLTl)和胎盘生长因子(PlGF)等，但均不能较好地早期预测的PE的发生。
[0004]miRNA是目前研究最广泛的一类内源性非编码小分子RNA，长度范围在18~25个核苷酸(nt)，是一个在进化上高度保守的、具有发育时序性和器官组织特异性的基因负调节剂家族，能够与编码蛋白的mRNA的3’ -UTR结合，导致相应的蛋白质表达下调或完全抑制其表达。大量的研究结果证实，miRNA参与机体发生发育的多种生物学过程，包括干细胞的分化、器官和系统发育、信号传导、免疫调控、疾病和癌症的发生、以及生物体对外界生物和非生物环境的反应。miRNA的作用机制包括通过翻译抑制、mRNA降解和miRNA直接诱导的mRNA腺苷酸化三种转录后抑制效应而增加或抑制目标基因表达。最近的研究表明，外周血白细胞特别是其中的单个核细胞miRNA参与调节人体各种免疫过程。在人类多种自身免疫性疾病，包括克罗恩病、红斑性狼疮、类风湿关节炎和肿瘤等疾病已经发现多种miRNA的差异性表达。但有关子痫前期患者外周血白细胞或单个核细胞miRNA在该病发病机制中的作用以及作为生物标志物的可靠性和效能的研究尚未见报道，深入研究可为子痫前期的诊断和治疗提供新的途径。 [0005]血管内皮细胞损伤是目前公认的子痫前期发病的重要环节。子痫前期患者一旦发生血管内皮细胞损伤，可造成血管通透性增加,血管内蛋白和液体外渗；引发血小板凝聚，激活凝血系统，血液浓缩、凝滞，病情进展可造成DIC ;增加血管收缩因子的合成与释放，减少血管舒张因子的合成与释放，使血管活性因子失衡，血管收缩，从而引发一系列的子痫前期病理变化和临床症状。其中患者外周血白细胞、单核细胞产生细胞活素、弹性蛋白以及其他蛋白酶，进一步加重内皮细胞的损伤，氧自由基和脂质过氧化物能抑制前列环素的产生，增加txa2、no的产生并改变血管通透性，而血管通透性的改变导致临床上患者表现为水肿和蛋白尿。现有技术中显示血清miRNA在子痫前期患者诊断和预测中具有的可行性。由于样本量较小，研究的重复性较差，同时由于研究方法的局限性，未能获得有临床意义的结果。也有应用miRNA基因芯片技术检测寻常型银屑病患者外周血单个核细胞与正常人PBMC中差异性表达的miRNAs，并对部分差异性miRNAs进行荧光实时定量PCR验证。研究结果提示miRNA-146a、miRNA-99a水平与PV皮损症状严重程度密切相关，可以作为判断病情和临床疗效的生物学指标之一。目如研究表明，子痛如期患者外周血白细胞的基因表达与正常妊娠存在着很大的差异，表明子痫前期是一个复杂的病理生理过程，涉及细胞免疫、代谢、细胞周期、信号传导等广泛和多层次的变化。以上研究表明，子痫前期患者外血白细胞的miRNA表达异常可能成为诊断的重要标志物和靶向治疗新途径。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供人类子痫前期发生相关的外周血白细胞miRNA标志物。本发明的另一个目的是提供上述miRNA标志物的应用。
[0007]本发明由如下技术方案实现的:人类子痫前期发生相关的外周血白细胞miRNA标志物，选自 has-miR-15a_3p、has-miR-31_3p、has_miR-451a、has-miR-122_5p 中的多种。所述的外周血白细胞 miRNA 标志物由 has-miR-15a_3p、has-miR-31_3p、has_miR-451a 和has-miR-122_5p 构成。其中 has-miR-15a_3p 的序列为 SEQ ID N0.1, has-miR-31_3p 的序列为 SEQ ID N0.2，has-miR-451a 的序列为 SEQ ID N0.3，has-miR-122_5p 的序列为 SEQ IDN0.4。
[0008]所述的外周血白细胞miRNA标志物在制备人类子痫前期诊断或监测试剂中的应用。所述试剂是能够测定这些外周血白细胞microRNA标志物在外周血白细胞中表达量的试剂。
[0009]本发明详细描述如下:
系统收集完整的人群基础信息和临床资料，以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，并采用TRIz0I法提取外周血白细胞总RNA，采用miRNA高通量HiSeq2000测序，Genbank数据库比对结果,或将外周血白细胞总RNA逆转录合成cDNA,采用Real-time qPCR方法进行检测。
[0010]具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分:
一、研究对象纳入和排除依据
A组:实验组，子痫前期患者5人，无其他全身性重大疾病出组:健康对照组:5人，无其他全身性重大疾病；两组测序完成后做组间分析。
[0011]I组:正常年龄子痫前期患者(PE)组13人，平均年龄为25.69±1.32岁；2组:高龄子痫前期患者(PA)组13人，平均年龄为34.84±3.18岁；3组:子痫前期有合并症(PC)组13人，平均年龄为30.08±2.65岁；4组:正常同时期孕妇(N)对照组13人，平均年龄为29.07 ±2.59岁。4组外周血白细胞总RNA逆转录合成cDNA，Real-time qPCR方法进行检测后分析结果。[0012]二、外周血白细胞的分离及前处理
