专利名称：使用1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-d-葡糖醇的n-烷基衍生物治疗乙型肝炎病毒感染的制作方法
相关申请本申请是1994年1月13日递交的共同未决申请流水号08/181,519的后续申请。
背景技术：
本发明涉及抑制乙型肝炎病毒的新方法，更具体地说，本发明涉及使用1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡糖醇的N-烷基衍生物以抑制受所说病毒感染的细胞中乙肝病毒的复制和分泌。
乙型肝炎病毒(HBV)是急性和慢性肝病的病原体[阿约拉等，世界健康组织公报，66,443-455(1988)]。尽管可得到有效的疫苗[目前使用的两种HBV疫苗是麦克公司的Recombivax HB和史密斯克兰.比彻姆公司的Engerix-B]，但世界上仍有3亿多人受病毒的慢性感染[埃德等，肝病进展，泼伯和沙夫纳编辑(Grune & Stratton，奥拉多，FL)，第8卷，PP.367-394(1986)]。对他们而言，疫苗没有治疗作用。根据理查德.杜马博(国家传染病基金会的高级官员)的报道，仅美国每年估计有300,000例HBV感染发生[医学世界新闻34(18).20-21(1993)]。受HBV慢性感染的病人中有25-40％会发展成严重的肝病。因此，发现有效的抗HBV疗法很重要。
α-干扰素已被用于治疗HBV感染，在某些病人中结果是乐观的[Hoofnagle和Jones，第9届肝病研讨会，231-233(1989)；和Perrillo，第9届肝病研讨会240-248(1989)]。目前美国FDA允许的慢性HBV感染的唯一治疗药物是重组干扰素α-2b(内含子A，先灵-普劳分司)。由于20个病人中有6个出现与药物相关的肝脏障碍，故最近停止了使用核苷类似物fialuridine治疗慢性乙型肝炎的临床试验。因此很需要安全的乙型肝炎的药物治疗。
最新报道表明病毒编码的DNA聚合酶是令人感兴趣的目标，所述DNA聚合酶行使逆转录酶的作用[Doong等，美国国家科学院院刊，88，8495-8499(1991)；Lee等，抗微生物试剂化学33.336-339(1989)；Price等，美国国家科学院院刊86，8541-8544(1989)；和Venkateswaran等，美国国家科学院院刊84，274-278(1987)]。
尚未有针对其他病毒介导过程的抗病毒干涉方法。针对HBV的有效抗病毒疗法可能涉及多种策略，包括影响宿主免疫系统的药剂以及那些影响病毒生命周期之不同步骤的药剂。因此探查病毒生命周期中其他非聚合酶介导的步骤受干涉作用的伤害的可能性是令人感兴趣的。
1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡糖醇(也已知为1-脱氧野尻霉素或DNJ)及其N-烷基衍生物是已知的N-连接寡糖加工酶，α-葡糖苷酶I和II的抑制剂。Saunier等，生物化学杂志257，14155-14161(1982)；Elbein，生化研究年鉴56，497-534(1987)。作为葡糖糖类似物，它们也具有抑制葡糖基转移酶的潜力。Newbrun等，口腔生物学进展28，516-536(1983)；Wang等，四面体通讯34，403-406(1993)。它们抗葡糖苷酶的抑制活性导致了这些化合物作为抗高血糖剂和抗病毒剂的开发。例见PCT国际申请WO87/03903和美国专利4,065,562；4,182,767；4,533,668；4,639,436；4,849,430；4,957,926；5,011,829；和5,030,638。
到目前为止，由于缺乏允许的为检测目的的细胞培养系统，故有关抑制剂对乙型肝炎病毒(HBV)的作用的研究很少。即至今为止，没有繁殖和生产性地用病毒感染组织培养物的能力已成为发现有用抗HBV剂的严重局限。
