20,溶解加 ddH20 定容至 1000 mL ;
[0047] 封闭液为牛血清白蛋白溶液，配制方法示例：取0.1 g牛血清白蛋白，加入洗涤缓 冲液稀释定容至IOOmL ;
[0048] 终止液为2M H2SO4,配制方法示例：取178. 3mL的ddH20,加浓H2SO4定容至200mL ;
[0049] 底物为甲基联苯胺（TMB)溶液，配制方法示例：取0. 5mL浓度为2g/L的甲基联苯 胺乙醇溶液，加底物稀释液稀释至IOmL ;
[0050] 底物缓冲液pH为5. 0，其中Na2HPO4的摩尔浓度为0. 2M、柠檬酸的摩尔浓度为 0. 1M，配制方法示例：取I. 42gNa2HP04、0. 96g柠檬酸，然后加入CldH2O至50mL，即得；
[0051] 洗脱液的配制方法示例：将木瓜蛋白酶用pH 8. 0, (λ lmol/L Tris-HCI缓冲液配 制成l-2mg/mL，再加入lmmol/L二硫苏糖醇（DTT)37°C孵育30min，得洗脱液；
[0052] 上样缓冲液可由如下比例的组分配制而成=Tris-HCl :1%溴酚蓝：ddH20 :甘氨酸 =15. 5 :2· 5 :7 :25,其中 Tris-HCl 的 pH 为 6. 8、摩尔浓度为 IM ;
[0053] 电泳缓冲液的配制方法如下：取3. Og Tris、14. 4g甘氨酸、溶于800mLddH20中，调 pH至8. 3后，定容至IL ;
[0054] 捕获铬的物质为货号为"广州然科公司RK10641"的鼠抗Cr mAb，以下实施方式中 所述的与铬特异性结合的物质、抗Cr抗体、二抗、抗铬抗体均为捕获得铬的物质；
[0055] 本发明提供一种铬-极低密度脂蛋白螯合物，铬离子与极低密度脂蛋白通过巯基 或/和半胱氨酸残基螯合而成。
[0056] 具体地，铬-极低密度脂蛋白螯合物是由铬通过结合锌指结构、巯基、半胱氨酸残 基中的至少一种结构与极低密度脂蛋白上的载脂蛋白C I、载脂蛋白C II、载脂蛋白C III、 载脂蛋白E或胆固醇、甘油三酯等结合而形成的螯合物。
[0057] 本发明还提供铬-极低密度脂蛋白螯合物的制备方法，包括以下步骤：
[0058] A)铬-极低密度脂蛋白的合成：在提纯源于人体的极低密度脂蛋白或按照生物学 方法重组的极低密度脂蛋白中加入铬离子进行螯合反应，得到反应溶液；
[0059] B)铬-极低密度脂蛋白螯合物纯化：采用免疫亲和层析法，去除步骤A)反应溶液 中未反应的极低密度脂蛋白、特异性抗体和铬离子，即得铬-极低密度脂蛋白螯合物，具体 包括以下步骤：
[0060] 所述步骤B)中具体包括以下步骤：
[0061] (1)溶解样品：将上述步骤A)的铬-极低密度脂蛋白螯合物溶解于生理盐水中， 得铬-极低密度脂蛋白螯合物的溶液；
[0062] (2)平衡层析柱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能与极低 密度脂蛋白特异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0063] 所述能与极低密度脂蛋白特异性结合的填料为吸附有可与极低密度脂蛋白特异 性结合物质的硅胶或树脂；
[0064] (3)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（1)的溶液，然后上柱，使极低 密度脂蛋白与填料特异性结合；
[0065] (4)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 05-0. lOmol/L的 Na2HP0j§液进行洗脱；
[0066] (5)收集：收集步骤⑷的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复原；