1.外周血采集:采集参与患者8ml血液分别装于EDTA采血管，采集完毕后，轻柔颠倒混匀10次，然后置于4°c冰箱暂存；
2.对采集的血样离心，收集白细胞:4°C3000rpm/min离心15min,离心后样本分层,将上层的血浆分装于2mlDEPC-treated water处理过的冻存管中，采血管中保留少量血浆，用一次性吸管紧贴液面自上而下吸取中间的白细胞层:将上层剩余的血浆及白细胞层以下4mm内的血细胞层一起吸取在2ml的EP管中；
3.除去红细胞:将上述装有白细胞样品的2ml的EP管中加入1ml红细胞裂解液，上下颠倒混匀，静置IOmin,然后4°C, 12000~13000rpm/min离心2 min,弃去上层红色清液,收集白色沉淀，如果红细胞裂解不完全，重复上述裂解过程1-3次，直至离心后的沉淀颜色为白色；
4.将离心后的上清液倒掉,并用吸头吸去残留的液体。然后加入PBS溶液Iml轻轻吹打混匀；4°C, 12000~13000rpm/min离心5min ;弃去上清,加入1.5ml Trizol溶液轻轻吹打混匀，室温放置5min，使其充分裂解；将裂解的样品_80°C保存。
[0013]本发明实验中使用的PBS溶液来自钮因华信科技发展有限公司，Trizol溶液来自Invitrogen 公司。
[0014]三、外周血白细胞总RNA提取
(1)将在_80°C冰箱 保存的已经TRIzol裂解液处理的EP管取出，室温151:~301:下放置5min ;按每1ml TRIzol加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，室温15°C~30°C下放置2~3min后，2°C~8°C 12000rpm/min离心15min ;取上层水相置于新EP管中，重复上述步骤，加入0.2ml氯仿抽提；
(2)取上层水相置于新的EP管中，按照每1mlTRIzol加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，室温 15°C~30°C下放置 IOmin, 2°C~8°C 12000rpm/min 离心 IOmin ；
(3)弃上清，按每1mlTRIzol加Iml DEPC水配制的75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，2°C~8°C 7500rpm/min离心5min,弃上清，沉淀的RNA室温下自然干燥；用RNase-free water溶解RNA沉淀；
(4)Nanodrop2000超微量分光光度计测RNA浓度及260/280比值；琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量。
[0015]四、用miRNA高通量HiSeq2000测序，Genbank数据库比对结果
取提取的外周血白细胞总RNA,使其溶于DEPC-treated water (Ambion),浓度控制在25-500ng/ul，制备RNA文库；通过RNA逆转录反应得到cDNA样品。
[0016]1.逆转录反应体系和条件:首先加入0.5μ I RT-Primer(100yM)，65°C放置IOmin,离心冷却至室温后再依次加入:①5x first strand buffer 2.0 μ I IOmM dNTP0.6μ I IOOmM DTT I μ I Rnase OUT (40U/μ I) I μ 1，混匀后离心于 42°C 放置 3 分钟，最后加入I μ I Superscript (200U/ μ I)，总体积为20 μ 1，混匀点离，42°C反应I个小时再7°C变性15分钟。
[0017]2.RT-PCR扩增反应体系见表1，RT-PCR扩增反应条件见表2:
表1
【权利要求】
1.人类子痫前期发生相关的外周血白细胞miRNA标志物，选自has-miR-15a_3p、has-miR-31_3p、has_miR-451a、has-miR-122_5p 中的多种。
2.根据权利要求1所述的人类子痫前期发生相关的外周血白细胞miRNA标志物，其特征在于:所述的外周血白细胞miRNA标志物由has-miR-15a_3p、has-miR-31_3p、has_miR-451a 和 has-miR-122_5p 构成。
3.根据权利要求1或2所述的人类子痫前期发生相关的外周血白细胞miRNA标志物，其特征在于:has-miR-15a-3p 的序列为 SEQ ID N0.l，has-miR-31_3p 的序列为 SEQ ID N0.2，has-miR-451a 的序列为 SEQ ID N0.3，has-miR-122_5p 的序列为 SEQ ID N0.4。
4.根据权利要求1或2所述的外周血白细胞miRNA标志物在制备人类子痫前期确定或监测试剂中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK103993015SQ201410219920
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年5月23日 优先权日:2014年5月23日
【发明者】王永红, 郝敏, 杨元元, 王文君 申请人:山西医科大学