在一项研究中已报道了N-甲基脱氧野尻霉素可抑制小鼠肝炎病毒(MHV)的形成，因此细胞表面E2的出现得以延迟。见Repp等，生物化学杂志280，15873-15879(1985)；Datema等，临床药理学33，221-286，260(1987)。然而MHV与乙型肝炎病毒(HBV)不相关。在一个方面，HBV是嗜肝DNA病毒家族的成员，它是人体中小的病毒病原体。HBV大小约为42nm，其DNA基因组的大小为3.5Kb。
另一方面，MHV是冠状病毒家族的成员，它是大的含RNA病毒，尽管可导致上呼吸道感染的人冠状病毒病原体是常见的，但MHV不是人的病原体。MHV的大小约为100-150nm(相当多效)，其RNA基因组的大小约为30Kb。HBV和MHV之间几乎无相似性。参照K.Holmes，病毒学，第二版，B.Fields编辑PP.841-856，Raven Press，纽约，纽约州，1990可得到冠状病毒(包括MHV)的其他背景信息和完整的描述。
最近有两个不同的科学团体报道丁型肝炎病毒(HDV)的分泌并不依赖于HBVsAg的糖基化，从中可明显看出不能从一种病毒的结果预测另一种病毒的结果。W.Hui-Lin等，摘要115，和C.Gurean等，摘要117，1994年会议提交的论文摘要，“乙肝病毒的分子生物学”10月3-6日，1994年。巴斯德研究所，巴黎，法国。
HDV并未指定其自身的被膜蛋白，它与HBV感染相同的细胞，并使用HBVS抗原(HBV被膜蛋白)以制成感染性的、成熟的HDV颗粒。区别在于HBV的分泌依赖糖基化作用和聚糖修饰。即尽管HBV和HDV由相同的被膜蛋白组成，但HDV的分泌不依赖于糖基化作用，而HBV对糖基化作用非常敏感。
Pizer等，病毒学杂志34，134-153(1980)；Datema等，文献同上，270页中描述了糖基化作用抑制剂衣霉素对乙型肝炎病毒细胞培养物系统的作用。然而，衣霉素不必要地并完全地阻止了N-连接的寡糖类加入到新近合成的多肽中。即用衣霉素治疗可导致对蛋白质N-连接糖基化作用的完全抑制，对细胞非常有毒。而且，对受HBV感染的细胞进行衣霉素治疗不会导致HBV分泌的显著降低。
本发明的简要描述根据本发明，提供了一种抑制受乙型肝炎病毒(HBV)感染的细胞中所说病毒的方法。此方法包括用有效量的1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡糖醇的N-烷基衍生物治疗所说细胞以抑制HBV病毒颗粒的复制和分泌，其中所说烷基基团含有3至6个碳原子。N-烷基基团优选为丁基。
在本发明较优选的说明实施例中，N-丁基-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡糖醇(NB-DNJ)在经稳定转染的Hep G2.2.15细胞和经HBV感染的HepG2细胞中都表现出可抑制HBV颗粒的分泌并可导致HBV DNA的胞内滞留。
HepG2细胞是熟知的，广泛分布的，很容易得到的人肝癌细胞。美国专利4,393,133中描述了HepG2细胞系的建立和特征。此细胞系的样品也可得自美国典型培养物保藏中心(Rockville，Maryland)，入藏登记号为ATCC HB 8065，还可得自欧洲动物细胞培养物保藏中心(PortonDown UK)。在Broze和Miletich，美国国家科学院院刊84，1886-1890(1987)和美国专利4,996,852；5,106,833和5,212,091中，这些细胞已被用作多种蛋白质的来源，例如，组织因子抑制剂(TFI)，此抑制剂也已知为与脂蛋白相关的凝聚抑制剂(LACI)。
HepG 2.2.15细胞是Hep G2细胞的衍生物，可如Sells等人在美国国家科学院院刊84，1005-1009(1987)中的描述制备。
由于以前报道过用衣霉素治疗产生HBV的细胞会导致正常的HBV颗粒分泌，因此本发明的方法可抑制HBV颗粒的分泌非常出乎意料。见Grippon等，乙肝病毒分子生物学，圣迭哥，加州，摘要67页(1992)。本发明人已发现衣霉素可抑制HBV病毒颗粒而不是亚病毒颗粒的分泌。
经由本发明方法的治疗而导致的胞内HBV DNA的增加也是出乎意料的。
