肺炎支原体快速检测和基因分型的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物检测技术领域，具体的说涉及一种肺炎支原体快速检测和基因 分型的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae, Mp)是引起人类呼吸道感染的重要病原菌 之一，每年约有10% -40%的社区获得性肺炎是由其感染所引起的。荧光PCR检测技术凭 借其快速、高灵敏度和特异度的优势，逐渐成为肺炎支原体感染检测的金标准，逐渐在临床 检验及科研工作中广泛使用。在检测的基础上对肺炎支原体进行基因分型是深入了解其抗 原变异，进行菌株流行暴发预警预测的重要监测手段。研宄发现，肺炎支原体在基因水平 上可分成1型和2型两种基因型菌株，目前所报道的几种变异型菌株（VI型，V2a-2d型变 异菌株）均为两种型别菌株经同源重组造成Pl基因序列上的部分碱基差异。从全基因组 水平分析，变异型菌株仍然属于其对应的两种基因型菌株。目前最常用的肺炎支原体基因 分型技术主要有 PCR-RFLP 方法（参考文献：Sasaki T，Kenri T，0kazaki N，et al. 1996. Epidemiological study of Mycoplasma pneumoniae infections in japan based on PCR-restriction fragment length polymorphism of the Plcytadhesin gene. J Clin Microbiol. 34:447-449.)，荧光 PCR 熔链曲线分析法（参考文献：Schwartz SB, Mitchell SL, Thurman KA, et al. 2009. Identification of Plvariants of Mycoplasma pneumoniae by use of high-resolution melt analysis. J Clin Microbiol.47:4117-4120.)， pl 基因多重PCR分型法（参考文献：Kenri T，Taniguchi R，Sasaki Y，et al.1999. Identification of a new variable sequence in the Plcytadhesin gene of Mycoplasma pneumoniae: evidence for the generation of antigenic variation by DNA recombination between repetitive sequences. Infect Tmmun. 67:4557-4562.), pl 基因测序分析法（参考文献：Zhao F, Cao B, Li J，et al. 2011. Sequence analysis of the pladhesin gene of Mycoplasma pneumoniae in clinical isolates collected in Beijing in 2008to 2009. J Clin Microbiol. 49:3000-3003·)。几种方法均可将肺炎支原 体分为1型和2型两种基因型，分型结果一致。基因分型是对于肺炎支原体感染进行流行 病学溯源的重要技术手段，对于肺炎支原体感染的疫情控制有重要作用。同时，基因型别的 检测与监测也是对肺炎支原体暴发流行预警预测的重要依据。
[0003] 目前报道的上述常用肺炎支原体分型技术虽然已广泛使用，但是其存在着明显的 缺陷：这些方法均依赖于肺炎支原体的分离培养，即均需要从标本中分离到肺炎支原体菌 株后，再经纯培养提取的高浓度肺炎支原体基因组DNA后才可以进行基因分型，普通的临 床标本中的肺炎支原体核酸量不足以支持用上述的分型方法来检测。这种情况造成了目前 肺炎支原体的检测技术与分型技术严重脱节的现状：标本经过核酸提取通过荧光PCR技术 进行肺炎支原体快速检测（1小时可获得检测结果），但是其分型却首先需要对标本进行肺 炎支原体菌株分离培养，培养阳性的标本再进行核酸提取后才能使用常用分型方法进行检 测（平均2周才可获得分型结果），且肺炎支原体标本培养十分困难，阳性率低，造成许多荧 光PCR检测阳性标本由于无法分离培养出菌株不能进行分型检测，使得分型结果存在一定 程度上偏倚。这种肺炎支原体检测与基因分型检测灵敏度不一致，检测时限不同步的现状 严重制约了肺炎支原体研宄的发展。
