专利名称：视黄醇结合蛋白4作为每窝产仔数的基因标记的制作方法
技术领域：
本发明总的涉及检测动物生殖效率的遗传差异，更具体地说本发明涉及几种基因中已鉴定的、表明与高生殖性能相关的遗传表型的基因标记。本发明还公开了利用这些标记进行动物基因鉴定和选择的方法和组合物。
背景技术：
生殖效率，具体说与每窝产仔数相关的生殖效率，是高效率生产猪肉以及大多数其它家畜产品的主要限制性因素。对几种生殖性能指标的测量显示存在遗传差异。产仔母猪平均每窝产仔数4至16头，平均发育年龄3至7个月，猪品种中的这种遗传性差异提示生殖力的遗传改进是可能的。美国出生的活仔猪数平均为每窝9.5头左右。每窝产仔数目的遗传能力低(10％-15％)，而且根据过去的产仔头数挑选饲养母猪的标准遗传学方法已经不再有效。因此需要一种细胞水平或DNA水平的方法来处理生殖性能的选择问题。
已知中国猪品种达到发育的年龄早，每窝产仔数目多。又知美国猪品种生长速度快，瘦肉多。因此理想的是将这二种猪的优良特性结合起来，从而提高美国猪肉生产的效率。这些努力因发现了与高生殖性能(如每窝仔猪头数增加)相关的基因标记而极大地得到帮助。
几个研究小组已采用RFLP分析研究了猪的DNA。Jung等(Theor.Appl.Genet.77271-274(1989)，纳入本文作参考)公开了采用PFLP技术来显示两品种猪之间的基因差异，证明这两品种中猪白细胞抗原(SLA)I类基因存在多态现象。Hoganson等人(美国动物科学协会中西区年会摘要，1990年3月26～28日，纳入本文参考)报告了中国猪的主要组织相容性复合物(MHC)基因的多态性，并用RFLP分析加以证明。Jung等人(Animal Genetics，2679-91，1989，纳入本文作参考)报道了一些公猪SLAI类基因的RFLP分析结果。这些作者声称他们的研究结果提示猪SLA/MHCI类基因和产量及生殖性能之间可能相关。他们还声称采用SLAI类限制性酶切片段作为基因标记可能在今后改进猪生长性能上具有潜在用途。
另外，授与Rothschild等人的美国专利5,550,024公开了与每窝产仔数更多相关的猪雌激素受体基因的多态性(此专利纳入本文参考)。
与优良生殖性能有关的猪的另一激素是催乳素(PRL)，它是一种垂体前叶肽激素，参与许多不同的内分泌活性，为生殖成功所必需。美国专利申请No.08/812,208描述和公开了采用催乳素受体基因中的多态性基因座作为每窝产仔数增加的标记(在此纳入本文作参考)。
本发明提供的遗传标记是根据RBP4基因多态性的发现，此多态性与提高生殖性能如每窝产仔数和出生活仔数相关。这使得能对猪的生殖基因作基因型分析，并确定具体基因和生殖性能标记的相互关系。还将能鉴定携带优良基因型的个体公猪和母猪。
就母猪而言，这使得能寄望母猪生育的每窝仔猪数目比该品种猪的平均数更多，发育更早，更健康。就公猪而言，可寄望其雌性后代具有此种优良性能。因此，这些标记将成为配种程序的选择工具以开发能生育具有优良生殖表型仔猪的猪。
本发明的一个目的是提供一种确定哪些猪可能生育更多仔猪的筛选方法。
本发明的另一个目的是提供一种鉴定猪生殖性能(如每窝产仔数)的基因标记的方法。
本发明还有一个目的是提供猪的每窝产仔数的基因标记。
本发明还有一个目的是提供一种评价猪DNA样品中与优良生殖性能相关的独特基因标记的试剂盒。
本发明的其它目的和优点将在以下描述中作部分阐述，也可部分地从描述中明白，或可通过本发明的实践而明白。本发明的目的和优点借助所附权利要求书中指出的方法及其组合而达到。
发明概述如本文列举和广泛描述的那样，为了实现和符合发明的目的，本发明提供一种筛选猪和其他动物的方法，以确定饲养那些可能具有优良生殖表型(如每窝产仔更多)的动物，或选择排除具有显示不良表型等位基因的猪。本文所用的“每窝产仔更多”表示每窝产仔数在群体平均值之上。
