专利名称：酶切法制备寡聚透明质酸盐的方法及所得寡聚透明质酸盐和其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及酶切法制备寡聚透明质酸盐的工艺过程，特别是涉及应用芽孢杆菌来源的透明质酸酶降解透明质酸或其盐制备寡聚透明质酸盐的方法，属于生物技术领域。
背景技术：
透明质酸(hyaluronic acid, HA)是一种酸性黏多糖，由N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸双糖重复单位通过β - (I — 4)糖苷键和β - (I — 3)糖苷键构成的无分支高分子糖胺聚糖，存在于动物组织细胞间质和某些细菌的荚膜中。透明质酸广泛用于医药、化妆品、食品等领域，分子量一般为IO5IO7Da (道尔顿)。寡聚透明质酸是指分子量小于IOkDa的透明质酸。研究表明，分子量对透明质酸的活性有很大影响，不同分子量的透明质酸甚至表现出截然相反的活性(郭学平等，低分子量及寡聚玻璃酸，中国生化药物杂志，2003，24 (3)
148-150)。目前，透明质酸降解的方法主要有物理降解、化学降解、生物降解三大类，物理降解法很难将透明质酸降至IOkDa以下，化学降解法和酶法可以制备寡聚透明质酸，但化学降解法制备寡聚透明质酸，需要较剧烈的反应条件(如较高的酸碱浓度等)才能达到最大程度的降解。此时，不但糖链上的糖苷键断裂，而且单糖(葡糖醛酸和乙酰氨基葡糖)残基的结构也遭到破坏，如乙酰基被水解掉，单糖六元环断裂等，对制得的寡聚透明质酸的生物活性产生一定影响(郭学平等，低分子量及寡聚玻璃酸，中国生化药物杂志，2003,24 (3):148-150)。化学降解法制备的寡聚透明质酸还容易发生褐变(专利申请号201110008110. 9)，生产过程会污染环境。而酶解法降解透明质酸时，只断裂单糖分子间的糖苷键，不会对其他结构造成破坏，而且酶解法反应条件温和，不用强酸强碱，制备的寡聚透明质酸不会发生褐变，不会造成环境污染，因此酶解法最适合制备寡聚透明质酸。降解透明质酸所用的酶主要是透明质酸酶，根据作用机制的不同，可以分为3类
(I)内切-β -N-乙酰氨基葡糖苷酶，为水解酶，作用于β -I, 4糖苷键，终产物主要为四糖，也可作用于软骨素或硫酸软骨素，并有转糖苷酶活性。哺乳动物来源的以及动物毒液来源的属于此类。(2)水蛭、十二指肠虫来源的透明质酸酶，为内切-β-葡糖苷酸酶，作用于β -I, 3糖苷键，也是水解酶，主要降解产物是四糖，特异性降解透明质酸；(3)细菌透明质酸酶，也称为透明质酸裂解酶(hyaluronate lyase),作用于β_1，4糖苷键,通过β -消去机制得到4，5_不饱和双糖(Kreil, G, Hyaluronidases—a group of neglected enzymes,Protein Sci, 1995， 4(9): 1666-1669)。目前工业生产寡聚透明质酸或其盐的方法是化学降解法，由于含透明质酸酶的动物组织来源有限，有文献报道的微生物来源透明质酸酶发酵液单位酶活较低，不可能大规模制备透明质酸酶，也就不可能用酶法大规模生产寡聚透明质酸或其盐
发明内容
本发明的目的是提供一种酶切法大规模生产寡聚透明质酸盐的方法，本发明采用芽孢杆菌发酵得到的透明质酸酶对高分子量透明质酸或其盐进行降解，酶活高、条件温和、操作简单、无环境污染。针对现今生物降解透明质酸或其盐所需降解酶活性低、来源有限、成本高的缺点，发明人从空气中分离得到了一种产透明质酸酶的芽孢杆菌sp. )A50，该菌种已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行了保藏，保藏号为CGMCCNO. 5744，保藏时间为2012年2月8日。该芽孢杆菌UaciJJm sp. )A50 CGMCC NO. 5744的获取过程为将装有富集培养基的平皿打开盖，放置于空气中，收集空气中沉降菌，约Ih后,盖上盖,置于25 40°C培养箱中有氧培养，培养24h后，将分离得到的单菌落接种于筛选培养基中，25 40°C，150rpm，有氧培养12 16h，采用中国药典方法测定透明质酸酶活力，选择酶活力最高的菌种作为本发明的菌种，菌种酶活力可达105IU/mL。上述所采用的各培养基组成如下
富集培养基(IOOmL):蛋白胨 O. 2 2. 0g，酵母粉 O. 2 2. 0g，K2HPO4 · 3H20 O. 05 O. 15g，MgSO4 · 7H20 O. 05 O. 15g，透明质酸钠 O. 01 lg，琼脂粉 2. Ogo筛选培养基(IOOmL):蛋白胨O. 2 2. Og,酵母粉 O. 2 2. 0g, K2HPO4 · 3H20O. 05 O. 15g, MgSO4 · 7H20 O. 05 O. 15g，透明质酸钠 O. 01 lg。筛选所得的芽孢杆菌UaciJJm sp. )A50 CGMCC NO. 5744具有如下的特征
I、形态特征
菌体杆状，单个或链状。菌落乳白色，有皱褶。2、分子生物学特征