由于每分子HBV被膜蛋白仅含有一个或两个N-连接的聚糖，故DNJ的N-烷基衍生物抑制这种适度(由重量计)糖基化的蛋白质及它们的病毒粒子(毒粒)产物的分泌的能力与它们对含有重度糖基化之被膜蛋白的HIV的分泌的较小作用相比是令人惊奇的。还惊奇地发现含有大的共羧基末端的蛋白质LHB和中等大小MHB的HBV病毒粒子和颗粒比富含小SHB的颗粒对N-丁基DNJ更加敏感。
使用规定的DNJ N-烷基衍生物的另一个优点是它们相对而言无毒性。例如，已知N-丁基衍生物在其可抑制HIV复制的有效浓度(EC50＝43μM)下是无毒的(TD50，5mM)。例见Bryant等，第10届国际艾滋病会议摘要，柏林，6月7-11日，1993年。本文也显示了受HBV感染并经1000μg/ml DNJ的N-丁基衍生物治疗的HepG2.2.15细胞中有90％可与未经处理的对照一样存活。
鉴于本文所阐明的结果，可相信能抑制HBV毒粒转运或糖基化修饰途径之步骤的其他化合物对于在组织培养物和哺乳动物宿主中抑制HBV形态发生也是有用的。
本发明的详细描述由于说明书是以特别指出并清楚要求了认为形成本发明的主题物质的权利要求结束的，故可相信从以下结合附图的说明性的详细描述中能更好地理解本发明。
图1表示HBV被膜蛋白的基因图谱。最上方的线表示HB基因的线性图谱，其上显示出pre S1、preS2和S区域。此图谱下方的数字表示区域的界限，以氨基酸数目表示，不同的HBV株此数目有所不同。右手栏中的百分数值表示对每个HB而言，非、一-、和二-糖基化蛋白质的份额，此值来自Gerlich和Bruss，乙肝病毒的分子生物学，A.Mclachlan编辑，CRC出版，pp.109-144(1992)，和临床实践中的乙肝疫苗，R.W.Ellis编辑，Marcel Dekker公司，pp，41-82(1992)。
图2分两部分，即图2A和2B，它们表示在培养基中和经N-丁基脱氧野尻霉素(NBDNJ)处理的培养物细胞中HBV DNA的放射自显影。在所示浓度的NBDNJ存在下，更换一次培养基，将HepG2.2.15细胞培养6天。6天后(培养的第7天)收集细胞和培养基，经膜与HBV探针杂交检测出的病毒DNA的放射自显影即可显现出来。
图2A从2.2.15细胞培养基中回收的DNA的Southern印迹的放射自显影，所述细胞维持在不含NBDNJ的培养基中(泳道1和2)；以及在含以下NBDNJ浓度的培养基中200μg/ml(泳道3)；500μg/ml(泳道4)；和1000μg/ml(泳道5)。
图2B经EcoRI完全消化的总胞内DNA的Southern印迹放射自显影，所述DNA来自维持于无NBDNJ(泳道1)和有下述NBDNJ浓度存在的培养基中的细胞泳道2200μg/ml；泳道3500μg/ml；泳道41000μg/ml；泳道5经EcoRI消化的，分离自由未经处理的2.2.15细胞制备的毒粒DNA。
泳道6质粒DNA作为杂交对照。箭头表示对松环HBV基因组(A)和线性化3.2Kb基因组(B)而言预期的迁移率。
图3分四部分，即图3A、3B、3C和3D，它们表示经HBV感染并经NBDNJ处理的细胞和HepG2细胞培养基中HBV DNA的凝胶电泳和直方图。
图3A和图3C经聚合酶链式反应(PCR)扩增并经琼脂糖凝胶电泳分辨毒粒的DNA，所述毒粒可与MHB的单克隆抗体免疫沉淀。
泳道1分子量标记物；泳道2空白；泳道3未接受NBDNJ的细胞的培养基；泳道4和5接受200μg/ml NBDNJ的细胞的培养基；
泳道8和9700μg/ml NBDNJ；10和111000μg/ml NBDNJ。
这些带是经光密度法成象的，峰下的面积示于图3C，其中取每个NBDNJ浓度的两个样品的平均值作图。
图3B和图3D经PCR扩增得自在图3A中经HBV感染并经NBDNJ处理的培养物胞内的DNA，泳道中含有得自下列样品的经扩增的DNA泳道1和2无NBDNJ；泳道3和4200μg/ml NBDNJ；泳道5和6500μg/ml NBDNJ；泳道7和8700μg/ml NBDNJ；泳道9和101000μg/ml NBDNJ。