本文所用术语“生殖性能”包括能表明生殖效率提高的任何性能，包括但不限于睾丸大小、精液体积、精子浓度、精子质量、性欲、繁殖、每窝产仔数目、出生活仔数、仔猪出生时体重、断奶年龄、发育年龄、断奶到发育间隔时间、产仔间隔时间、排卵率、子宫容量和胚胎存活率。
本文所用术语“生殖基因”意指其编码的基因产物表达后能影响优良或不良生殖性能的任何基因。这类基因的例子包括但不限于雌激素受体基因、催乳素受体基因和视黄醇结合蛋白4基因，以及本文公开和描述的其它基因。
因此，本发明提供一种筛选方法，确定哪些猪更可能产生优良生殖性能(如每窝产仔数目更多)和/或哪些猪不大可能每窝生育较少仔猪。该方法包括以下步骤1)获得猪或其他动物的基因组DNA样品；2)分析步骤1获得的基因组DNA，以确定存在视黄醇结合蛋白4的那一个或那几个等位基因。简言之，获得并分析基因材料的样品，以确定存在还是缺乏与所需生殖性能相关的基因的多态性。
在一个优选实施方案中，该多态性是限制性酶切片段长度的多态性。该试验包括鉴定分离的基因材料中的生殖基因；使该基因接触限制性内切酶产生该基因长度不同的限制性酶切片段；用电泳或HPLC等方法分离这些片段形成的限制性酶切模式图；比较动物生殖基因产生的限制性酶切片段模式图是否具有或不具有已知的所需标记。如果动物测试该标记阳性，可考虑将该动物包括在育种繁殖程序中。如果该动物测试此基因型标记不是阳性可将该动物从所用的群体中剔除，否则则使用。
在一个最优选实施方案中，用引物和DNA聚合酶扩增基因中含有多态性的特定区域，分离其基因片段，接着直接分离或测序所扩增的区域或用限制性内切酶消化并分离所产生的片段。通过这些片段的简单染色或在扩增中使用标记的引物或三磷酸核苷来显现分离的片段或RFLP模式。
在另一实施方案中，本发明包括一种鉴定生殖性能(如某特定种群中的每窝产仔数)的基因标记的方法。饲养同一品种或杂交品种或相似的遗传品系的雄性和雌性动物，并测定每只雌性动物产生的后代数目。鉴定每只动物生殖基因的多态性，并将其与所需生殖性能相关联。优选采用PCR-RFLP分析来测定多态性。
也可以建立其它DNA标记的独特等位基因和已知与某特定基因(先前已证明与某特定性状相关，如本文所讨论的生殖基因)相关的DNA标记物的等位基因之间的连锁关系。在这种情况下，取得特定的生殖基因应是可能的，至少在短时间内，可选出每窝能生育更多幼仔的猪或其它动物，或者通过选择具有其它染色体标记的独特等位基因间接地选出具有与某特定生殖基因相关的标记的等位基因，来剔除每窝可能生育较少幼仔的猪。例如，已知与猪染色体14上视黄醇结合蛋白4基因连锁的标记，包括S0007，S0116和SW210，它们都是微卫星DNA。
本发明还包括一种试剂盒，用于检测DNA样品中是否存在位于生殖基因中表明可遗传性生殖性能(如每窝产仔数更多)的所需遗传标记。最低限度，该试剂盒是一个容器，装有一种或多种鉴定RBP4基因多态性的试剂，较佳的是，该试剂是一套寡核苷酸引物，它能扩增所选定的含多态性的生殖基因的片段。较佳的是，该试剂盒还含有一种限制性内切酶，它能在至少一个位置切割该生殖基因，从而得以分离这些片段和检测多态性基因座。
加入本文的附图构成了本说明书的一部分，用于阐述本发明的实例，并且和说明书一起用于解释本发明的原理。
图1为采用实施例5的第二种PCR方案和引物所产生的预期片段模式图。
图2为已发表的人视黄醇结合蛋白4的序列与新的猪视黄醇结合蛋白4序列的比较图。
发明详述详细参考本发明提供的优选实施方案，这些优选实施方案和以下实施例一起说明本发明的原理。
本发明涉及猪和其他动物优良生殖性能(如每窝产仔数)的基因标记。提供一种筛选动物的方法，通过鉴定与某些生殖性能相关的生殖基因(即RBP4基因)中存在或缺乏某多态性，来确定饲养中的动物那些可能较早生育，更健康，每窝产仔更多。
