基于质谱的氧连接氮乙酰葡糖胺修饰糖蛋白质的分析方法
【技术领域】
[0001]一种基于质谱的氧连接氮乙酰葡糖胺(Ο-GlcNAc)修饰糖蛋白质分析方法。所述的O-GlcNAc修饰糖蛋白质蛋白酶酶解后生成肽段，利用高碘酸钠氧化，修饰基团氮乙酰葡糖胺上的对位轻基进行开环反应形成两个酸基基团，利用吉拉德试剂T(Girard ReagentT)上的酰阱和新生成的醛基反应，从而使Ο-GlcNAc修饰糖肽的化学衍生上季铵盐基团。季铵盐基团的存在能够有效地增强肽段的质谱响应信号，并且衍生后的糖肽在保留一定原糖修饰基团，进行后续质谱，通过数据库搜索等分析手段对该种糖基修饰的糖蛋白质进行分析鉴定。
【背景技术】
[0002]氧连接氮乙酰葡糖胺修饰是一种发生在蛋白质丝氨酸及苏氨酸残基上的翻译后修饰，是一种真核细胞内重要的单糖翻译后修饰，在细胞内信号通路中扮演重要作用。然而，该种翻译后修饰的糖蛋白糖蛋白质的研究存在诸多难点:丰度低、糖肽占总肽段比例小，质谱信号响应低，没有将修饰基团切除的特异性试剂等。
[0003]文献报道中对该种糖蛋白质常用的研究方法主要有酶促衍生富集法和凝集素亲和法。另外最近有文献(Journal of Proteome Research 2010, 9, 2200 - 2206)报道了一种利用高碘酸钠氧化氮乙酰葡糖胺形成醛基，利用酰阱凝胶富集研究该种糖蛋白的工作，该工作开发了利用化学手段研究氮乙酰葡糖胺修饰糖蛋白质的手段，相较昂贵的酶促衍生手段，为廉价大规模研究氮乙酰葡糖胺修饰糖蛋白质提供可能。
[0004]氧连接氮乙酰葡糖胺(O-GlcNAc)的修饰会抑制蛋白及肽的质谱响应信号，因此增强该糖肽的质谱响应信号对其基于质谱的分析鉴定将有极大的帮助。在蛋白质或肽段上衍生上季铵盐基团在增强样品质谱信号，改变样品电荷等方面有着广泛的应用。因此，我们通过季铵盐基团的修饰能有效地提高质谱信号，为后续的质谱分析研究提供帮助。
[0005]氧连接糖肽的二级质谱碎裂中，在CID碎裂模式下，碰撞碎裂能量往往集中于糖链的碎裂，无法获得较好的肽段碎裂信息。本方法中，在对修饰的氮乙酰葡糖胺基团进行了吉拉德试剂T的化学衍生，使其修饰的肽段在CID碎裂模式下能够得到较好的碎片信息。同时该方法也保留了部分氮乙酰葡糖胺基团的结构信息，利用二级质谱谱图的特征峰离子可有效提高谱图分析的可信度。
【发明内容】
[0006]衍生上季铵盐基团能够增强样品质谱信号，同时该化学衍生有利于肽段获得较好的CID 二级碎裂，为后续数据库搜索获得良好的肽段鉴定结果提供帮助。本发明的目的是提供一种对氧连接氮乙酰葡糖胺修饰糖蛋白质及糖肽的质谱分析方法，该方法通过对该糖基化修饰的化学衍生提高了糖肽质谱信号，并能够获得良好的二级质谱碎片信息。使后续的数据库搜索能够更好地鉴定氧连接氮乙酰葡糖胺修饰糖蛋白质。
[0007]为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:
[0008]O-GlcNAc修饰糖蛋白质蛋白酶酶解后生成肽段，利用高碘酸钠氧化，修饰基团氮乙酰葡糖胺上的对位羟基进行开环反应形成两个醛基基团，利用吉拉德试剂T(GirardReagent T)上的酰阱和新生成的醛基反应，从而使Ο-GlcNAc修饰糖肽的化学衍生上季铵盐基团。季铵盐基团的存在能够有效地增强肽段的质谱响应信号，并且衍生后的糖肽在保留一定原糖修饰基团，进行后续质谱，通过数据库搜索等分析手段对该种糖基修饰的糖蛋白质进行分析鉴定。
[0009]所述氧连接氮乙酰葡糖胺修饰糖蛋白质质谱分析方法，具体步骤如下:
[0010](1)蛋白质样品的酶解:对蛋白质样品进行变性还原烷基化后进行酶解，获得作为酶解产物的肽段。每100 μ g蛋白质加入3-6 μ 1 1Μ 二硫苏糖醇(DTT)，50_60°C反应1_2小时。之后加入8-12μ1 1Μ碘乙酸(ΙΑΑ)，避光反应10-30分钟。将处理后的蛋白质样品利用碳酸氢铵缓冲液稀释，pH值控制7.5-8.5之间，每100 μ g蛋白质加入2-5 μ g胰蛋白酶进行酶解，36-38°C反应16-24小时。酶解肽段利用反相液相色谱除去碳酸氢铵等小分子盐，冷冻干燥后获得肽段样品，为避免肽段N末端是丝氨酸或苏氨酸残基时存在的副反应，对获得的肽段样品进行甲醛二甲基化方法封闭N末端氨基。每100 μ g肽段加入3-5%甲醛溶液10-25 μ 1,0.5-0.8mM氰基硼氢化钠10-25 μ 1，反应0.5-2小时，反相除盐去除甲醛和氰基硼氢化钠。
[0011](2)氮乙酰葡糖胺基团氧化:在pH = 5-6的50mM乙酸钠缓冲溶液中，氧连接氮乙酰葡糖胺修饰糖蛋白质或糖肽样品与浓度为20-30mM的过量高碘酸钠溶液反应；反应温度35-40°C，反应时间4-8小时。氧化反应结束后，对于过量的高碘酸钠，加入4-6倍于高碘酸钠摩尔量亚硫酸钠，反应10-40分钟，终止氧化反应。
[0012](3)吉拉德试剂衍生反应:将经过高碘酸钠氧化的糖蛋白质样品于浓度为10-100mM的吉拉德试剂混合，反应1-6小时。反应过程在pH = 5-6的乙酸钠溶液中进行。
[0013](4)采用反相液相色谱分离除去未反应吉拉德试剂:采用反相C18或C8色谱住，流动相A:2%乙腈，98%水及0.1%三氟乙酸。流动相B:98%乙腈，2%水及0.1%三氟乙酸。采用2%流动相B上样，之后用上样缓冲液冲洗冲洗色谱柱5-15分钟，之后用80%流动相将糖蛋白质或糖肽样品洗脱下来，冷冻干燥。
[0014](5)采用液质联用，对肽段进行分离后采用质谱进行样品分析:利用碰撞诱导解离(Collis1n-1nduced dissociat1n, CID)模式对肽段进行二级碎裂，对于离子讲质谱，CID能量控制在30-50%。采集数据利用蛋白质组数据库搜索引擎进行糖肽的信息利用分析。
[0015](6)采集数据利用蛋白质组数据库搜索引擎进行糖肽的信息利用分析:数据库搜索的参数设置中，针对氧连接氮乙酰葡糖胺修饰，增加可变修饰的设置:1)修饰分子式C13H22N405,修饰位点丝氨酸和苏氨酸残基。2)修饰分子式C1SH33N705，修饰位点丝氨酸和苏氨酸残基。针对二甲基化修饰，增加可变修饰:1)修饰分子式C2H4，修饰位赖氨酸残基。2)修饰分子式C2H4，修饰位点肽段氮末端。搜库结果进一步处理，为增加结果的可信度，利用二级质谱图中的特征峰进行进一步筛选。对于修饰了一分子吉拉德试剂T的修饰肽段，二级谱中应包含特征峰M/z = 315.16，对于修饰了两分子吉拉德试剂T的修饰肽段，二级谱中应包含特征峰M/z = 214.625。
[0016]本发明具有如下优点:
[0017]1.本发明在氧连接氮乙酰葡糖胺修饰糖蛋白质及糖肽上衍生季铵盐基团，增强样品质谱信号。
[0018]2.本发明衍生的氧连接氮乙酰葡糖胺修饰糖蛋白质及糖肽，保留了部分原氮乙酰葡糖胺的基团，为后续质谱解谱分析提供信息。
[0019]3.本发明利用化学方法衍生的氧连接氮乙酰葡糖胺修饰糖蛋白质及糖肽，更加廉价，有利于大量大规模样品分析。
[0020]4.本发明衍生后的肽段能够在CID模式下获得较好的二级谱图，利于后续的数据库检索分析。
【附图说明】
[0021]图1氧连接氮乙酰葡糖胺修饰糖蛋白质化学衍生及质谱分析流程图；
[0022]图2氧连接氮乙酰葡糖胺修饰标肽TAPTSgTIAPG衍生后MALDI质谱；