菌种A50的16S rDNA序列如SEQ NO: I所示。本发明菌种适于在25 40°C下进行有氧培养，该菌种可以用来生产透明质酸酶(SP芽孢杆菌透明质酸酶，下同)，方法是将芽孢杆菌sp. ) A50 CGMCC No. 5744经斜面培养、种子培养、发酵培养、离心、硫酸铵分级沉淀、超滤制得透明质酸酶。具体包括以下步骤
(1)将芽孢杆菌UaciBmsp. )A50 CGMCC No. 5744菌种进行斜面培养，得斜面菌种；
(2)取斜面菌种接种到已灭菌的种子培养基中，在25 40°C、10(T200rpm的条件下培养10 24h，得种子液；
(3)将种子液接种到已灭菌的发酵培养基中，在25 40°C、10(T300rpm的条件下培养12 24h，得透明质酸酶发酵液；
(4)离心分离发酵液，取上清液，将上清液用硫酸铵分级沉淀出透明质酸酶；
(5)将步骤(4)沉淀出来的透明质酸酶溶于磷酸盐缓冲液中，超滤除去小分子杂质，得纯化的透明质酸酶。上述生产透明质酸酶的方法中，步骤(4)中发酵液离心的转速为1000(Tl5000rpm，离心时间为l(T20min，硫酸铵分级沉淀的步骤是将上清液中加入硫酸铵，使其质量体积浓度为20%，过滤除去产生的沉淀，然后继续加入硫酸铵，至其质量体积浓度为35%为止，得到的沉淀即为透明质酸酶。这里所述的质量体积浓度的意思是每ImL上清液中含有硫酸铵的质量(g)，下同。
上述生产透明质酸酶的方法中，步骤(5)中磷酸盐缓冲液的pH优选为5. 8 6. 8，浓度优选为5 50mmol/L，在实际应用中可酌情变动，超滤所用的为超滤膜。超滤膜的截留分子量为3 XlO4Da15上述生产透明质酸酶的方法中，每IOOmL斜面培养基中含有以下成分蛋白胨O. 2 2. Og,酵母粉 O. 2 2. 0g, K2HPO4 · 3H20 O. 05 O. 15g, MgSO4 · 7H20 O. 05 O. 15g,葡萄糖O. 5 I. 5g，琼脂粉2. 0g, pH调至6. 0 8· 0，斜面培养的温度为25 40。。。上述生产透明质酸酶的方法中，每IOOmL种子培养基中含有以下成分蛋白胨O. 2 2. Og,酵母粉 O. 2 2. 0g, K2HPO4 · 3H20 O. 05 O. 15g, MgSO4 · 7H20 O. 05 O. 15g,葡萄糖O. 5 I. 5g, pH 调至 6. 0 8· O。上述生产透明质酸酶的方法中，每IOOmL发酵培养基中含有以下成分蛋白胨O. 2 2. Og,酵母粉 O. 2 2. 0g, K2HPO4 · 3Η20 O. 05 O. 15g, MgSO4 · 7H20 O. 05 O. 15g,葡萄糖
O. 5 I. 5g, Tween80 O. 05mL, pH 调至 6. 0 8· O。上述生产透明质酸酶的方法中，斜面种子培养和发酵培养的接种量可以通过现有技术得到，不需付出创造性的劳动。种子培养基的接种量能够达到发酵培养所需接种量的种子液即可，发酵培养基的接种量一般在3 15%即可。上述生产透明质酸酶的方法中，可采用盐酸、硫酸或磷酸中的一种或一种以上调节斜面培养基、种子培养基和发酵培养基PH。本发明芽孢杆菌生产的透明质酸酶在发酵液中的酶活可达到Ixio5Ixio5IU/mL,大大高于文献报道中的最高酶活(I. 3 X 102IU/mL),且该酶热稳定性和pH稳定性高，用其降解高分子透明质酸，用来制备寡聚透明质酸，成本显著降低，可用于大规模生产，解决了动物来源的透明质酸酶成本高的问题，在生化研究领域及寡聚透明质酸的生产方面有广阔的应用前景。下面介绍以芽孢杆菌发酵得到的透明质酸酶(即芽孢杆菌透明质酸酶，下同)生物降解透明质酸或其盐生产寡聚透明质酸盐的方法。该方法包括配制透明质酸或其盐溶液、酶解、灭活、过滤、沉淀、脱水干燥步骤。一种酶切法制备寡聚透明质酸盐的方法，其特征是以芽孢杆菌sp.)A50 CGMCC NO. 5744发酵培养得到的芽孢杆菌透明质酸酶对透明质酸或其盐进行降解，包括以下步骤
①配制透明质酸或其盐溶液向纯化水中加入分子量大于IOkDa的透明质酸或其盐，配制成质量体积浓度为广30%的溶液；所述质量体积浓度的意思是透明质酸或其盐的质量/溶液的体积，单位为g/mL ；
②酶解调节步骤①中溶液的温度为2(T48°C、pH为Γ9，然后向其中加入芽孢杆菌透明质酸酶，将透明质酸或其盐酶解至所需分子量，得酶解液；
③灭活将酶解液在5(T90°C下保持l(T60min，对芽孢杆菌透明质酸酶进行灭活；
④过滤向灭活后的酶解液中加入易溶性无机盐，搅拌至完全溶解，然后用孔径为O. 45Mm的滤膜过滤，得滤液，每IOOmL酶解液中加入O. f IOg的易溶性无机盐；
⑤沉淀向步骤④的滤液中加入滤液体积3 20倍的醇或酮，混合均匀，析出寡聚透明质酸盐沉淀；
⑥脱水干燥将步骤⑤中的寡聚透明质酸盐沉淀分离出来，用有机溶剂脱水，然后真空干燥，得寡聚透明质酸盐。上述方法中，所用的芽孢杆菌透明质酸酶即芽孢杆菌(feci77m sp. ) A50 CGMCCNO. 5744发酵得到的透明质酸酶比活为8Xl(Tl. 5X 107IU/mg，酶的加入量为每Ikg透明质酸或其盐配制的溶液中加入2 X 1(Τ5 X IO7IU的纯化酶。透明质酸酶对透明质酸有很好的降解性，只要加入合适的透明质酸酶，即可以得到任意小分子量的透明质酸，因此在酶解时，控制时间的长短即可得到所需分子量的透明质酸。上述步骤①中，所述的透明质酸盐为透明质酸的钠盐、钾盐、镁盐、钙盐或锌盐。上述步骤②中，采用酸或碱调节pH至4 9，所述酸为盐酸、冰乙酸、硫酸或磷酸，所述碱为氢氧化钠或氢氧化钾。