[0067] (6)透析：将步骤（5)中的收集的洗脱液，装透析袋，用CldH2O透析除盐，换水三次 后，4°C透析过夜，收集样本；
[0068] (7)平衡层析柱：采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱中装入能 与铬特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0069] 所述能与铬特异性结合的填料为吸附有可与铬特异性结合物质的硅胶或树脂；
[0070] (8)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤(6)中样本，然后上柱；
[0071] (9)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 5-1. Omol/L的 Na2HP0j§液进行洗脱；
[0072] (10)收集：收集步骤（9)的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复原；
[0073] (11)透析：将步骤（10)中的收集的洗脱液，装透析袋，用CldH2O透析除盐，换水三 次后，4°C透析过夜，收集样本，即得铬-极低密度脂蛋白螯合物。
[0074] C):对铬-极低密度脂蛋白螯合物的鉴定，具体包括以下步骤：
[0075] (1)制备胶床：以琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶中的一种作为介质制备胶床；
[0076] (2)加样：取步骤B)中提取纯化得到的铬-极低密度脂蛋白螯合物，加入上样缓 冲液，并混匀，然后加样于样品槽中；
[0077] (3)电泳：连接电泳板，进行电泳；
[0078] (4)检测：在胶床上找出含铬的蛋白条带，将该蛋白条带取出，将蛋白条带溶解， 然后再采用ICP-MS或AAS检测是否含有铬以及检测铬的含量。
[0079] 本发明还提供一种至少包括如上述的铬-极低密度脂蛋白螯合物作为标准品的 试剂盒。
[0080] 在本发明中，能实现本发明目的的试剂盒可以列出以下几种，但并不限于此。
[0081] 一种检测血样中铬-极低密度脂蛋白螯合物的试剂盒，包括：含有可用于捕获极 低密度脂蛋白的物质的包被液、封闭液、洗涤缓冲液、可捕获铬的物质作为二抗、酶标抗体、 底物、终止液、稀释缓冲液、阳性对照、阴性对照等。
[0082] 一种检测血样中铬-极低密度脂蛋白螯合物的试剂盒，包括：含有可用于捕获极 低密度脂蛋白的物质的包被液、封闭液、洗涤缓冲液、洗脱液、阳性对照、阴性对照等。
[0083] 一种检测血样中铬-极低密度脂蛋白螯合物的试剂盒，包括：含有可用于捕获极 低密度脂蛋白的物质的包被液、封闭液、洗涤缓冲液、洗脱液、酸化剂、过氧化氢、标准品、阴 性对照等。
[0084] 一种检测血样中铬-极低密度脂蛋白螯合物的试剂盒，包括提取全血中极低密度 脂蛋白所需提取试剂、复溶液、含有可用于捕获铬的物质的包被液、封闭液、洗涤缓冲液、酶 标抗体、底物、终止液、稀释缓冲液、标准品、阴性对照等。
[0085] 一种检测血样中铬-极低密度脂蛋白螯合物的试剂盒，包括提取全血中极低密度 脂蛋白所需提取试剂、复溶液、阳性对照、阴性对照等。
[0086] 一种检测血样中铬-极低密度脂蛋白螯合物的试剂盒，包括提取全血中极低密度 脂蛋白所需提取试剂、复溶液、酸化剂、过氧化氢、阳性对照、阴性对照等。