图3D图3B凝胶光密度扫描平均峰下的面积直方图。
图4分六部分，即图4A、4B、4C、4D、4E和4F，它们表示非分级分离培养基和部分纯化的毒粒制品中存在的HBV抗原。使用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测等体积所示样品中的HBV被膜抗原。检测3天培养物中非分级分离培养基(图4A、4B和4C)或部分纯化病毒(图4D、4E和4F)样品的HBVSHB(“S”)(图4A和4D)，LHB“PreS1”(图4B和4E)或MHB“PreS2”(图4C和4F)的抗原表位。培养物保持在所示浓度的NBDNJ中，此浓度用沿X轴所示的毫摩尔单位表示。
为了比较，2.28mM大约相当于500μg/ml NBDNJ。Y轴表示平板读数器读出的任意OD单位的ELISA反应的比色信号。
图5分三部分，即图5A、5B和5C，它们表示经NBDNJ处理的培和未经处理的培养物培养基中的LHB和MHB的Western印迹分析。经SDS-PAGE(13.5％丙烯酰胺)分辨培养基(图5A)或部分纯化的毒粒、得自未经处理(图5B)和经NBDNJ处理(图5C)之培养物的HB纤丝和球体的聚乙二醇(PEG)沉淀物，转移到固定化电解质(immobilin)纸上，并与PreS1和PreS2特异性的单克隆抗体一起保温。
-泳道如图5各部分的顶端所示，纯化自人血清的1.0μg HBV(基因型D)被用作对照。
-图5各部分的右边显示以千道尔顿(Kd)计的分子量标记物(mw)。
-左边的箭头表示LHB(S1)和MHB(S2)多肽。
HBV被膜含有三个共羧基末端的蛋白质(HB)，称作大(LHB)、中等(MHB)和小(SHB)蛋白(见图1)。这些蛋白质是由单个开放阅读框架(ORF)的交替翻译起始得到的[Ganem.Hepadnaviruses，Mason和Seeger编辑(Springer-Verlag)，pp.61-84(1991)]。所有三种HB蛋白都与S区的氨基酸146处的复合型N-连接寡糖类一起出现[见图1和Gerlich和Bruss，乙肝病毒的分子生物学，A.Mclachlan编辑.CRC出版.pp.109-144(1992)，临床实践中的乙肝疫苗，R.W.Ellis编辑.Marcel Dekker公司，pp.41-82(1992)]。
MHB(但LHB从不)也与PreS2区域的杂合型寡糖类一起出现。在HBV自然感染过程中，肝脏产生了大量过量的HB蛋白，它们是以直径为20nM的纤丝或球状亚病毒颗粒的形式分泌的[Ganem.Hepadna-viruses.pp.61-84(1991)；Gerlich和Bruss，乙肝病毒的分子生物学和临床实践中的乙肝疫苗，文献同上]。HB圆球体最充足，它比HB纤丝和HBV颗粒含有少5至10倍的LHB。在所有三种类型的颗粒中，MHB是较少的成分[Gerlich和Bruss，乙肝病毒的分子生物学和临床实践中的乙肝疫苗，文献同上]。
HBV的形态发生是复杂的，据信预装配的病毒核心颗粒吸附到已插入内质网(ER)膜的病毒被膜(表面)蛋白的胞质侧[Gerlich和Bruss，乙肝病毒的分子生物学和临床实践中的乙肝疫苗，文献同上]。
得到被膜后，毒粒芽出ER腔，通过高尔基体将它们从ER腔中转运到胞外液中。不成熟的糖蛋白在N-连接的寡糖类上含有三个末端葡萄糖残基。
据认为末端葡萄糖残基的去除在不成熟的糖蛋白从ER迁移到高尔基体的过程中起到重要作用[Datema和Romero，临床药理学33.22 1-286(1987)]。亚氨基糖NBDNJ是α-葡糖苷酶I的潜在抑制剂，所述酶是可从新生寡糖类去除末端葡萄糖残基的细胞酶，已发现此酶可在体外抑制细胞毒人免疫缺损病毒(HIV)的形成[Karpas等，美国国家科学院院刊85.9229-9233(1988)；美国专利4,849,430；Walker等，美国国家科学院院刊84.8120-8124(1987)]。由于HBV的分泌需要都具有N-连接寡糖类的LHB和SHB，故试验了NBDNJ对病毒合成的作用。