上述步骤④中，所述易溶性无机盐为钠盐、钾盐、钙盐、锌盐或镁盐，优选钠、钾、钙、锌、镁的氯化物、硫酸盐、硝酸盐。此外，步骤④中以滤膜过滤酶解液，滤去透明质酸酶等杂质，提高了产物的纯度，所选滤膜为本领域常用的过滤膜即可，只要满足孔径的要求都能用于本发明，滤膜的孔径为O. 45ΜΠ1，材质可以是纤维素酯类、聚砜类、聚酰胺类。上述步骤⑤中，所述醇或酮优选为乙醇、丙酮、甲醇、丙醇或异丙醇。上述步骤⑥中，脱水所用的有机溶剂为与水互溶的有机溶剂，将寡聚透明质酸盐沉淀加入此有机溶剂中可以带走沉淀中的大部分水，优选的有机溶剂为酮或醇，最优选的为常用的乙醇、丙酮。上述步骤②中，优选的酶解温度为35 45°C，优选的酶解pH为5. 5^7. 5。上述方法中，所得寡聚透明质酸盐为白色粉末或颗粒，通过调节反应条件，例如透明质酸酶的加入量、酶解时间等，可以得到IO4Da以下的不同分子量的寡聚透明质酸盐，在实际生产和应用中，比较常用的寡聚透明质酸盐的分子量在300(Tl04Da范围，此范围端点值3000Da可以包括，也可以不包括，而端点值IO4Da不包括，可以通过调节反应条件得到该范围内任意分子量的寡聚透明质酸盐，例如分子量可以是400(Tl0000Da (不包括端点IOOOODa),也可以是3000 9500 Da(不包括端点3000Da)，也可以是320(T9500Da，也可以是400(T9500Da 等。上述方法中，所得寡聚透明质酸盐含量大于95%，其O. 1%水溶液的pH在6 8之间，红外图谱与欧洲药典标准图谱一致，性能良好，结构未被破坏。本发明介绍了酶切法制备寡聚透明质酸盐的工艺，该工艺利用芽孢杆菌产生的透明质酸酶降解透明质酸或其盐，经过除酶、醇或酮沉淀、脱水干燥而成，此法操作简单，条件温和，对产品结构无破坏，无环境污染，而且发酵来源的透明质酸酶成本低，适合大规模工业化生产，制备的寡聚透明质酸盐具有透皮吸收性好、纯度高、无细胞毒性、抗氧化能力强等优点，可用在化妆品、食品及医药领域，前景广阔。保藏信息
本发明芽孢杆菌QBacillus sp. ) A50已于2012年2月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC NO. 5744。
图I为不同方法制备的寡聚透明质酸盐的红外图谱，其中a为比较例I寡聚透明质酸盐的红外图谱，b为实施例8制得的寡聚透明质酸盐的红外图谱，c为透明质酸钠的欧洲药典标准图谱；
图2为寡聚透明质酸盐的透皮吸收比例 图3为寡聚透明质酸盐的DPPH自由基清除能力 图4为寡聚透明质酸盐的还原能力图。
具体实施例方式下面结合具体实施例、比较例和实验例，进一步详细说明本发明。如无特别说明，下述实施例中硫酸铵的浓度为质量体积浓度。下述实施例中，寡聚透明质酸盐的分子量测定采用Laurent法，含量测定采用HPLC法，寡聚透明质酸与普通透明质酸都是由N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸双糖 重复单位构成的，因此它们的含量等于双糖的含量，可以用芽孢杆菌透明质酸酶将寡聚透明质酸或普通透明质酸降解成双糖，通过HPLC法测定双糖含量，得到寡聚透明质酸盐或普通透明质酸的含量。本发明降解透明质酸或其盐所用的透明质酸酶(即芽孢杆菌透明质酸酶，下同)是由芽孢杆菌A50发酵得透明质酸酶发酵液，然后经离心、硫酸铵分级沉淀、超滤等步骤得到的。其制备过程是取斜面菌种(芽孢杆菌心sp. )A50 CGMCC NO. 5744)接种于已灭菌的种子培养基中，25 40°C、10(T200rpm下培养l(T24h，然后将种子液接种于已灭菌的发酵培养基中，接种量为3 15%，25^400C、10(T300rpm下培养12 24h，发酵过程中用酸将pH维持在6. (Γ8. O,发酵结束得透明质酸酶发酵液，发酵液经1000(Tl5000rpm离心l(T20min得上清液，上清液用硫酸铵沉淀，取硫酸铵在上清液中的浓度为20°/Γ35%时所得的透明质酸酶沉淀，溶于磷酸盐缓冲液中，最后经3 X IO4Da的超滤膜除去小分子杂质，得酶解用透明质酸酶。所用的培养基为
斜面培养基(IOOmL):蛋白胨 O. 2 2. 0g，酵母粉 O. 2 2. 0g，K2HPO4 · 3H20 O. 05 O. 15g,MgSO4 ·7Η20 O. 05 O. 15g，葡萄糖O. 5 I. 5g，琼脂粉2. 0g，pH调至6. 0 8· 0，斜面培养的温度为 25 40°C。种子培养基(IOOmL):蛋白胨0.2 2.(^，酵母粉0.2 2.(^，1(2册04*3!120 O. 05 O. 15g, MgSO4 · 7H20 O. 05 O. 15g,葡萄糖 O. 5 I. 5g, pH 调至 6. 0 8· O。发酵培养基(IOOmL):蛋白胨O. 2 2. Og,酵母粉 O. 2 2. 0g, K2HPO4 · 3Η20O. 05 O. 15g,MgSO4 ·7Η20 O. 05 O. 15g，葡萄糖 O. 5 I. 5g,Tween80 O. 05mL，pH调至 6. 0 8· O。采用中国药典方法测定由以上方案制得的发酵液中的透明质酸酶活力在1\105 3父10加/1^，纯化后的透明质酸酶比活为8Χ 106 1. 5Χ 107IU/mg。下面提供几个制备透明质酸酶的优选实施例