【发明内容】
[0004] 本发明目的在于提供一种能够对肺炎支原体快速检测、快速进行基因分型的试剂 盒。
[0005] 本发明通过对28株肺炎支原体全基因测序株序列比对分析（其中8株NCBI 数据库中菌株；20株为临床分离株），寻找到肺炎支原体1型菌株和2型菌株特异 的核苷酸序列，其中1型菌株基因组中一段长约3kbp的序列特异核苷酸片段，对应 M129(GenBank:U00089. 2)测序菌株（1型菌株）基因 mpn457-459 ;以及2型菌株基因组中 一段长约5kbp的序列特异核苷酸片段，对应309(GenBank:AP012303. 1)测序菌株（2型菌 株）基因 mpna5861-5865。具体地，该2条特异的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7、8所示。
[0006] 据此，本发明首先提供了一组用于肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae)检测和 基因分型的靶序列，分别为肺炎支原体基因1型、2型的特异性核酸片段，所述特异性靶序 列分别如SEQ ID NO. 7、8所示的序列或其特异性片段。
[0007] 本发明提供了 SEQ ID NO. 7、8所示的序列或其特异性片段在肺炎支原体检测和基 因分型中的应用。选择上述特异核苷酸片段中高度保守的区域可以作为PCR、荧光定量PCR 检测的靶序列使用。
[0008] 在本发明的实施例中选择的用于肺炎支原体检测和基因分型的肺炎支原体基因1 型、2型的特异性核酸片段的保守序列分别为SEQ ID NO. 9、10。其中，SEQ ID NO. 9位于SEQ ID NO. 7 的第 2596-2708 位，SEQ ID NO. 10 位于 SEQ ID NO. 8 的第 3177-3323 位。
[0009] 进一步地，本发明提供了 SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 10所示的序列或它们的特异 性片段在肺炎支原体检测和基因分型中的应用。
[0010] 进一步，本发明分别以上述2条序列为基础设计了 2对特异性引物对以及与引物 对配合使用的荧光探针，并以此建立了一种具有更高灵敏度和特异度的肺炎支原体检测和 基因分型的双重荧光PCR方法。
[0011] 本发明提供了用于肺炎支原体快速检测和基因分型的引物探针组合，包括以下4 条引物和2条探针：
[0012] MP 1-F:CCAGATTCACGTTTAATTTC(SEQ ID NO. 1)
[0013] MP 1-R:GCATCTAACATGAAGACTG(SEQ ID NO. 2)
[0014] MPl-P:AACCAACAACTTCTCATTCATCCTCAG(SEQ ID NO. 3)
[0015] MP 2-F:TTGGGTAAACCTAATTTGC(SEQ ID NO. 4)
[0016] MP 2-R:ACACGTATTAGCATCACTA(SEQ ID NO. 5)
[0017] MP 2-P:AAGACTATTCGCCTTACAACCAACC(SEQ ID NO. 6)〇
[0018] 在本发明的实施例中，2条探针类型均为TaqMan探针，检测I型菌株的探针5'标 记荧光基团FAM，3'标记淬灭基团BHQ1，检测2型菌株的探针5'标记荧光基团VIC，3'标记 淬灭基团BHQl。
[0019] 本发明提供了上述引物探针组合在制备肺炎支原体快速检测和基因分型试剂盒 中的应用。
[0020] 含有上述引物探针组合的试剂盒属于本发明的保护范围。
[0021] 本发明的试剂盒基于双重荧光定量PCR方法，对待测样本提取基因组DNA后，采用 上述SEQ ID NO. 1-6所示的引物探针组合进行双重荧光定量PCR检测待测样本中的肺炎支 原体并进行基因分型。
[0022] 优选地，本发明试剂盒25yL检测体系的具体配置为：
[0023]
[0024]
[0025] 优选地，本发明试剂盒工作条件为：95°C预变性2min，l个循环；95°C变性15s， 55-57°C退火15s，45个循环。
[0026] 每次检测标本时必须设立NTC对照（无模板的阴性对照）和两种POS对照（阳性 对照），POSl和P0S2 (P0S1为1型菌株阳性对照，P0S2为2型菌株阳性对照），两种对照对 于结果判读起决定性作用：
[0027] 有效扩增：NTC (_)、POSl (+)和 P0S2 (