因此，本发明涉及到具体种类、品系、种群、族的猪或其他动物中的基因标记和鉴定这些标记的方法。凭借此基因标记，可确定上述具体种类、品系、种群、族的猪中，可能每窝生育数目明显更多、更健康、更早熟仔猪的母猪。鉴定该标记存在与否的方法均可使用，包括例如，单链构象多态性(SSCP)分析，RFLP分析，异源双链分析，变性梯度凝胶电泳和温度梯度电泳，连接酶链反应，或甚至直接测定生殖基因的序列和检查某种识别模式。
其他可能采用的技术包括非凝胶系统，如TaqManTM(Perkin Elmer)。在该系统中，设计了侧接该突变的PCR寡核苷酸引物，并进行该区域的PCR扩增。然后设计第三个寡核苷酸探针与含有该基因不同等位基因之间易变化碱基的区域杂交。用二种荧光染料在5’和3’两端标记此探针。所选的二种荧光染料应是互相靠近时，一端的荧光被另一端的荧光所淬灭而不能检测到。当TagDNA聚合酶从位于模板5’端的PCR引物开始相对于探针进行延伸时，该酶的5’核酸酶活性导致切断结合于退火探针5’端的荧光染料，这样消除了淬灭作用，从而能检测到探针3’端染料发出的荧光。
如果探针与模板分子的杂交不完全，即有某种形式的错配，就不会发生染料被切下，这样就可区分不同的DNA序列。因此，只有当寡核苷酸探针的核苷酸序列与其所结合的模板分子完全互补，淬灭作用才会消除。反应混合物可含有两种不同的探针序列，各针对可能存在的不同等位基因，因而能在一个反应中检测这两种等位基因。
应用RLFP是检测多态性的优选方法，最优选的是PCR-RFLP分析。然而，由于RFLP分析的应用最终依赖于核酸分子的多态性和DNA限制性位点，也可采用检测多态性的其他方法。这些方法包括分析多态性基因产物和通过检测该基因产物中产生的差异来检测多态性。
RFLP是本领域技术人员所熟知的一种通用技术。例如，见如下美国专利1986年4月15日授予Erlich的No.4,582,788和1987年5月19日授予Gusella的No.4,666,828，1988年9月20日授予Frossard的No.4,772,549和1989年8月29日授予Frossard的No.4,861,708(其公开内容纳入本文作参考)。概括地说，该技术包括获得待研究的DNA，用限制性核酸内切酶消化该DNA，分离产生的片段和检测各种基因的片段。
本发明中，基因材料的样品获自动物。可从血液、组织、精子等获得样品。通常采用外周血细胞作来源，基因材料是DNA。获得足够量的细胞以提供足够量的DNA进行分析。如本文材料中所解释的那样，本领域技术人员知道或不难确定所需量。用本领域技术人员已知的技术从血细胞中分离出DNA。
下一步，用引物和标准技术(如聚合酶链反应)扩增含多态性的区域。这种技术在以下美国专利中有描述1987年7月28日授予Mullis等人的Nos.4,683,195和4,583,202，1989年1月24日授予Mullis等人的No.4,800,159，1989年12月26日授予Gelfaud等人的No.4,889,818和1990年2月20日授予Clumbus等人的No.4,902,624。(以上专利均纳入本文作参考)。在这些提到并纳入本文作参考的文献中讨论了引物的选择。这些引物应能扩增含多态性的区域。本文将公开扩增特定多态性区域的几种引物。本领域技术人员能结合本文所述技术设计其他的引物，这些应包括在本发明中。
然后分析分离的DNA，并可任选地用限制性核酸内切酶消化，该酶能在称为限制性位点的特定核苷酸序列处切割或切断DNA。这种核酸内切酶也称为限制性酶，是本领域技术人员熟知的。就本发明而言，应选择能在所选定的生殖基因的至少一处切割的限制性酶，产生该基因的至少二个片段。用本领域所知的技术结合本文的方法，测定这些片段是否是多态性的和其多态性是否与所需要的生殖性能(如每窝产仔数)相关联。加入到含猪DNA样品中的这种酶的量，以及处理样品的其他适合条件，本领域技术人员根据本文的教导是不难确定的。