实施例I
斜面培养基组成(IOOmL):蛋白胨 O. 2g，酵母粉 2. 0g, K2HPO4 · 3H20 O. 05g, MgSO4 · 7H20O. 05g，葡萄糖0. 5g，琼脂粉2. 0g，用盐酸将pH调至6. O。种子培养基组成(IOOmL):蛋白胨O. 2g，酵母粉 2. 0g, K2HPO4 · 3H20 O. 05g，MgSO4 · 7H20 0.05g，葡萄糖O. 5g，用盐酸将pH调至6.0。发酵培养基组成(IOOmL):蛋白胨O. 2g，酵母粉 2. 0g, K2HPO4 · 3H20 O. 05g，MgSO4 · 7H20 0. 05g,葡萄糖 0. 5g, Tween80 0. 05mL。取斜面菌种(芽孢杆菌UaciJJw1S sp. ) A50 CGMCC NO. 5744)接种于已灭菌的种子培养基中，25°C，150rpm培养24h，然后将种子液接种于已灭菌的发酵培养基中，接种量为10%，250C，200rpm培养24h，发酵过程中用硫酸将pH维持在6. O,发酵生产得到透明质酸酶发酵液，发酵液经IOOOOrpm离心20min得上清液，将上清液中加入硫酸铵，使其浓度为20%，过滤除去产生的沉淀，然后继续加入硫酸铵，至其浓度为35%为止，取得到的沉淀即为透明质酸酶，将得到的透明质酸酶沉淀溶于磷酸盐缓冲液(pH5.8，5mmol/L)中，最后经3X IO4Da的超滤膜除去小分子杂质，得纯化后透明质酸酶。采用中国药典方法测定发酵液中透明质酸酶活力为1.0X105IU/mL，纯化后的透明质酸酶比活为8X106IU/mg。实施例2
斜面培养基组成(IOOmL):蛋白胨 I. 0g，酵母粉 I. 0g, K2HPO4 · 3H20 O. lg, MgSO4 · 7H20O. lg，葡萄糖l.Og，琼脂粉2. 0g，用磷酸将pH调至7. O。种子培养基组成(IOOmL):蛋白胨I. 0g，酵母粉 I. 0g, K2HPO4 · 3H20 O. Ig,MgSO4 · 7H20 O. lg，葡萄糖I. 0g，用磷酸将pH调至7. O。发酵培养基组成(IOOmL):蛋白胨I. 0g，酵母粉 I. 0g, K2HPO4 · 3H20 0. Ig,MgSO4 · 7H20 0. lg，葡萄糖 I. 0g, Tween80 0. 05mL。取斜面菌种(芽孢杆菌UaciJJw1S sp. ) A50 CGMCC NO. 5744)接种于已灭菌的种子培养基中，30°C, IOOrpm培养15h，然后将种子液接种于已灭菌的发酵培养基中，接种量为10%，350C，300rpm培养16h，发酵过程中用硫酸将pH维持在7. O,发酵生产得到透明质酸酶发酵液，发酵液经15000rpm离心IOmin得上清液，上清液用硫酸铵沉淀，取得到的透明质酸酶沉淀溶于磷酸盐缓冲液(PH6. 0，lOmmol/L)中，最后经3X IO4Da的超滤膜除去小分子杂质，得纯化后透明质酸酶。采用中国药典方法测定发酵液中透明质酸酶活力为3. OX IO5IU/mL，纯化后的透明质酸酶比活为I. 5X107IU/mg。实施例3
斜面培养基组成(IOOmL):蛋白胨 I. 5g，酵母粉 I. 5g，K2HPO4 · 3H20 0. 15g，MgSO4 · 7H200. 15g，葡萄糖1.5g，琼脂粉2. 0g，用硫酸将pH调至8.0。种子培养基组成(IOOmL):蛋白胨I. 5g，酵母粉 I. 5g，K2HPO4 · 3H20 O. 15g，MgSO4 · 7H20 0. 15g，葡萄糖I. 5g，用硫酸将pH调至8. 0。发酵培养基组成(IOOmL):蛋白胨0. 5g，酵母粉 I. 5g，K2HPO4 · 3H20 0. lg,MgSO4 · 7H20 0. 05g，葡萄糖 I. 5g, Tween80 0. 05mL。取斜面菌种(芽孢杆菌UaciJJw1S sp. ) A50 CGMCC NO. 5744)接种于已灭菌的种子培养基中，35°C,200rpm培养13h，然后将种子液接种于已灭菌的发酵培养基中，接种量为10%，400C，IOOrpm培养12h，发酵过程中用盐酸将pH维持在7. O,发酵生产得到透明质酸酶发酵液，发酵液经12000rpm离心15min得上清液，上清液用硫酸铵沉淀，取得到的透明质酸酶沉淀溶于磷酸盐缓冲液(pH6. 2,5mmol/L)中，最后经3 X IO4Da的超滤膜除去小分子杂质，得纯化后透明质酸酶。采用中国药典方法测定发酵液中透明质酸酶活力为I. 2X IO5IU/mL，纯化后的透明质酸酶比活为I. 0X107IU/mg。实施例4