[0087] 一种检测血样中铬-极低密度脂蛋白螯合物的试剂盒，包括提取全血中极低密度 脂蛋白所需提取试剂、胶床介质、复溶液、加样缓冲液、溶解胶床上含铬的蛋白条带所需液 体、含有可用于捕获铬的物质的包被液、封闭液、洗涤缓冲液、酶标抗体、底物、终止液、阳性 对照、阴性对照等。
[0088] 一种检测血样中铬-极低密度脂蛋白螯合物的试剂盒，包括提取全血中极低密度 脂蛋白所需提取试剂、胶床介质、复溶液、加样缓冲液、溶解胶床上含铬的蛋白条带所需液 体、阳性对照、阴性对照等。
[0089] 一种检测血样中铬-极低密度脂蛋白螯合物的试剂盒，包括提取全血中极低密度 脂蛋白所需提取试剂、胶床介质、复溶液、加样缓冲液、溶解胶床上含铬的蛋白条带所需液 体、硝酸、过氧化氢、阳性对照、阴性对照等。
[0090] 上述几种试剂盒中，所述阳性对照为标准品，即螯合有重金属铬的极低密度脂蛋 白螯合物或螯合有重金属铬的BSA螯合物；所述阴性对照为稀释缓冲液。
[0091] 上述试剂盒用于检测铬-极低密度脂蛋白螯合物，以提极低检测的准确性和重复 性，并使之在临床中得到推广。
[0092] 本发明还提供一种定量检测铬-极低密度脂蛋白螯合物的方法，以已知含量的上 述的铬-极低密度脂蛋白螯合物作为标准品，采用以下方法之一对样品进行检测：酶联免 疫法、酶联免疫与原子吸收光谱结合法、酶联免疫与电感耦合等离子体质谱结合法、提纯 铬-极低密度脂蛋白螯合物与酶联免疫结合法、提纯铬-极低密度脂蛋白螯合物与原子吸 收光谱结合法、提纯铬-极低密度脂蛋白螯合物与电感耦合等离子体质谱结合法、电泳与 酶联免疫或原子吸收光谱或电感耦合等离子体质谱结合法。在本发明中，用检测铬-极低 密度脂蛋白螯合物的方法可以列出的有以下几种，但并不限于以下几种。
[0093] 方法一：酶联免疫法(ELISA法）检测铬-极低密度脂蛋白螯合物，按照如下步骤 检测：
[0094] 1)包被：用稀释缓冲液稀释可以捕获极低密度脂蛋白的物质至500-4000倍，加入 ELISA板微孔中，4°C过夜16-18小时，或37°C水浴1-3小时，储存冰箱；
[0095] 2)封闭：移去稀释缓冲液，并用洗涤缓冲液进行洗涤，待洗涤完成后，加入封闭 液，37°C放置1小时，移去封闭液，并用洗涤缓冲液进行洗涤，洗涤完成后，ELISA板于37°C 放置1小时；
[0096] 3)加待测样本，并且温育：从循环系统取样，作待测样本；以已知含量的铬-极低 密度脂蛋白螯合物作标准品；用稀释缓冲液稀释待测样本和标准品均稀释至10-40倍，加 入微孔中，37°C作用1-2小时；
[0097] 4)加入可以捕获铬的物质，并且温育：移去待测样本，并用洗涤缓冲液进行洗涤， 待洗涤完成后，加入用稀释缓冲液稀释5000-40000倍的抗铬抗体，37°C作用1-2小时，使抗 铬抗体与极低密度脂蛋白上的金属铬反应；
[0098] 5)酶结合物温育：移去抗铬抗体，洗涤，加入用稀释缓冲液稀释的HRP酶标抗体， 37°C作用1-2小时，使其与HRP酶标抗体反应；
[0099] 6)底物温育：移去酶标抗体，并用洗涤缓冲液进行洗涤，待洗涤完成后，加入底 物，37°C避光作用30分钟；
[0100] 7)终止反应：终止液至每一微孔；
[0101] 8)取波长450nm，加完终止液后，将ELISA板置于酶标仪上分别读取待测样本组和 标准品的OD值，绘制标准曲线，通过与标准品组比较，求得待测样本的含量。
[0102] 本方法中，步骤8)也可不使用酶标仪，直接通过显色情况进行定性检测。
[0103] 该方法利用ELISA原理，极低密度脂蛋白上的铬可以被铬的特异性抗体所捕获， 之后可以再被辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等酶标记的抗体所捕获（该抗体不识别包被蛋 白），捕获上的抗体在显色剂及终止液的作用下，可以在仪器下读出OD值，而不含有螯合