然后，用已知技术分析限制性片段。这些技术通常包括对片段进行分离，染色或再作印迹和杂交进行显示，以获得特定的模式图，或测定片段的不同大小。后者将得以鉴定每窝产仔数增加的一个或多个片段(标记)。优选的分离技术是凝胶电泳。
该技术中，在施加的电场影响下使支撑介质中的消化片段按大小分开。通常采用凝胶片或板(如琼脂糖或琼脂糖一丙烯胺)作为支撑介质，将含有限制性片段的样品加到凝胶的一端。在同一块凝胶上跑电泳的有一种或多种大小不同的标记物作为对照，以便估计限制性片段的大小。该方法通常可分辨大小彼此相差少至100个碱基对的分离片段。
在另一实施方案中，使片段变性，通过物理方法将其从凝胶转移到一固相载体(优选尼龙膜)上。方法是在能促进DNA转移的适当条件下和存在适当的试剂时，使凝胶与膜接触。这些试剂和条件是本领域技术人员熟知的。如此，就保持了该分离方法产生的各DNA片段的相对位置。
下一步包括检测大小范围不同的片段，或检测特定大小的某片段。后者可能特别有意义，因为该片段与所需生殖性能相关联的一种基因标记。优选用溴化乙锭等将片段染色，然后进行检测。
另一技术是采用杂交探针。这种探针是一种寡核苷酸或多核苷酸，其与待杂交的片段充分互补或同源，形成探针—片段复合物。探针优选cDNA探针。寡核苷酸或多核苷酸用可检测分子标记，从而得以检测与该探针杂交的限制性片段。可用标准的标记方法，如用放射性标记、酶标记、荧光标记、生物素—亲和素标记等标记探针。见美国专利1987年12月8日授予Ward等人的No.4,711,955和1989年9月19日授予Stavrianopoulos等人的No.4,868,103(两个专利均纳入本文作参考)。
在适合探针与片段杂交的杂交条件下，使探针与含有限制性片段的尼龙膜接触足够长时间。洗涤尼龙膜除去未结合的探针和其他不要的物质。
然后用已知技术检测与尼龙膜结合的探针—片段复合物。例如，如果探针用放射性标记(32P)，检测包括使尼龙膜与一放射敏感性胶片接触。经适当时间曝光后，显示出感兴趣的片段和对照片段。
此检测步骤提供了一张片段按大小分离而产生的模式图。将这些片段与在同一凝胶上跑电泳的已知大小的对照片段相比较，就能估计出各组片段的大小。然后通过对来自不同猪的DNA的类似分析，比较产生的模式图，确定生殖基因中的各种多态性。对于某些个体动物，其模式图将不同于大多数其他动物所产生的常规模式图。这是由于一种或多种限制性片段的长度多态性所致，即由于核酸内切酶切割生殖基因产生长度不同的限制性片段所致。这反映了这种猪中具有不同的碱基对序列。
一旦鉴定到特定的RFLP，即特定长度的限制性片段，可用已知方法构建该片段的探针。这得以用另一些较快的方式来检测这种多态性。例如，消化的DNA可用夹心杂交法检测。该方法如以下美国专利所公开的1984年12月4日授予RanKi等人的No.4,486,539和1986年1月7日授予RanKi等人的No.4,563,419。(两个专利均纳入本文作参考)。使样品与固定在固相载体上的捕俘探针接触，探针与该片段结合，洗涤载体，加入标记的检测探针。再次洗涤后，测定检测探针，从而证明所需片段的存在。
另一实施方案中，一旦确定了RFLP模式或特定的多态片段，将其与第二种已知的与每窝产仔数增加相关联的RFLP模式图或片段相比较。也可在同样条件下采用与第一次相同的限制性核酸内切酶和相同的探针或其等价物，确定生殖基因所产生的第二种模式或片段。
在本发明另一实施方案中，可通过溶液杂交来检测限制性片段。此方法中，片段先与探针杂交，再分离，然后如上所述检测探针—片段复合物。通常在凝胶上而不用转移到滤纸上检测这种复合物。
在一最佳实施方案中，用PCR扩增而不用任何探针检测此多态性，本领域技术人员知道此方法，并可参见美国专利No.4,795,699，题为“DNA聚合酶”和美国专利No.4,965,188，题为“用一种耐热酶扩增、检测和/或克隆核酸序列的方法”(两个专利内容均纳入本文作参考)。