斜面培养基组成(IOOmL):蛋白胨 2. 0g，酵母粉 0. 5g，K2HPO4 · 3H20 0. 05g, MgSO4 · 7H20O. 05g，葡萄糖I. Og,琼脂粉2. Og,用硫酸将pH调至6. 5。种子培养基组成(IOOmL):蛋白胨2. 0g，酵母粉 O. 5g，K2HPO4 · 3H20 O. 05g，MgSO4 · 7H20 0. 05g，葡萄糖I. 0g，用硫酸将pH调至6. 5。发酵培养基组成(IOOmL):蛋白胨I. 5g，酵母粉 O. 2g，K2HPO4 · 3Η200· 15g，MgSO4 · 7H20 0. 15g，葡萄糖 I. 5g, Tween80 0. 05mL。取斜面菌种(芽孢杆菌sp. ) A50 CGMCC NO. 5744)接种于已灭菌的种子培养基中，40°C，180rpm培养10h，然后将种子液接种于已灭菌的发酵培养基中，接种量为10%，360C，280rpm培养15h，发酵过程中用磷酸将pH维持在8. O,发酵生产得到透明质酸酶发酵液，发酵液经IOOOOrpm离心20min得上清液，上清液用硫酸铵沉淀，取得到的透明质酸酶沉淀溶于磷酸盐缓冲液(PH6. 4，10臟01/1)中，最后经3\1040&的超滤膜除去小分子杂质，得纯化后透明质酸酶。采用中国药典方法测定发酵液中透明质酸酶活力为 I. 5X IO5IU/mL，纯化后的透明质酸酶比活为I. 2X107IU/mg。实施例5
斜面培养基组成(IOOmL):蛋白胨 O. 5g，酵母粉 I. 5g，K2HPO4 · 3H20 O. 15g，MgSO4 · 7H20
0.lg,葡萄糖0. 5g，琼脂粉2. 0g，用磷酸将pH调至7. 5。种子培养基组成(IOOmL):蛋白胨O. 5g，酵母粉 I. 5g，K2HPO4 · 3H20 O. 15g，MgSO4 · 7H20 0. lg，葡萄糖0. 5g，用磷酸将pH调至7. 5。发酵培养基组成(IOOmL):蛋白胨2.0g，酵母粉0. 2g，Κ2ΗΡ04· 3H20 0. 05g，MgSO4 · 7H20 0. 05g,葡萄糖 0. 5g, Tween80 0. 05mL。取斜面菌种(芽孢杆菌sp. ) A50 CGMCC NO. 5744)接种于已灭菌的种子培养基中，36°C，120rpm培养14h，然后将种子液接种于已灭菌的发酵培养基中，接种量为10%，300C，180rpm培养20h，发酵过程中用磷酸将pH维持在7. 5，发酵生产得到透明质酸酶发酵液，发酵液经IOOOOrpm离心20min得上清液，上清液用硫酸铵沉淀，取得到的透明质酸酶沉淀溶于磷酸盐缓冲液(PH6. 6，20mmol/L)中，最后经3 X IO4Da的超滤膜除去小分子杂质，得纯化后透明质酸酶。采用中国药典方法测定发酵液中透明质酸酶活力为2. OX IO5IU/mL，纯化后的透明质酸酶比活为I. 3X107IU/mg。实施例6
斜面培养基组成(IOOmL):蛋白胨 I. 0g，酵母粉 I. 0g, K2HPO4 · 3H20 0. lg, MgSO4 · 7H20
0.15g，葡萄糖1.5g，琼脂粉2. 0g，用盐酸将pH调至7. O。种子培养基组成(IOOmL):蛋白胨I. 0g，酵母粉 I. 0g, K2HPO4 · 3H20 0. Ig,MgSO4 · 7H20 O. 15g，葡萄糖I. 5g，用盐酸将pH调至7. O。发酵培养基组成(IOOmL):蛋白胨I. 5g，酵母粉 O. 5g，K2HPO4 · 3H20 O. 05g，MgSO4 · 7H20 0. 15g，葡萄糖 I. 5g, Tween80 0. 05mL。取斜面菌种(芽孢杆菌UaciJJw1S sp. ) A50 CGMCC NO. 5744)接种于已灭菌的种子培养基中，32°C, 150rpm培养18h，然后将种子液接种于已灭菌的发酵培养基中，接种量为10%，280C，200rpm培养22h，发酵过程中用盐酸将pH维持在8. O,发酵生产得到透明质酸酶发酵液，发酵液经15000离心IOmin得上清液，上清液用硫酸铵沉淀，取得到的透明质酸酶沉淀溶于磷酸盐缓冲液(pH6. 8,30mmol/L)中，最后经3 X IO4Da的超滤膜除去小分子杂质，得纯化后透明质酸酶。采用中国药典方法测定发酵液中透明质酸酶活力为I. 8 X IO5IU/mL，纯化后的透明质酸酶比活为I. 2X107IU/mg。实施例7
斜面培养基组成(IOOmL):蛋白胨 2. 0g，酵母粉 I. 5g，K2HPO4 · 3H20 O. 05g, MgSO4 · 7H20
0.15g，葡萄糖0. 5g，琼脂粉2. 0g，用磷酸将pH调至7. 0。种子培养基组成(IOOmL):蛋白胨2. 0g，酵母粉 I. 5g，K2HPO4 · 3H20 O. 05g，MgSO4 ·7Η20 O. 15g，葡萄糖O. 5g，用磷酸将pH调至7. O。发酵培养基组成(IOOmL):蛋白胨O. 5g，酵母粉 I. 5g，K2HPO4 · 3Η200· 15g，MgSO4 · 7H20 0. lg，葡萄糖 I. Og, Tween80 0. 05mL。取斜面菌种(芽孢杆菌sp. ) A50 CGMCC NO. 5744)接种于已灭菌的种
