用rna干涉降低杨树木质素含量的方法

专利名称：：用rna干涉降低杨树木质素含量的方法
技术领域：
：本发明涉及一种生物
技术领域：
的降低杨树Klason木质素含量的方法，尤其涉及一种用RNA干涉降低杨树Klason木质素含量的方法。
背景技术：
：纸是人们生活的必需品。目前，世界制浆造纸工业主要以木材为造纸纤维原料，其制浆造纸过程的基本原理是用化学、机械或兼用化学及机械的方法将植物原料中的纤维分离出来，再在浆、水混合的悬浮体中使纤维重新交织成均匀而致密的纸张，而纤维的分离实质上是使纤维中所含木质素取得塑化或溶解的过程。随着经济快速发展和人们生活水平提高，不仅对纸的种类和数量需求越来越大，而且对纸的质量要求越来越高，由于杨树具有速生丰产，适应性强，繁殖容易，纤维长，材质好等特性，成为了我国主要的纸浆用材林树种。近年来，随着产业结构的调整和造纸业的需要，杨树纸浆林栽植面积逐年扩大。然而，在制浆和造纸中除去木质素是一个极大的障碍，原因是木质素很结实，而纤维素很有韧劲，二者很难分开，必须通过剧烈的化学处理工艺将木质素从纤维素中除去。由于林木种内木质素含量变异小，并且变异受环境条件的影响大，利用常规育种方法很难对这一性状进行有效地定向改良，因此，对于林木育种者来说，目标是创造出更有利于制浆工业脱木质素的工程植株，并且其木质素含量降低和或木质素结构改变而植物发育和抗性不受影响。故木质素的遗传改良具有潜在的重要商业价值，降低木材木质素含量或改变木质素结构组成，使得木质素在制浆过程中更易被去除，无论是从提高纸浆得率和质量、降低造纸经济成本还是环境保护方面，都具有重要意义。尤其我国造纸工业污染严重，从源头上治理与减少污染，既可减少能源消耗，又能达到环境保护的目标。经过多年的研究，人们对木质素单体的生物合成途径已有了基本框架性认识，普遍认为可分为3个主要途径(1)由植物光合作用初级产物葡萄糖生成苯丙氨酸，酪氨酸(禾本科植物)和色氨酸等的莽草酸途径；(2)从苯丙氨酸到肉桂酸及其酰基辅酶A酯的苯丙垸类代谢途径；(3)从肉桂酰辅酶A酯还原为木质素单体以及聚合生成木质素的过程称为木质素合成特异途径。基因工程改变木质素含量主要是在木质素生物合成途径过程中的关键酶上，主要使用技术1、正义和反义RNA转基因技术，即是通过导入某个酶基因的正义结构或反义结构，影响细胞内酶的含量或活性，引起目的基因的过量表达或使其表达受抑制，从而达到对木质素结构的控制。刘国道等人利用反义RNA技术，向烟草中导入反向连接的CCoA0MT基因，导致CCoACMT基因含量和活性下降，进而导致转基因烟草中木质素平均含量降低。同样地利用反义RNA技术，在拟南芥，杨树等植物中也获得了低木质素的转化体。然而反义技术的应用存在一定的局限性，其对内源性基因表达的抑制较弱，往往产生过渡性的表型，会妨碍对目的基因功能的准确判断。其抑制效应遗传稳定性较差，不能稳定可靠地降低目的基因的表达。2、基因敲除技术和DNA/RNA嵌合分子介导的基因转变技术，但该方法一次只能研究一个基因，不能有效地对多基因家族进行敲除。一些在动植物发育过程中有关键作用的基因，如果在DNA水平采用基因敲除或突变进行可遗传的修饰，则会过早地基因沉默，产生致死表型，因而无法深入研究。
发明内容本发明所解决的技术问题是提供一种用RNA干涉的方法降低杨树木质素的含量，使其用RNA干涉方法抑制杨树木质素合成关键酶CCR基因在杨树中的表达，从而降低杨树木质素含本发明是通过以下技术方案实现的一种用RNA干涉降低杨树木质素含量的方法，从杨树中克隆CCR基因片段作为RNA干扰片段，以组成型启动子CaMV35S启动表达，构建含CCR基因正反片段的表达载体，用根癌农杆菌介导，将CCR基因的正反结构转入杨树中，通过抗性植株PCR检测和对转基因杨树进行Klason木质素和综纤维素含量检测，植株纤维长宽比及细胞壁厚度和组织化学染色测定，检验目的基因的整合情况和表达情况，获得了Klason木质素含量降低和综纤维素含量提高的转基因杨树植株。