该方法需构建能扩增多态性所在区域的引物。故应根据此多态性周围的序列来设计4-30个碱基的引物，包括该多态性区域5’的正向引物和3’的反义(反向)引物。这些引物无须精确互补，基本相同的序列也可接受。然后在存在4种三磷酸核苷并常有缓冲试剂时加入DNA聚合酶，如Taq聚合酶(很多这样的聚合酶是已知的并非有市售品)。用诸如溴化乙锭简单染色分离产物将有利于检测，以测定是否存在所扩增区域长度预计的大小的片段。反应时间、试剂和引物设计都是本领域技术人员知道的，在本文引用的参考文献中有描述。PCR扩增可与单链构象多态性(SSCP)联合应用。见Orita等人“用凝胶电泳检测人DNA的多态性单链构象多态性”，PNAS86(8)Apr.1989(2766-70)和Lessa等人“检测DNA序列中等位基因变化的筛选技术”Mol Ecol2(2)119-29Apr.1993。(二文内容均纳入本文作参考)。
虽然本文所描述的方法采用了一种限制性酶和一套引物，但该方法不限于此。如果需要，可采用一种或多种其他限制性酶和/或探针和/或引物。可通过常规实验，结合本文提供的技术，确定其他的酶、构建探针和引物。
与生殖基因，特别是RBP4基因或其他基因连锁的基因标记可如下测定。使同一品种、杂交品种或遗传品系相似的雄性和雌性动物交配，测定具有优良生殖性能的后代数目，测定每只雌性动物生育的每窝后代数目。如上所述进行亲代DNA的RFLP分析，以确定每只动物所选定生殖基因中的多态性。将此多态性与生殖性能相关联。进行这种确定时至少采用20只，较佳为至少40只雌性动物。每只雌性动物至少生育过一胎。较佳孕育和产仔周期至少重复二次，最佳3次。
当进行这种分析以及用RFLP或其他分析来确定多态性时，可用类似的人或其他密切相关动物的已知序列来设计扩增引物。许多生殖基因序列具有同源性。也可用基因库(Genbank)例举的已知基因序列设计引物，或甚至从密切围绕这些基因的连锁资料获得的序列来设计引物。本发明已选出若干套引物来鉴定生殖基因中的多态性区域。已显示这些多态性片段是等位基因片段。每一片段显示与各种品种的优良生殖性能(如每窝产仔数增加)相关联。与该性能相关联的基因型在其他不同品种常常不同。该结果类似于美国专利No.5,374,523“牛促生长素基因的等位基因变化，超级产奶牛的基因标记”中所述情况。该专利发明者发现一种等位基因多态性是促生长素基因，一种等位基因形式对Jersey母牛是有益的，而另一种形式对Holstein母牛是有益的。
可将实施本发明方法的合适试剂包装在常规试剂盒中。试剂盒提供包装在适当容器中的必须材料。试剂盒至少含有能鉴定所选定的、与某生殖性能(如每窝产仔数增加)相关联的生殖基因多态性的试剂。该试剂较佳为成套PCR试剂(一套引物、DNA聚合酶和4种三磷酸核苷)，可与生殖基因或其片段杂交。试剂盒宜包括PCR系列和在至少一个位点切割生殖基因限制性内切酶。试剂盒还宜包括其他物质，如检测或测定可检测分子或对照品的试剂。若需要，还可包括用于杂交、预杂交、DNA提取、显示等的其他试剂。
本发明的材料和方法可更通用地用于评价动物DNA，测定个体动物的基因型和检测动物中的基因差别。具体说，可参照一个或多个对照物来评价一基因组DNA样品以确定是否存在生殖基因的多态性。对生殖基因宜进行RFLP分析并将结果与对照相比较。对照是生殖基因多态性已知的不同动物的生殖基因RFLP分析的结果。类似地，通过获得动物的基因组DNA，进行该DNA中生殖基因的RFLP分析，将结果与对照相比较，可确定该动物的生殖基因型。还有，对照是不同动物生殖基因RFLP分析的结果。此结果通过确定猪的选定生殖基因的多态性而确定此猪的基因型。最终，通过获得至少两只动物基因组DNA样品，鉴定生殖基因多态性的存在与否，并比较结果，可检出动物之间的遗传差异。