为了进一步举例说明本发明，实行了以下的实施例，但应理解本发明不受这些特定实施例或本文所述细节的限制。
实施例方法细胞和培养基HepG2细胞购自欧洲动物细胞培养物保藏中心(Porton Down.UK)。HepG2 2.15[2.2.15、Sells和Chen，美国国家科学院院刊84.1005-1009(1987)]细胞得自Dr.George Acs(Mt.Sinai医学院，纽约，美国)。
所有组织培养物维持在5％CO2氛、添加有10％热灭活的胎牛血清(Techgen，伦敦，英国)，50单位/ml青霉素和链霉素，1mM谷氨酰胺(GIBCO)的RPMI1640(GIBCO)培养基中。对于2.2.15细胞而言，可如Sells和Chen.美国国家科学院院刊84.1005-1009(1987)中所述，在培养基中加入200μg/ml抗生素G418(Genticin，GIBCO)。
与碘化丙锭一起保温后，使用FACscan细胞计数器(BectonDickinson公司，Sunnyvale，加州，美国)经流式细胞计数测量细胞的生存能力[Platt和Jacob，欧洲生物化学杂志208，187-193(1992)]。
HepG2细胞的感染超速离心后，经过在40和46％蔗糖之间的沉降，从人血清或培养细胞的培养基中纯化HBV[Seifer等，病毒学179.300-311(1990)]。在0.02M的磷酸钾缓冲液，pH7.4中透析毒粒，浓缩，37℃下用V8蛋白酶(得自金黄色葡萄球菌，Sigma化学公司)处理过夜，通过20％蔗糖/0.01M Tris.pH7.4、0.14M Nacl、0.005M EDTA(TNE)垫层离心8小时。将沉淀物重新悬浮于生长培养基中，然后用来接种HepG2细胞。
亚氨基糖化合物NBDNJ的合成是已知技术，它描述于Fleet等，FEBS通讯237，128-132(1988)。NBDNJ由G.D.Searle/孟山都公司以化合物SC-48334提供。
病毒DNA的检测如Sells和Chen，美国国家科学院院刊84，1005-1009(1987)中所述，用聚乙二醇(PEG)8000(Sigma公司)沉淀大约5×106个细胞的培养基，澄清后，重新悬浮于0.5ml磷酸盐缓冲的盐水(PBS)中，用BeckmanT100.3转子，以50,000rpm的转速(约75,000×g)，穿过PBS中的20％蔗糖垫层沉降5小时。
如Sells和Chen，美国国家科学院院刊84，1005-1009(1987)]中所述，从沉淀物中制备DNA。为了进行Southern印迹[Maniatis等，分子克隆实验手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约(1982)]，可经1.2％琼脂糖电泳分辨DNA，转移到H+键(Amersham)滤纸上，并与放射性的32p(Amersham)HBV探针(由试剂盒制造商(Amersham)所述，经使用pHBV为模板的随机引物法制备)杂交[Foster等，美国国家科学院院刊88.2888-2892(1991)]。
通过用PreS2抗原表位的单克隆抗体沉淀培养基可检测经来自血清的HBV感染的HepG2细胞培养基中的子代病毒。使用与病毒基因组相关的核苷酸2815和190(以EcoRI位点为核苷酸1)为引物经聚合酶链式反应(PCR)扩增得自免疫沉淀毒粒的DNA。用标准方法从细胞裂解物中制备DNA[Maniatis等，分子克隆实验手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约(1982)]。
经酶联免疫吸附试验(ELISA)检测HBV蛋白本文所用的单克隆抗体是已知的，Heerman等，病毒学杂志52.396-402(1984)中描述了PreS1的抗体(MA18/7)；Heerman等，Intervirology2814-21(1987)中描述了PreS2的抗体(Q19/10)，也见Gerlich和Bruss.乙肝病毒的分子生物学，A.McLachlan等，CRC出版109-144(1992)和临床实践中的乙肝疫苗，R.W.Ellis编辑，Marcel.Dekker公司，pp.41-82(1992)；Heerman等，肝病病毒和肝病，Zuckermann编辑，A.R.Liss.697-701(1988)中描述了S的抗体(C20-2)。