用RNA干涉降低杨树Klason木质素含量的方法，主要包括以下步骤(1)根据杨树木质素合成途径中关键酶CCR基因的序列，通过序列比对，确定杨树木质素合成酶基因的特异性RNA干扰序列，根据干涉序列设计引物，进行杨树木质素合成关键酶CCR基因的干涉片段的特异性扩增；(2)以组成型启动子CaMV35S启动表达，构建含CCR基因正反片段的植物表达载体；(3)转化含有目的干涉片段的载体，并将目的干涉片段整合到杨树基因组中；(4)对抗性植株PCR检测和对转基因杨树进行Klason木质素含量和综纤维素测定以及植株纤维长宽比及细胞壁厚度和组织化学染色测定。在所述步骤(1)中，通过同源性搜索和序列比对，确定目的基因片段序列为杨树CCR基因的第4个外显子部分序列，即全长CCR基因(GenebankAccessionNumber:AJ295838)的第20662405片段，共340bp。在所述步骤(2)中，以组成型启动子CaMV35S启动表达，把CCR基因正反片段置于启动子之后，抑制杨树CCR基因的表达。在所述步骤(4)中，所述的抗性植株PCR检测是通过设计的CaMV35S特异性引物，进行PCR扩增验证。与已有技术相比，本发明的优点体现在1、本发明是利用RNA干涉技术进行杨树品质改良。这是RNA干涉技术首次在该领域进行研究与运用，也是本发明的独创之处。RNA干涉技术具有高效性、特异性、可遗传性、操作简单等特点，这是传统的基因敲除技术和反义RNA技术所无法比拟的。2、在受体选择上，传统的基因敲除技术和反义RNA技术所要研究的受体一般是完整的基因序列，对于基因序列不明确的受体，具有明显的局限性。而利用RNA干涉技术，只需要知道与受体同源的基因片段，就可对受体进行研究，因此，研究范围较为广泛。3、在操作方法上，反义RNA技术一般要构建的是含数千个碱基对的大片段，操作起来较为困难，而RNA干涉技术中所要构建的载体仅仅是含有几十到几百个碱基对的小片段，操作简单、方便，易于运用。另外，一个基因可选择一到多个干涉片段，可对这些片段或组合进行干涉效果的分析、优化，以获得最有效的片段。4、在遗传稳定性上，利用传统的反义RNA技术，因全基因转化对受体影响大，会导致受体产生较大变异，且遗传稳定性较差，难以得到优良的转基因作物，但采用该技术转化的RNA干涉片段小，对受体其它农艺性状影响小，遗传稳定性高，便于获得对目的基因干涉而其它农艺性状优良的转基因植株。具体实施例方式1.CCR基因特异性RNAi片段的获得1.1利用改良的CTAB法进行杨树基因组DNA的提取(1)叶片洗净，去叶脉，称取lg加石英砂、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、液氮，磨碎分装入2个5mLdorf管中。(2)力B195^e-巯基乙醇。(3)加1950叱1.5%CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)摇匀。(4)65。C水浴20min，每隔5min轻轻摇匀1次。(5)加1500叱氯仿/异戊醇(24:l)混合液，轻轻摇匀，10000rpm离心10min。(6)取上清液，力n60。C水浴10%CTAB195^L，氯仿/异戊醇(24:1)1950叱，10000rpm离心10min。重复第5歩两次。(8)取上清液，加NaAc195ML、无水乙醇2600ML,轻轻摇匀，10000rpm离心5min。(9)弃上清，用3mL75%乙醇洗3次，倒置晾干。(10)加50PL高压灭菌双蒸水溶解。(11)取60叱DNA提取液稀释50倍于UV754紫外可见分光光度计上测定波长260nm、280nm处的吸光度，根据^6。