如上所述，这些试验可用于鉴定与每窝产仔数相关的基因标记，鉴定可能与其他特性相关的生殖基因的其他多态性，以及对基因型及表型作总体科学分析。
本发明的基因标记、方法和试剂盒也可用于提高动物品种、品系和种群的每窝产仔数的繁殖计划中。对于与优良生殖性能(如每窝产仔数增加)相关多态性，不断挑选和繁殖至少杂合的动物(较佳是纯合的动物)，将产生母畜每窝产仔数更多的品种、品系和种群。这样，这些标记就成了选择工具。
本文的实施例和方法公开了经鉴定具有多态性的某种生殖基因，该多态性正面或负面地与影响动物生殖效率的某优良生殖性能(每窝产仔数)相关联。鉴定出的一基因(RBP4)中多态性，常常是导致某等位基因中产生限制性位点的单一碱基变化。然而，如本文证明和讨论的那样，某一等位基因可以有许多与其相关联的碱基改变。可测试那些碱基表明了相同的多态性，还可将其他基因标记或基因与本文所述的多态性相连接，这样试验可包括鉴定其他基因或基因片段，但试验最终有赖于相同多态性动物的遗传特征。任何根据等位基因差异选择和鉴定动物的试验都包括在本发明的范围内。一旦鉴定到多态性并证明与某特定性能相关，本领域每一技术人员将会理解有无数方法来确定动物的该多态性基因型。如本文充分描述的那样。这些改变的试验的设计只是优化本领域技术人员已知的参数，应包括在本发明的范围中。
本发明已鉴定了与每窝产仔数增加相关联的RBP4基因中的多态性。胚泡在延伸过程中表达了视黄醇结合蛋白4(RBP4)，推测其转运和调节了胚胎所接受的视黄醇量。本发明鉴定了一种多态性并对RBP4绘制了基因图。SacI消化产物与RBP4杂交显示了一条带有二个等位基因的多态性(片段)，其连锁分析发现与猪染色体14上的几个基因座明显连锁。进一步的精细研究包括用引物作二次PCR试验来测定MSPI的多态性，试验显示纯合基因型之间的差异为每窝产仔1.05头猪。
应理解，按照本文所述内容将本发明的教导实施于具体问题或环境，是本领域普通技术人员能力范围内的事。在下列实施例中所显示的本发明产品和方法实例并非意味着对本发明的范围和内容进行限制。
实施例1视黄醇结合蛋白4(RBP4)基因与猪染色体14的连锁示位置染色体(Chr)14远端部分的基因座顺序-ACTN2-1.7-ACTA1-2.7-PLAU-0-SW210-8.2-S0169-9.9-S0072-11.1-S0007-7.3-RBP4-16.2-S0116-20.0-Sw761-36.1-S0015。
制图方法六个Meishanx大白猪和欧洲野公猪x大白猪的三代PiGMaP家族，Archibald等，1995.Mamm.Genome6157-175分子试剂猪RBP4基因探针采用根据猪cDNA序列设计的引物扩增12日猪胚泡的311-bp片段获得。5’引物(5’-TTCCGAGTCAAAGAGAACTTCG-3’，SEQ ID NO1)代表核苷酸79-100。3’引物(5’-TCATAGTCCGTGTCGATGATCC-3’SEQ IDNO2)代表核苷酸368-389。TroutW等人，1991，Mol.Endocrinol.51533-1540。纯化扩增产物，用随机引物法以32P放射标记。、等位基因检测通过与标记的011bp猪RBP4片段作Southern印迹杂交检测了猪基因组DNA中的SacI多态性。最终洗涤的严谨度定为65℃，0.7xSSC和0.2％SDS。在所检测的12.1kb和7.8kb的两个多态性片段中发现了孟德尔式遗传(规律)。测定了8个品种62头无亲缘关系猪的RBP4基因型。12.1kb段Landrace猪(n＝10)的频率是0.55，在Duroc猪(n＝10)是0.75。Yorkshire猪(n＝5)是1.0，Chester白猪(n＝4)为0.5，大白猪(n＝11)为0.59，Hampshire猪(n＝5)为1.0，Meishan猪(n＝15)为0.80，野公猪(n＝2)为1.0。