在微量滴定孔中保温样品，此孔被LHB、MHB或SHB抗原表位的特异性单克隆抗体包被(4℃下过夜)并经PBS中的1％BSA封闭。与病毒样品保温1小时(37℃)之后，用PBS/0.1％吐温20非离子型去污剂将板洗涤4次。
通过与过氧化物酶偶联的山羊抗HB抗体(Behring)一起保温，随后在邻苯二胺(0.33mg/ml PBS-过氧化物溶液)中展开即可检测束缚抗原。在Behring平板读数器上读出光密度，对一系列样品稀释度的纯化病毒和总培养基进行试验以确保适当的定量结果。
Western印迹如Gultekin和Heerman，分析生物化学172，320-329(1989)所述，将样品溶解于负载缓冲液中，通过13.5％SDS聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分辨样品，转移至PVDF(Millipore)膜上并用5％奶粉封闭。在室温下，含1％牛血清白蛋白(BSA)的TNE中，与第一抗体保温过夜，并在室温下，于TNE中，与第二抗体(与过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠IgG血清)保温1小时之后，按制造商的说明中的描述，在过氧化物-二氨基联苯胺(Sigma)，PBS中将膜展开。
结果NBDNJ减少了2.2.15细胞释放剂培养基中的与毒粒相关的HBVDNA的量2.2.15细胞得自HepG2细胞系，它缓慢地将感染性的HBV以及亚病毒颗粒(HB颗粒和球体)分泌到培养基中[Heerman等，病毒学杂志52，396-402(1984)；和Sells等，美国国家科学院院刊84，1005-1009(1987)]。
为了测定NBDNJ对HBV产生和分泌的作用，将2.2.15细胞维持在含有不同浓度NBDNJ的培养基中达6天，在第3天更换一次培养基。在化合物中放6天后，从病毒中分离DNA(在以上“方法”中有述)。如图2A所示，通过与放射性标记的HBV DNA探针进行Southern印迹杂交即可检测出病毒的DNA。
在得自未经处理的培养基的样品中检测到以松环和线形基因组长度的DNA的预期迁移率迁移的病毒特异性的DNA(泳道1和2)[Sells等，病毒学杂志62.2836-2844(1988)]。在得自经NBDNJ处理之细胞培养基的病毒特异性DNA中存在明显的依赖于剂量的增长(泳道3、4和5)。经光密度法量化图2A中所示的放射自显影。光密度法表明500μg/ml(2.28mM)和1000μg/ml的NBDNJ分别导致90和99％的减少。经FAC分析碘化丙锭染色细胞和[35]-S甲硫氨酸掺入蛋白质测定出在1000μg/ml NBDNJ中维持6天的细胞中有90％同未经处理的对照一样有生活力，故减少并非由于NBDNJ的毒性。
经NBDNJ处理的2.2.15细胞含有水平增高的胞内HBV DNANBDNJ介导的在培养基中与毒粒相关的HBV DNA的减少可能是由于病毒DNA合成的减少，或者也可能是由于如毒粒装配，转运或从细胞中泌出的后合成事件造成的。为了区别这些可能性，可比较未经处理和经NBDNJ处理的2.2.15细胞中胞内HBV特异性DNA的量。
从经处理和未经处理的细胞中制备总细胞DNA，并用EcoRI完全消化使病毒基因组线性化。电泳分辨出大致等于微克量的消化产物(经溴化乙锭染色并与细胞特异性探针杂交测定)，进行Southern印迹并与HBV特异性探针杂交(图2B)。在分离自未经处理的2.2.15细胞的DNA中(泳道1)和分离自对照培养基的毒粒中(泳道5)检测到以3.2Kb带迁移的单位长度的HBV基因组。