/^28。值判断DNA纯度，纯度在1.8—2.0范围内表明杨树基因组DNA提取成功。1.2CCR基因片段的PCR扩增根据CCR基因的全长DNA序列，利用引物设计软件设计了两对引物(引物1和2，弓|物1和3)，在两对引物的5'端上分别加入了石a/zHI、SWI、&cI和I酶切位点序列，其中引物1含及^HI酶切位点，引物2含有I和5"scI酶切位点，引物3含有I和I,酶切位点5'端至3'端的序列如下-引物l:5'-ACGGGATCCGGTATTGCTATGGAAAGGC-3'引物2:5'-AAAGTCGACGAGCTCATGGGGTACTCAGGGAAG-3'引物3:5'-ACGTCGACTCTAGAATGGGGTACTCAGGGAAG-3'以提得的基因组DNA为模板，用引物1、2和引物1、3分别进行PCR反应，反应条件为94。C预变性5min，94。C30s,63。C30s，72'C30s，35个循环，72。C延伸5min。反应体系如下ddH2039ML10XPCRbuffer5PLd證(10mM)1PL上游引物(10uM)2礼下游引物(10uM)2MLDNA模板0.6叱Taq酶0.4叱50PL扩增后的产物在含有0.5[ig/mL溴化乙锭(EthidiumBromide)的1.0%琼脂糖凝胶上电泳。1.3PCR扩增片段的纯化(1)进行琼脂糖凝胶电泳，分离要纯化的片段；(2)用干净的无菌手术刀切下目的DNA条带放入预称重的1.5ml印pendorf管；(3)每O.1g琼脂糖凝胶需加入200ulSl溶液；(4)于50'C温育，直至琼脂糖完全融解；(5)每5ug(不足5ug,以5ug计)DNA需加入5ulDNA结合液(玻璃粉悬液)，轻轻颠倒混匀，冰上放置IOmin;(6)室温6000rpm离心20s;(7)弃上清，加700ul乙醇洗液，轻轻抽吸，使玻璃粉悬浮，冰上放置5min;(8)重复(6)、(7)歩，6000rpm,离心20s;弃上清，小心去除全部残液；(9)加3050ulTE，轻轻吹打悬浮玻璃粉，50。C温育10min;(10)室温6000rpm离心20s，吸上清至新的印pendorf管，于4。C或-20。C保存备用o(11)将纯化的PCR扩增片段送到上海生物工程有限公司进行测序，测序结果符合预期效果。2.C1Q基因siRNA表达载体的建立2.1RNAi(2CCRi)中间载体构建将pUCCRNAi质粒(由安徽农业大学生物质材料与能源实验室惠赠)和纯化的PCR扩增片段(正向和反向)分别用^s/zHI、&7I双酶切，酶切反应体系为20PL，如下所示<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>点动混匀，30'C保温3h，60。C灭活15min。再加入:ddH207叱10XbufferH2叱&7I1PL10ML点动混匀，37'C保温3h，60'C灭活15min，于4。C冰箱保存备用。将酶切后的pUCCRNAi质粒载体与纯化的PCR扩增片段(正向和反向)产物在1.4%琼脂糖凝胶上电泳，切胶纯化回收片段，按下表所示加入各成分，点动混匀，于16'C过夜连接。丰示舰—工对照pUCC腿i11PL酶切纯化后的PCR(正向)片段(1F)7ddH207叱10Xligasebuffer1PL1PLT厕ligase1PL1叱然后转化DH5ci感受态细胞，在含Amp的LB固体培养基上进行重组子的筛选，根据载体的酶切位点分析，用尸WI进行酶切验证；酶切反应体系如下ddH202PLpUCCRNAi+lF6PL10XbufferH1PL_尸WI_1PL10A点动混匀，37'C保温3h，60'C灭活15min，1.2%琼脂糖凝胶电泳观察，于Kodak凝胶成像系统拍照记录。