先前鉴定的同源性人RBP4定位于10q23-24(Rocchi.M等人1989，Somat.Cell Mol.Genet.，15185-190)和小鼠Rbp-4位于染色体19的远端(Chainani，M.等人，Genomics.1991，9376-379)。
讨论视黄醇结合蛋白是猪孕体植入前的一种主要分泌产物。在猪胚泡延伸的迅速形态学发育期间(这是胚胎存活的关键时期)RBP4产生增加，提示RBP4可能是猪生殖数量性状遗传位点(QTL)研究的一种令人感兴趣的候选基因。
用CRIMAP2.4版软件包进行了连锁分析。两点连锁分析得到了RBP4与猪染色体14上基因座S0007，S0116和SW210的显著性Lod评分(＞3.0)(表1)。我们图谱上该基因座的顺序与KapKe及其同事的染色体14上PiGMaP图的新基因座排列相一致(KapKe.P等人1995.Anim Genet.，待发表)，例外是基因座S0007和S0072的重排。将RBP4加到重新修定的PiGMaP图中进一步增加了该性别平衡图的长度，从193cM到202cM。置换染色体14上的RBP4加强了猪染色体14和人染色体10之间的同源性。(Johansson等人1995，Genomics，25682-690)。
表1RBP4两点连锁分析的结果
实施例2多态性与每窝产仔数的相关性在含有消化的家族DNA参照品的Southern膜上，用RBP4基因的部分cDNA片段进行了RFLP测定。用RBP4探测了SacI膜，显示12.1kb和7.8kb两条等位基因片段。连锁分析染色体14的RBP4图。为了说明该基因的作用，测定了两种Fronch大白猪这些基因座的基因型。前一品系由法国高产育(LMH)猪(32头母猪生育216只仔猪记录)组成，后一品系由法国对照(LW)猪(27头母猪生育242只仔猪记录)组成。以每窝产仔数的线性回归评估了该基因对基因型的平均添加效应。RBP4对7.8kb等位基因的添加基因效应在LMH猪中为0.52±0.30，在LW猪中为0.45±0.43。等位基因对每窝产仔数的替代效应范围是表型STD的5～17％实施例3(RBP4)MSDI多态性的PCR-RFLP试验根据RBP4基因中多态性的鉴定，开发了一种PCR试验引物LM24195’-GAGCAAGATGGAATGGGTT-3’SEQ ID NO4LM24205’-CTCGGTGTCTGTAAAGGTG-3’SEQ ID NO5
PCR条件 25μL反应物1号混合液10XPromega缓冲液 2.5μL25mM MgCl21.5μL10mM dNTP’s 0.5μL16pMol LM2419(100ng/μL) 0.5μL16pMol LM2420(100ng/μL) 0.5μL双蒸无菌水12.5μL25ng基因组DNA(12.5ng/μL) 2.0μLTaq混合液双蒸无菌水4.9μL0.6U Taq聚合酶(Promega) 0.12μL在反应管中混合18μl 1号混合液和DNA。上面叠加矿物油。在加热循环仪上85℃预热。加入5μl Tag混合液，运行以下PCR程序步骤193℃ 3分步骤293℃ 30秒步骤356℃ 45秒步骤472℃ 45秒步骤5回到步骤2，39轮以上步骤672℃ 5分步骤74℃ 保持在标准的1％琼脂糖凝胶上核查5μl PCR反应物，以证实扩增成功以及清晰的阴性对照。产物大小约550碱基对，可直接在PCR管中进行消化。
MSPI消化反应30μL反应物剩余PCR产物 20.0μL10X NE缓冲液2 3.0μL10U MSPI酶(20U/μL) 0.1μL双蒸无菌水 6.9μL制备缓冲液、酶和水的混合物，取10μl加入含有DNA的各反应管中。37℃温育过夜。将加样染液直接加入消化反应物中，将整个体积加样在3％NuSieve凝胶上。AA基因型主条带为190bp、154bp和136bp。BB基因型条带为154bp、136bp和125bp。