泳道2、3和4分别含有得自经200、500和1000μg/ml NBDNJ处理之细胞的DNA。与未经处理的细胞相比，经NBDNJ处理的细胞中明显存在依赖于剂量的HBV DNA量的增加。对此放射自显影的光密度测定表明，当调节加样差异时，利用与细胞MHC类III基因G1杂交作为加样对照经200、500和1000μg/ml NBDNJ处理过的细胞分别显示出1.7、3.0、5.1倍的HBV拷贝丰度的增长。
经HBV感染并经NBDNJ处理的HepG2细胞释放较少的子代病毒2.2.15细胞是研究稳定转染环境中HBV产生的有用系统。然而，这些细胞中HBV前基因组的合成可利用整合的病毒DNA模板而不是共价闭合的环状病毒DNA模板，后者在自然感染过程中出现[Sells等，病毒学杂志62，2836-2844(1988)]。另外，这些细胞产生了释放至培养基中的裸露核心颗粒以及多种亚基因组病毒DNA产物[Sells等，文献同上]。
用经蛋白酶修饰的HBV感染HepG2细胞，第二天，用对照培养基或含有不同浓度NBDNJ的培养基取代培养物培养基。感染5天后，用PreS2区核心部分特异性的单克隆抗体免疫沉淀子代毒粒。试验HBV特异性引物经PCR扩增HBV特异性的DNA序列。经琼脂糖凝胶电泳分辨反应产物，经溴化乙锭染色后成像(图3A)。通过光密度分析法量化519个碱基对的产物(箭头，图3A)，图示于图3C中。尽管PCR会低估样品中原始DNA浓度之间的差异，但显而易见经蛋白酶处理过的病毒感染，然后又经700μg/ml(3.2mM)NBDNJ处理之细胞的培养基比未经处理的样品含有低一个数量级的病毒DNA。这些结果表明NBDNJ介导的释放至培养基中的HBV的降低并不是经2.2.15转染之细胞系统所特有的。
经HBV转染并经NBDNJ处理的HepG2细胞含有数量增加的胞内HBV DNA由于经HBV感染并经NBDNJ处理的HepG2细胞的培养基与2.2.15细胞类似，与降低量的毒粒相关DNA有关，故有兴趣弄清楚经处理的细胞内是否伴随有病毒DNA的增长。从对应于图3A和C中所示的样品中制备总细胞DNA，使用PCR扩增胞内HBV特异性的DNA。经琼脂糖凝胶电泳分辨反应产物，经光密度法(图3D)分析溴化乙锭染色的凝胶(图3B)。很显然，经HBV感染，后来又经NBDNJ处理过的HepG2细胞比未经处理的细胞积累了更多量的病毒DNA。
经NBDNJ处理和未经处理的2.2.15细胞培养基含有类似量的HBV被膜抗原2.2.15细胞可分泌毒粒以及亚病毒颗粒[Sells等，病毒学杂志62.2836-2844(1988)]。NBDNJ介导的培养基中毒粒相关DNA的减少可能是所有含HB颗粒分泌普遍减少的反映。或者稀有毒粒颗粒选择性减少，其他形式蛋白(大大过量)相对过剩。
为了区分这些可能性，通过ELISA和Western分析测定培养基中被膜抗原的量和特征。对澄清培养基中存在的SHB、MHB和LHB抗原的ELISA分析示于图4A、B和C。此结果表明培养基中SHB(S)和LHB(PreS1)抗原的总量没有显著的变化。培养基中MHB(PreS2)抗原的总量有适度的，剂量依赖型的降低。在最高NBDNJ浓度(4.5mM或大约1000μg/ml)下大约降低2.5倍。这些结果经Western印迹分析得以证实。图5A表示对照培养物和经1000μg/ml NBDNJ处理的培养基的Western印迹。此处表明经NBDNJ处理过的培养基(图5A、泳道3)和未经处理的培养基(图5A，泳道2)含有相似量的MHB(S2)和LHB(S1)抗原。
因此，NBDNJ不会导致培养基中SHB和LHB抗原量的普遍降低。然而经ELISA测定，经1000μg/ml NBDNJ处理的2.2.15细胞培养基中MHB抗原的量降低了两倍。
经NBDNJ处理的2.2.15细胞培养基含有沉降为完整毒粒的降低量的HBV被膜抗原为测定完整毒粒中存在的HB的量，经超速离心通过蔗糖梯度分级分离培养基。浓缩得自经处理和未经处理培养物并沉降于40-46％蔗糖处的分泌毒粒，通过ELISA检测HB蛋白。结果示于图4D、4E和4F中。在含有毒粒的样品中容易检测到所有形式的HB，所述毒粒是从未经处理的2.2.15细胞培养基中制备的。