接着对重组子进行y^"7II、J力oI双酶切，电泳切胶回收，利用5a/dlI、《WH和6^I、Z/wI两对同尾酶特性，再与经万柳#1、5"WI双酶切、纯化后的PCR(反向〉目的片段进行反向连接，然后转化、筛选重组子[命名为RNAi+2F(fragment)]、酶切验证，步骤同上。2.2PBI121+2F干涉表达载体的构建pUCCRNAi+2F载体进行J6aI、SacI双酶切，回收2F片段，然后与经过Z力aI、I双酶切的pBI121载体进行连接，然后转化、筛选重组子(J力aI、SacI双酶切验证)，构建成pBI121+2F干涉表达载体。ddH206.0uLpUCCR懇+2F(orpBI121)10.0nL质粒10XbufferM2.0iiL5"acI1.0nL勘I1.0uL20.0本实施例利用载体构建常用的基因工程方法，将(X/基因片段正反向连接于马铃薯GA20-氧化酶"^tw7片段两侧，构建的PBI121(2CCRi)表达载体，该表达载体可利用基因工程方法降低杨树木质素含量。3.根癌农杆菌LBA4404转化获得转基因杨树3.1表达载体导入农杆菌LBA4404挑取农杆菌LBA4404单菌落接种5ml含利福平100ug/ml的YEB液体培养基中，28°C、200r/min震荡培养48小时左右。取2ml菌液转入50mlYEB液体培养基，继续培养至0D600至1.0左右。转入无菌离心管，冰浴30min。5000r/min离心5min，去上清。加入2ml新配制的20mmol/L预冷CaCL2重悬菌体。取灭菌后的离心管，每管在冰上分装200ul。取2ug的pBI121+2F质粒，加入到200ul的农杆菌感受态中。)冰浴5min，转入液氮中冷冻lmin，然后37'C水浴5min。加入800ul的YEB液体培养，28°C、200r/min震荡培养5小时左右。吸取菌液300ul涂布在YEB固体培养基上(含100ug/ml的利福平和卡那霉素)。用无菌牙签挑取单菌落，接种于适量的液体YEP培养基(含Kan100yg/mL、Rif100ug/mL)中，振荡培养过夜。对LBA4404的质粒进行提取及PCR鉴定，扩增条件为94'C预变性5min;94。C变性30s、53。C退火30s、72。C延伸30s，共35个循环；最后72。C延伸10min。经PCR验证，表达载体已导入农杆菌LBA4404中，冻存于一70'C待用。3.2农杆菌介导的杨树遗传转化3.2.1工程菌制备从_70'C冻存的农杆菌刮取少量菌体，接种于含50rag/L卡那霉素和50mg/L利福平的YEP平板上，于28'C遮光培养3d后，从活化平板上挑取单菌落接种于含抗生素的YEP液体培养基中，28°C，230rpm培养约16h，视菌液浓度用不含抗生素的YEP液体培养基按1:50或1:100的比例进行稀释，28°C230rpm振荡培养46h，至相应(XU值时，4°C,5000rpm离心5min收集菌体，用相同体积的MS液体培养基(含相应乙酰丁香酮浓度)悬浮备用。3.2.2侵染与共培养于超净工作台上，将工程菌液倒入无菌培养皿中，将预培养过7d的叶片浸入工程菌液中，不时轻摇，侵染20min后，用无菌滤纸吸干后接种到共培养培养基上，25t左右遮光进行共培养。3.2.3菌的清洗待平皿中长出可见菌落即可进行清洗，用无菌水洗叶片57次，水澄清即可。再用含400mg/L头孢霉素水浸泡，放入恒温摇床中振荡半个小时，用装有滤纸的平皿吸干，接种到含头孢霉素的恢复培养基上，25'C左右遮光进行恢复培养7d。3.2.4抗性愈伤组织的筛选与分化将恢复培养7d后的材料转入筛选分化培养基中25'C左右遮光培养6d后，转入光照时间为16h/d,光照强度为20003000Lux条件下培养，每20d转入新配制的筛选分化培养基，进行3轮筛选培养。4.