子培养基中，30°C,200rpm培养20h，然后将种子液接种于已灭菌的发酵培养基中，接种量为10%，340C，220rpm培养14h，发酵过程中用磷酸将pH维持在7. 5，发酵生产得到透明质酸酶发酵液，发酵液经12000rpm离心15min得上清液，上清液用硫酸铵沉淀，取得到的透明质酸酶沉淀溶于磷酸盐缓冲液(PH5. 9，50mmol/L)中，最后经3 X IO4Da的超滤膜除去小分子杂质，得纯化后透明质酸酶。采用中国药典方法测定发酵液中透明质酸酶活力为I. 2X IO5IU/mL,纯化后的透明质酸酶比活为8X 106IU/mg。本发明透明质酸酶活性高，热稳定性和pH稳定性好，能够满足工业化大批量降解透明质酸所需的酶用量，且酶的制备过程简单、条件温和，成本低，解决了化学降解污染环境、生物降解酶来源有限、活性低、价格高的缺陷。下面列举以本发明比酶活在SXlO6^l. 5 X 107IU/mg之间的透明质酸酶酶切法制备寡聚透明质酸盐的优选实施例。实施例8
向Im3不锈钢溶解罐中加入Im3纯化水，边搅拌边向该溶解罐中加入分子量为3 X IO6Da的透明质酸钠10kg，待完全溶解后，用冰乙酸调节pH为4. 0，并升温至20°C，加入4X IO8IU的芽孢杆菌透明质酸酶，酶解至所需分子量时，将温度升高至50°C，维持60min，加入IkgNaCl，用O. 45Mfli的混合纤维素滤膜过滤酶解液，然后用20m3的乙醇沉淀，得到透明质酸钠沉淀，该沉淀用乙醇脱水，然后真空干燥即得寡聚透明质酸钠。该寡聚透明质酸钠为白色颗粒，含量96. 8%，分子量8. 6kDa，pH6. 8，其红外图谱见图1，与欧洲药典标准图谱一致。实施例9
向Im3不锈钢溶解罐中加入Im3纯化水，边搅拌边向该溶解罐中加入分子量为2 X IO4Da的透明质酸钾300kg，待完全溶解后，用氢氧化钾调节pH为9. 0，并升温至48°C，加入
1.35X IOltlIU的芽孢杆菌透明质酸酶，酶解至所需分子量时，将温度升高至90°C，维持IOmin,加入100kg KCl,用O. 45Mm的聚砜滤膜过滤酶解液,然后用5m3的丙酮沉淀,得到透明质酸钾沉淀，该沉淀用丙酮脱水，然后真空干燥即得寡聚透明质酸钾。该寡聚透明质酸钾为白色粉末，含量98. 8%，分子量3. 2kDa，pH6. 5，其红外图谱与欧洲药典标准图谱一致。实施例10
向Im3不锈钢溶解罐中加入Im3纯化水，边搅拌边向该溶解罐中加入分子量为
I.6 X IO6Da的透明质酸钠20kg，待完全溶解后，用氢氧化钠调节pH为8. 0，并升温至40°C，加入I. 2X IO9IU的芽孢杆菌透明质酸酶，酶解至所需分子量时，将温度升高至60°C，维持60min,加入50kg NaCl,用O. 45Mm的尼龙滤膜过滤酶解液,然后用IOm3的丙醇沉淀,得到透明质酸钠沉淀，该沉淀用丙醇脱水，然后真空干燥即得寡聚透明质酸钠。该寡聚透明质酸钠为白色粉末，含量97. 6%，分子量6. 2kDa，pH7. 1，其红外图谱与欧洲药典标准图谱一致。实施例11
向Im3不锈钢溶解罐中加入Im3纯化水，边搅拌边向该溶解罐中加入分子量为8 X IO5Da的透明质酸钙60kg，待完全溶解后，用冰乙酸调节pH为7. 0，并升温至35°C，加入
2.4X IO9IU的芽孢杆菌透明质酸酶，酶解至所需分子量时，将温度升高至70°C，维持30min，加入35kg CaCl2,用O. 45Mm的聚醚砜滤膜过滤酶解液,然后用3m3的异丙醇沉淀,得到透明质酸钙沉淀，该沉淀用异丙醇脱水，然后真空干燥即得寡聚透明质酸钙。该寡聚透明质酸钙为白色粉末，含量96. 6%，分子量5. 6kDa，pH6. 5，其红外图谱与欧洲药典标准图谱一致。实施例12 向Im3不锈钢溶解罐中加入Im3纯化水，边搅拌边向该溶解罐中加入分子量为2 X IO5Da的透明质酸钠100kg，待完全溶解后，用硫酸调节pH为6. 0，并升温至25°C，加入4X IO9IU的芽孢杆菌透明质酸酶，酶解至所需分子量时，将温度升高至80°C，维持20min，加入60kgNaCl，用O. 45Mfli的聚醚砜滤膜过滤酶解液，然后用6m3的甲醇沉淀，得到透明质酸钠沉淀，该沉淀用甲醇脱水，然后真空干燥即得寡聚透明质酸钠。该寡聚透明质酸钠为白色颗粒，含量98. 7%，分子量7. 6kDa，pH7. 3，其红外图谱与欧洲药典标准图谱一致。实施例13
向Im3不锈钢溶解罐中加入I m3纯化水，边搅拌边向该溶解罐中加入分子量为IO5Da的透明质酸锌200kg，待完全溶解后，用盐酸调节pH为5. 0，并升温至20°C，加入8X IO9IU的芽孢杆菌透明质酸酶，酶解至所需分子量时，将温度升高至55°C，维持50min，加入20kgZnCl2，用O. 45ΜΠ1的硝化纤维素滤膜过滤酶解液，然后用4. 5m3的乙醇沉淀，得到透明质酸锌沉淀，该沉淀用乙醇脱水，然后真空干燥即得寡聚透明质酸锌。该寡聚透明质酸锌为白色颗粒，含量96. 8%，分子量9. IkDa, pH6. 8，其红外图谱与欧洲药典标准图谱一致。实施例14