另一方面，在由2.25和4.5mM(分别约为500和1000μg/ml，作为比较)NBDNJ处理过的细胞培养基制备的样品中实际上没有可检测到的HB蛋白。这表明在这些样品的培养基中完整病毒的量有所降低。
对含有完整病毒、纤丝或球体的蔗糖梯度级分的Western印迹分析证实了ELISA结果(图5B未经处理的培养物，5C经NBDNJ处理过的培养物)。经SDS凝胶电泳分辨蔗糖梯度的等体积级分，转移到膜上，与LHB(PresS1)特异性的抗体一起保温，成像，再进一步与MHB(PreS2)抗原表位特异性的抗体一起保温。得自人血清的部分纯化的HBV示于泳道5(图5B和5C)以作为对照。
泳道1中分辨了远离含毒粒级分的级分(梯度底部附近)以显示出抗体的特异性。如蔗糖中的沉降及存在(对毒粒而言)和缺乏(对亚病毒颗粒而言)病毒DNA所限定的，泳道2、3和4(图5B和图5C)含有含完整病毒、HB纤丝和球体的级分(分别地)。制备自经NBDNJ处理的培养物的毒粒、纤丝和球体中存在的所有HB蛋白的量都有所降低(比较图5B和5C中的泳道2、3和4)。MHB(PreS2抗原表位)的降低更加严重。用光密度法量化图5B和5C中所示的图像。
光密度法分析表明与未经处理的样品相比，经NBDNJ处理过的毒粒样品中LHB约降低4倍。在相同泳道(图5C，泳道2与图5B，泳道2相比)中MHB降低了12倍。应注意到用于分离不同形式HB蛋白的梯度导致不同形式蛋白的级分“加富”。即，含毒粒的级分可能也含有纤丝和球体。正如免疫学分析的判断，相对于圆球体和纤丝而言，它可能导致低估NBDNJ对毒粒释放的作用。
然而，Western印迹分析的结果与ELISA结果是一致的，即经NBDNJ处理的培养物含有近似量的总HB抗原，但毒粒级分中含大大减少的抗原物质。
可用常规方法将本文所述的抑制性化合物给受HBV感染的病人施用，优选以药用可接受的稀释剂和载体的制剂形式施用。这些化合物可以游离胺的形式或其盐的形式被使用。药用可接受的盐衍生物的例子如HCl盐。
这些抑制性化合物也可以前药的形式被使用，如美国专利5,043,273和5,103,008中所述的6-磷酸化衍生物以及美国专利5,003,072；5,144,037；和5,221,746中所述的0-酰化衍生物。优选的这种衍生物是1，5-(丁基亚氨基)-1，5-二脱氧-D-葡糖醇，四丁酸盐。
所施用活性化合物的量必须是有效量，即在医学上有利的，但不存在超出其使用所带来好处的毒性作用的量。预期成年人每天的剂量的正常范围为大约1至1000毫克活性化合物。尽管可使用非肠道的施用形式，但优选的施用途径是以胶囊、片剂、糖浆、酏剂等形式口服。参考本领域一般的教科书，如雷明顿药理科学，Arthur Osol编辑，第16版，1980，Mack出版公司，Easton.PA.，U.S.A即可制备出治疗剂量的于药用可接受的稀释剂和载体中的合适的活性化合物制剂。
本领域技术人员在不背离本发明精神和范围的情况下，读过本公开文本之后，多种其他实施例对他们而言将是显而易见的。所有这种实施例将包括在所附权利要求书的范围之内。
权利要求
1.在受感染的人宿主中治疗乙型肝炎病毒感染的方法，包括给所说宿主施用有效量的1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡糖醇的N-烷基衍生物以抑制乙型肝炎病毒毒粒的复制和分泌，其中所说烷基基团含有3至6个碳原子。
2.如权利要求1的方法，其中烷基基团是丁基。
3.如权利要求1的方法，其中有效抑制量是约1至1000mg。
全文摘要
本发明公开了治疗乙型肝炎病毒(HBV)感染的方法，包括给受感染的宿主施用1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡糖醇的N-烷基衍生物，其中烷基基团含有3至6个碳原子。
文档编号A61P31/20GK1149253SQ94195049
公开日1997年5月7日 申请日期1994年12月23日 优先权日1994年1月13日
发明者T·M·布罗克, B·S·布卢姆堡, R·A·德韦克 申请人:G·D·瑟尔公司, 孟山都公司