转基因杨树的鉴定4.l转基因植株的分子检测对转基因植株进行PCR检测，检测使用的引物为pBI121+2F表达载体中CaMV35S启动子的一段核苷酸，其序列分别为35上游引物:5，-CCACAGATGGTTAGAGAGG-3，，35S下游引物:5，-GTCTTGCGAAGGATAGTGG-3，。扩增条件为94。C预变性5min;94'C变性30s、53。C退火30s、72。C延伸30s，共35个循环；最后72。C延伸IOmin。经检测筛选后，获得了所需要的转基因植株并将其进行移栽管理。5.转化植株木质素含量的检测5.1南林95杨Klason木质素及综纤维素含量的测定测定Klason木质素及全纤维素含量时，取移栽后生长3个月、生长状态一致的转基因和对照植株。剥去树皮，取茎干。测定Klason木质素与综纤维素含量。每个株系各做一个平行样。Klason木质素的测定按照国家标准(GB/T2677.8-1994)，综纤维素的测定按照国家标准(GB/T2677.10-1995)进行。Klason木质素的测定步骤为取烘干的样品研磨成均匀粉末，过筛(4060um)，精确称取lg(称准至0.0001g)试样，用定性滤纸包好，并用线扎住，放入索氏抽提器中，加入苯醇混合液，置水浴中抽提6h。将试样取出风千，解开纸包，用洁净的毛笔仔细将其刷入容量250mL具有磨口玻塞的锥形瓶中，加入预先冷至1215'C的72%的硫酸15mL，塞紧瓶塞，摇荡1min,使试样完全被酸所浸渍。然后将锥形瓶置于盂县调节温度为18~20。C的恒温水浴槽中，并在此温度下保温2.5h，每隔10min摇荡一次瓶内含物，达到规定时间后，将锥形瓶内容物全部移入容量为1000mL锥形瓶中，用蒸馏水漂洗锥形瓶，将所有残渣和洗液全部倾入该锥形瓶中，然后加水稀释至酸的浓度为3%，使总体积达到560mL。加热煮沸4h，并加水保持一定的体积。用己经在称量瓶内恒重的定量滤纸，过滤上述酸不溶木素，并用人蒸馏水洗涤至洗液加数滴10%的氯化钡不再浑浊，用PH试纸检査边缘不再为酸性为止。然后，将滤纸移入原恒重的称量瓶中，置于105士2'C烘箱至恒重。木质素含量=，><100附o综纤维素的测定步骤为取烘干的样品研磨成均匀粉末，过筛(4060um)，精确称取1g(称准至0.0001g)试样，用定性滤纸包好，并用线扎住，放入索氏抽提器中，加入苯醇混合液，置水浴中抽提6h。将试样取出风干，解开纸包，用洁净的毛笔仔细将其刷入容量250mL的锥形瓶中，加入65mL的蒸馏水，加入0.5mL的冰醋酸，0.75g的亚氯酸钠(纯度80%计)，在锥形瓶口倒扣一个容量为25mL的小锥形瓶，放在75'C水浴中加热1h，在加热过程中，经常旋转并摇动锥形瓶，一小时后在加0.5mL的冰醋酸和0.75g的亚氯酸钠，摇匀，继续在75t:水浴加热lh，如此反复，直至试样变白为止，最后将锥形瓶自水浴锅取出，冷却。用已经恒重的&滤器过滤，再用蒸馏水洗涤至不呈酸性为止，最后用丙酮洗涤3次，抽干洗液，取出滤器，用蒸馏水洗漆滤器外部，移入烘箱，，置于105士2'C烘箱至恒重。综纤维素含量=^><100图1显示了植株的Klason木质素及综纤维素的平均测定结果，对照植株的Klason木质素含量为20.48%，转基因株系中木质素含量分别为19.52%，18.13%和17.73%,平均比对照降低了9.7%，对照植株的综纤维素含量为74.18%，转基因植株中的综纤维素含量分别为75.03%，76.67%和77.89%，比对照增加了3.17%。5.2转基因植株纤维长宽比及细胞壁厚度的测定用冰醋酸和30。/。的双氧水以1:1的比例混合后对同时移栽的转基因植株及对照植株分别进行离析，冲洗千净之后，再用解剖针挑少许置于载玻片上，然后放在100倍的纤维投影仪下测量长度。每一株系测定纤维为200根，精确到O.Olram。