向Im3不锈钢溶解罐中加入Im3纯化水，边搅拌边向该溶解罐中加入分子量为5 X IO5Da的透明质酸30kg，待完全溶解后，用氢氧化钠调节pH为6. 2，并升温至25°C，加入8 X IO8IU的芽孢杆菌透明质酸酶，酶解至所需分子量，将温度升高至60°C，维持15min，加入20kgNaCl，用O. 45Mfli的聚醚砜滤膜过滤酶解液，然后用6m3的乙醇沉淀，得到透明质酸钠沉淀，该沉淀用乙醇脱水，然后真空干燥即得寡聚透明质酸钠。该寡聚透明质酸钠为白色颗粒，含量98. 2%，分子量4. OkDa, pH7. 1，其红外图谱与欧洲药典标准图谱一致。实施例15
向Im3不锈钢溶解罐中加入I m3纯化水，边搅拌边向该溶解罐中加入分子量为IO6Da的透明质酸钠15kg，待完全溶解后，用盐酸调节pH为5. 8，并升温至40°C，加入5 X IO8IU的芽孢杆菌透明质酸酶，酶解至所需分子量时，将温度升高至55°C，维持60min，加入20kgNaCl，用O. 45Mfli的硝化纤维素滤膜过滤酶解液，然后用4. 5m3的乙醇沉淀，得到透明质酸钠沉淀，该沉淀用乙醇脱水，然后真空干燥即得寡聚透明质酸钠。该寡聚透明质酸钠为白色颗粒，含量96. 1%，分子量9. 5kDa，pH6. 8，其红外图谱与欧洲药典标准图谱一致。比较例I
向2L烧杯中加入IL纯化水，边搅拌边向烧杯中加入分子量为8X IO5Da的透明质酸钠50g，待完全溶解后，加浓盐酸10mL，降解至所需分子量时，用氢氧化钠调节pH至6. 2，用O. 45Mffl的混合纤维素滤膜过滤降解液，然后用IOL的乙醇沉淀，得到透明质酸钠沉淀，该沉淀用乙醇脱水，然后真空干燥即得寡聚透明质酸钠。该寡聚透明质酸钠为微黄色粉末，含量63. 8%,分子量 8. IkDa, ρΗ4· 8。比较例2
向2L烧杯中加入IL纯化水，边搅拌边向烧杯中加入分子量为5Χ IO5Da的透明质酸IOOg,待完全溶解后，加浓盐酸10mL，降解至所需分子量时，用氢氧化钠调节pH至6. 5，用
O.45Mffl的聚砜滤膜过滤降解液，然后用IOL的乙醇沉淀，得到透明质酸钠沉淀，该沉淀用乙醇脱水，然后真空干燥即得寡聚透明质酸钠。该寡聚透明质酸钠为微黄色粉末，含量60. 2%，分子量 7. 6kDa, ρΗ4· 2。比较例3
向Im3搪瓷罐中加入Im3纯化水，边搅拌边向烧杯中加入分子量为6Χ IO5Da的透明质酸30kg，待完全溶解后，加浓盐酸10L，降解至所需分子量时，用氢氧化钠调节pH至7. 0，用
O.45ΜΠ1的聚砜滤膜过滤降解液，然后用IOm3的乙醇沉淀，得到透明质酸钠沉淀，该沉淀用乙醇脱水，然后真空干燥即得寡聚透明质酸钠。该寡聚透明质酸钠为微黄色粉末，含量63. 2%，分子量 7. 8kDa, ρΗ6· 2。将比较例及实施例中得到的透明质酸盐的含量进行比较，见表I。
表I寡聚明瘓_盤的含量(Ig-LCji)
'it较例 Imm—
1 2 3 8 9 I 10 11 12 13 14 15
含量
.' ￠3.8 60.2 63 2 96—8 98 8 9+7.6 96.6 98.7 %.8 98.2 96J
( . HFLcfe)从表I可以看出，酶切法制备的寡聚透明质酸盐含量显著高于化学降解法制备的寡聚透明质酸盐(P < O. 05)。动物酶降解得到的寡聚透明质酸盐，具有促血管生成、促进创伤愈合、抗肿瘤及免疫调节等生物活性。微生物来源透明质酸酶降解得到的寡聚透明质酸盐的生物学活性未见报道。但以下的实验研究表明该发明中得到的寡聚透明质酸盐无细胞毒性，与化学降解法得到的寡聚透明质酸盐相比，清除自由基作用强，还原能力强，因此可用于化妆品中，该寡聚透明质酸盐分子量小，易于被肠道吸收，可用于食品中，同时该寡聚透明质酸盐具有促血管生成、促进创伤愈合的作用，因此可用于医药领域。实验例I
酶切法制备的寡聚透明质酸盐的细胞毒性研究。试验采用L929小鼠成纤维细胞作为观察细胞，RPMI-1640培养基添加10%胎牛血清作为完全培养基，阴性对照为不添加任何供试样品的完全培养基，阳性对照为5g/L苯酚溶液(溶于完全培养基)，空白对照为无细胞完全培养基，供试品为完全培养基加寡聚透明质酸钠样品。按下式计算相对增殖率(财况)。RGR = — X 100%
式中RGR——相对增殖率，% ；
A—供试品组(阴性、阳性组)吸光度，扣除空白；
A0—阴性对照组吸光度，扣除空白。细胞毒性根据RGR按表2分级标准确定级别。阳性对照组至少为3级反应，供试品细胞毒性反应程度不大于2级时，认为其细胞毒性可接受。
权利要求