[0023]图3标肽TAPTSgTIAPG衍生前后质谱信号增强幅度比较图a) MALDI衍生肽段与未衍生肽段1:5混合，b)LTQ衍生肽段与未衍生肽段1:1混合；
[0024]图4衍生后标肽TAPTSgTIAPG的CID模式下二级质谱图a)修饰了两分子吉拉德试剂T的肽段二级质谱图，b)修饰了一分子吉拉德试剂T的肽段二级质谱图；
[0025]图5衍生后标肽TAPTSgTIAPG的CID模式下碎裂模式示意图a)修饰了两分子吉拉德试剂T的肽段二级碎裂模式，b)修饰了一分子吉拉德试剂T的肽段二级碎裂模式。
【具体实施方式】
[0026]下面通过实施例对本发明提供的方法进行详述，但不以任何形式限制本发明。
[0027]实施例1
[0028]氧连接氮乙酰葡糖胺修饰标准糖肽的吉拉德试剂标记:
[0029]1.如图1所示，按如下流程操作:
[0030]1)标准糖肽N末端二甲基化封闭:取10 μ g肽段TAPTSgTIAPG加入4%甲醛溶液1 μ 1，0.6mM氰基硼氢化钠1 μ 1，反应0.5小时，反相除盐去除甲醛和氰基硼氢化钠。
[0031]2)氮乙酰葡糖胺基团氧化:在pH = 5.5的50mM乙酸钠缓冲溶液中，糖肽样品与浓度为20mM高碘酸钠溶液反应?’反应温度37°C，反应时间6小时。氧化反应结束后，加入5倍于高碘酸钠摩尔量亚硫酸钠，反应20分钟，终止氧化反应。
[0032]3)吉拉德试剂衍生反应:将经过高碘酸钠氧化的糖肽样品于浓度为50mM的吉拉德试剂T混合，反应2小时。反应过程在pH = 5.5的50mM乙酸钠溶液中进行。采用反相液相色谱分离除去未反应吉拉德试剂。
[0033]2.所衍生后的标肽的MALDI质谱图如图2所示
[0034]3.由分子量计算得知，一分子标肽与一分子吉拉德试剂T反应，没有明显的未反应的标肽峰。因此可认为该标肽的标记效率接近完全。
[0035]实施例2
[0036]蛋白质样品的酶解和标记:
[0037](1)对鼠脑样品提取蛋白质样品进行变性还原烷基化后进行酶解??每100μ g提取蛋白质加入4μ1 1Μ 二硫苏糖醇(DTT)，56°C反应1.5小时。之后加入8μ1 1Μ碘乙酸(IAA)，避光反应30分钟。将处理后的蛋白质样品利用碳酸氢铵缓冲液稀释，pH = 8。每100 μ g蛋白质加入4 μ g胰蛋白酶进行酶解，37°C反应24小时。酶解肽段利用反相液相色谱除去碳酸氢铵等小分子盐，冷冻干燥后获得的肽段样品进行甲醛二甲基化方法封闭N末端氨基。每100 μ g肽段加入4%甲醛溶液15 μ 1，0.6mM氰基硼氢化钠15 μ 1，反应0.5小时，反相除盐去除甲醛和氰基硼氢化钠。
[0038](2)氮乙酰葡糖胺基团氧化:在pH = 5.5的50mM乙酸钠缓冲溶液中，氧连接氮乙酰葡糖胺修饰糖蛋白质或糖肽样品与浓度为20mM高碘酸钠溶液反应；反应温度37°C，反应时间6小时。氧化反应结束后，加入5倍于高碘酸钠摩尔量亚硫酸钠，反应30分钟，终止氧化反应。
[0039](3)吉拉德试剂衍生反应:将经过高碘酸钠氧化的糖蛋白质样品于浓度为50mM的吉拉德试剂混合,反应6小时。反应过程在pH = 5.5的乙酸钠溶液中进行。
[0040](4)采用反相液相色谱分离除去未反应吉拉德试剂:采用反相C18或C8色谱住，流动相A:2%乙腈，98%水及0.1%三氟乙酸。流动相B:98%乙腈，2%水及0.1%三氟乙酸。采用2%流动相B上样，之后用上样缓冲液冲洗冲洗色谱柱10分钟，之后用80%流动相将糖蛋白质或糖肽样品洗脱下来，冷冻干燥。
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