将植株横截面切片在有目镜测微尺的显微镜下测定纤维细胞宽度及双细胞壁厚度，每一株系测定100个。'纤维长宽比是影响纸张质量的一个重要的指标，一般认为纤维长宽比越大越有利于造纸，而纤维素含量与细胞壁厚度呈正相关，由下表可知，转基因植株的纤维长宽比明显高于非转基因植株，这说明转基因植株更适合于造纸，而转基因植株细胞壁的增厚也侧面的反映出纤维素含量的增加。植株的纤维形态平均纤维长度平均纤维宽度/长宽比平均细胞壁厚类型TypesAspectratio度/umTheaverageTheaverageTheaveragelengthofthewidthofthethicknessoffiberfiberthewall转基因植株1734.1015.476347.43371.2974Transgenicplants1转基因植株2742.2715.885546.72641.3273Transgenicplants2转基因植株3745.0216.218145.93761.4944Transgenicplants3非转基因植685.8315.397344.54211.1967株controlplant5.3转基因植株组织化学染色对转基因植株和对照植株进行Wiesner反应。具体步骤为将新鲜的木材横截面切片先在2%的间苯三酚溶液中孵育2min。再用20°/。HC1封片，在显微镜下观察，拍照。对转基因植株以及对照进行Wiesner染色反应。Wiesner反应主要是对醛类物质特异性染色，反应中染色的深浅一般粗略的反映了木质化部位的木质素总含量，对木质素降低幅度大的转基因植株进行组织化学染色，结果显示转基因植株着色区域明显少于非转基因植株，且区域变窄，表明转基因植株的木质素含量低于对照，与Klason木质素测定结果相一致。转基因植株的生长状态表明虽然木质素含量明显降低，但植株生长状态良好。图1为本发明中综纤维素和Klason木质素含量。序列表<110〉安徽农业大学〈120〉用RNA干涉降低杨树木质素含量的方法〈130〉20090609〈160〉1<170〉Patentlnversion3.3<210>1<211>879〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈221〉所克隆的CCR基因片段正向序列〈222〉(1)..(340)〈220〉〈221〉PUCRNAi载体中的GA20内含子<222〉(341)..(539)〈220〉〈221〉所克隆的CCR基因片段反向序列〈222>(540)..(879)<400>1ggtattgctatggaaaggctgtggcagaacaagctgcatgggatatggctaaggagaaag60gggtggacctagtggtggttaacccagtgctggtgcttggaccattgttgcagcccactg120tcaatgctagcatcactcacatcctcaagtacctcaccggctcagccaagacata/tgcta180actctgttcaagcttatgtgcatgttagggatgtggcactagcccacattttagtctttg240agacgccttccgcctccggccgttacctttgctctgagagcgttctccaccgtggagagg300tggtggaaatccttgcaaagttcttccctgagtaccccatgtacggaccgtactactcta兆Ottcgtttcaatatatttatttgtttcagctgactgcaagattcaaaaatttctttattat420tttaaattttgtgtcactcaaaaccagataaacaatttgatatagaggcactatatatat480acatattctcgattatatatgtaaatgagttaacctttttttccacttaaattatatagt540accccatgagtcccttcttgaaacgttcctaaaggtggtggagaggtgccacctcttgcg600agagtctcgtttccattgccggcctccgccttccgcagagtttctgattttacacccgat660cacggtgtagggattgtacgtgtattcgaacttgtctcaatcgtatacagaaccgactcg720gccactccatgaactcctacactcactacgatcgtaactgtcacccgacgttgttaccag780gttcgtggtcgtgetcccaattggtggtgatcc鄉tggggaa卿gg城cggtataggg,tacgtcgaacaagacggtgtcggaaaggtatcgttatgg879权利要求1、一种用RNA干涉降低杨树木质素含量的方法，其特征在于从杨树中克隆CCR基因片段作为RNA干扰片段，以组成型启动子CaMV35S启动表达，构建含CCR基因正反片段的表达载体，用根癌农杆菌介导，将CCR基因的正反结构转入杨树中，通过抗性植株PCR检测和对转基因杨树进行Klason木质素和综纤维素含量检测，植株纤维长宽比及细胞壁厚度和组织化学染色测定，检验目的基因的整合情况和表达情况，获得了Klason木质素含量降低和综纤维素含量提高的转基因杨树植株。2、根据权利要求1所述的用RNA干涉降低杨树木质素含量的方法，其特征在于主要包括以下步骤(1)根据杨树木质素合成途径中关键酶CCR基因的序列，通过序列比对，确定杨树木质素合成酶基因的特异性RNA干扰序列，根据干涉序列设计引物，进行杨树木质素合成关键酶CCR基因的干涉片段的特异性扩增；(2)以组成型启动子CaMV35S启动表达，构建含CCR基因正反片段的植物表达载体；(3)转化含有目的干涉片段的载体，并将目的干涉片段整合到杨树基因组中；(4)对抗性植株PCR检测和对转基因杨树进行Klason木质素含量和综纤维素测定以及植株纤维长宽比及细胞壁厚度和组织化学染色测定。3、根据权利要求2所述的用RNA干涉降低杨树木质素含量的方法，其特征在于在所述步骤(l)中，通过同源性搜索和序列比对，确定目的基因片段序列为杨树CCR基因的第4个外显子部分序列，即全长CCR基因(GenebankAccessionNumber:AJ295838)的第2066~2405片段，共340bp。4、根据权利要求2所述的用RNA干涉降低杨树木质素含量的方法，其特征在于在所述步骤(2)中，以组成型启动子CaMV35S启动表达，把CCR基因正反片段置于启动子之后，抑制杨树CCR基因的表达。5、根据权利要求2所述的用RNA干涉降低杨树木质素含量的方法，其特征在于在所述步骤(4)中，所述的抗性植株PCR检测是通过设计的CaMV35S特异性引物，进行PCR扩增验证。全文摘要本发明公开了一种生物
技术领域：
的利用RNA干涉降低杨树中木质素的含量的方法。本发明从杨树中克隆CCR基因片段作为RNA干扰片段，以组成型启动子CaMV35S启动表达，构建含CCR基因正反片段的表达载体，用根癌农杆菌介导，将CCR基因的正反结构转入杨树中，通过抗性植株PCR检测和对转基因杨树进行木质素和综纤维素含量检测，转基因植株木质素含量较非转基因株木质素含量平均降低为9.7％，转基因植株中的综纤维素含量较非转基因株综纤维素含量平均提高3.17％，从而提供了一种降低杨树中木质素的含量的方法，为利用转基因杨树大规模提供造纸原料奠定了基础。文档编号C12N15/84GK101603052SQ20091003294公开日2009年12月16日申请日期2009年6月9日优先权日2009年6月9日发明者宋恩慧,沈周高,诚蔡,艳项,国魏申请人:安徽农业大学