1.一种酶切法制备寡聚透明质酸盐的方法，其特征是以芽孢杆菌(ifeci77i/5· sp. )A50CGMCC NO. 5744发酵培养得到的芽孢杆菌透明质酸酶对透明质酸或其盐进行降解。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征是包括以下步骤 ①配制透明质酸或其盐溶液向纯化水中加入分子量大于IOkDa的透明质酸或其盐，配制成质量体积浓度为广30%的溶液； ②酶解调节步骤①中溶液的温度为2(T48°C、pH为Γ9，然后向其中加入芽孢杆菌透明质酸酶，将透明质酸或其盐酶解至所需分子量，得酶解液； ③灭活将酶解液在5(T90°C下保持l(T60min，对芽孢杆菌透明质酸酶进行灭活； ④过滤向灭活后的酶解液中加入易溶性无机盐，搅拌至完全溶解，然后用孔径为O.45Mm的滤膜过滤，得滤液，每IOOmL酶解液中加入O. f IOg的易溶性无机盐； ⑤沉淀向步骤④的滤液中加入滤液体积3 20倍的醇或酮，混合均匀，得到寡聚透明质酸盐沉淀； ⑥脱水干燥将步骤⑤中的寡聚透明质酸盐沉淀分离出来，用有机溶剂脱水，然后真空干燥，得寡聚透明质酸盐。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其特征是每Ikg透明质酸或其盐配制成的溶液中加入2 X IO7飞X IO7IU的芽孢杆菌透明质酸酶。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征是所述芽孢杆菌透明质酸酶的制备方法包括以下步骤 (1)将芽孢杆菌UaciBmsp. )A50 CGMCC NO. 5744菌种进行斜面培养，得斜面菌种； (2)取斜面菌种接种到已灭菌的种子培养基中，在25 40°C、10(T200rpm的条件下培养10 24h，得种子液； (3)将种子液接种到已灭菌的发酵培养基中，在25 40°C、10(T300rpm的条件下培养12 2处，得发酵液； (4)离心分离发酵液，取上清液，将上清液用硫酸铵分级沉淀出芽孢杆菌透明质酸酶； (5)将步骤(4)沉淀出来的透明质酸酶溶于磷酸盐缓冲液中，超滤除去小分子杂质，得纯化的芽孢杆菌透明质酸酶； 对芽孢杆菌进行培养时，每IOOmL斜面培养基中含有以下成分蛋白胨O. 2^2. 0g，酵母粉 O. 2 2. 0g, K2HPO4 · 3H20 O. 05 O. 15g, MgSO4 · 7H20 O. 05 O. 15g,葡萄糖 O. 5 I. 5g,琼脂粉2.0g, pH 调至 6. 0 8· O ； 每IOOmL种子培养基中含有以下成分蛋白胨O. 2 2. 0g，酵母粉O. 2 2. Og7K2HPO4 ·3Η20O.05 O. 15g, MgSO4 · 7H20 O. 05 O. 15g,葡萄糖 O. 5 I. 5g, pH 调至 6. 0 8· O ； 每IOOmL发酵培养基中含有以下成分蛋白胨O. 2 2. 0g，酵母粉O. 2 2. Og7K2HPO4 ·3Η20O.05 O. 15g,MgSO4 ·7Η20 O. 05 O. 15g，葡萄糖 O. 5 I. 5g,Tween80 O. 05mL，pH调至 6. 0 8· O。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征是发酵液中芽孢杆菌透明质酸酶的酶活为I X IO5 3 X 105IU/mL，纯化后芽孢杆菌透明质酸酶的比活为8 X IO6 I. 5X107IU/mg。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征是步骤①中，透明质酸盐为透明质酸的钠盐、钾盐、镁盐、钙盐或锌盐；步骤②中，采用酸或碱调节pH至4 9，所述酸为盐酸、冰乙酸、硫酸或磷酸，所述碱为氢氧化钠或氢氧化钾；步骤④中，所述易溶性无机盐为钠盐、钾盐、钙盐、锌盐或镁盐；步骤⑤中，所述醇或酮为乙醇、丙酮、甲醇、丙醇或异丙醇；步骤⑥中，脱水所用的有机溶剂为酮或醇。
7.根据权利要求1飞中任一项所述的方法，其特征是步骤②中，优选的酶解温度为35 45 °C，酶解 pH 为 5. 5 7. 5。
8.根据权利要求f6中任一项所述的方法，其特征是将透明质酸酶解至分子量为300(Tl04Da ;所得寡聚透明质酸盐含量大于95%。
9.一种寡聚透明质酸盐，其特征是采用权利要求1飞中任一项所述的酶切法制备寡聚透明质酸盐的方法制得。
10.寡聚透明质酸盐在食品、化妆品或医药领域的应用，其特征是所述寡聚透明质酸盐由权利要求广6中任一项所述的酶切法制备寡聚透明质酸盐的方法制得。
全文摘要
本发明公开了酶切法制备寡聚透明质酸盐的方法及所得寡聚透明质酸盐和其应用，以芽孢杆菌(Bacillus sp.)A50 CGMCC NO.5744发酵培养得到的芽孢杆菌透明质酸酶对透明质酸或其盐进行降解，包括配制透明质酸或其盐溶液、酶解、灭活、过滤、沉淀、脱水干燥步骤。本发明利用芽孢杆菌产生的透明质酸酶降解透明质酸或其盐，经过除酶、醇或酮沉淀、脱水干燥而成，此法操作简单，条件温和，对产品结构无破坏，无环境污染，而且发酵来源的透明质酸酶成本低，适合大规模工业化生产，制备的寡聚透明质酸盐具有透皮吸收性好、纯度高、无细胞毒性、抗氧化能力强等优点，可用在化妆品、食品及医药领域。
文档编号C08B37/08GK102876748SQ20121031703
公开日2013年1月16日 申请日期2012年8月31日 优先权日2012年4月13日
发明者郭学平, 石艳丽, 冯宁, 王冠凤, 李海娜, 乔莉苹, 王海英, 栾贻宏, 刘爱华 申请人:华熙福瑞达生物医药有限公司