分析法国猪品系显示，该新的PCR试验的MSPI等位基因A＝(旧)SacI等位基因2。
采用PCR-RFLP检测Nebraska大学的高产猪品系和对照品系，结果如下A B指数.50.50对照.47.53因此，在该指数中A的频率较高。
用MSPI试验分析了PIC品系的19只动物(具有合适记录)结果见表7和表8。
表2
表3
数据按每窝产仔数分组显示如下
实施例4开发了第二种RCR试验，如下所示。PIC RBP4试验方案RBP4-FOR2 5’ACT GTG CTC TTT GTG CTG 3’SEQ ID NO6RBP4-REV 5’CTC GGT GTC TGT AAA GGT G 3’SEQ ID NO7方法10x PCT缓冲液1.2μl2Mm dNTP’s 1.2μl25mM Mg2+1.2μlRBP4-FOR2(5μM) 1.2μlRBP4-REV(5μM) 1.2μlAmplitag Gold0.12μlQH2O4.88μl切割物 1.0μl12.0μlPE970094℃ 30秒}94℃12分58℃ 30秒}x30→72℃ 4分→6℃72℃ 30秒}(9600Ramp)消化 37℃ 3小时PCR产物 12.01MSP1(10μ/l) 0.5μlQH2O1.0μl14.0μl加样后，在5％NuMe琼脂糖上于150V电泳约45分到1小时。图1显示预计的条带大小。
实施例5欧洲结果对欧洲PIC繁殖场有每窝产仔数记录的264头Landrace母猪，用实施例4方案测定了RBP4基因型。鉴定到两个等位基因1和2。所有品系中标记的基因型分布遵循Hardy Weinerg平衡原理。
分析了两种性能----生育总仔数(TNB)和生育活仔数(NBA)采用与公畜的混合模式作为随机效应分析了数据(h2＝0.09)固定的效应包括下小猪的年、月，母猪品系，公猪品系，种猪场(3A1种猪)周期1，2，3+。公猪与母猪配种(1，2，3+)。所有配种都是A1公猪与母猪配种。
所有经产数与母猪品系之间的RBP4影响
超过7509窝仔猪的RBP4结果提示，纯合子基因型之间的差异为每窝产仔数1.05头猪。
实施例6对美国繁殖场有每窝产仔数记录的154头Dam品系母猪(由Landrace和大白猪/Duroc综合品系组成)进行了RBP4基因型测定。
上面引用的所有参考文献现特地全部列于以下，供参考。
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权利要求
1.一种筛选动物以确定哪些动物更可能每窝产仔数增加的方法，其特征在于，该方法包括获得动物的遗传材料的样品；和测定所述样品中视黄醇结合蛋白4基因中多态性的存在，所述多态性与每窝产仔数增加相关联。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述动物是猪。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述测定步骤选自直接测序分析，限制性片段长度多态性(RFLD)分析，异源双链体分析，单链构象多态性(SSCP)分析，变性梯度凝胶电泳(DGGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE)。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，测定所述多态性存在的测定步骤包括用在至少一处位置切断所述视黄醇结合蛋白4基因的限制性酶消化所述遗传材料；分离消化所产生的片段；测定所述片段产生的限制性模式图；将此模式图与用所述限制性酶得到的生殖基因的另一限制性模式图作比较，其中所述另一模式图与每窝产仔数增加相关联。
5.根据权利要求3所述的方法，其中，所述分离是凝胶电泳。
6.根据权利要求3所述的方法，其中，比较所述限制性模式图的步骤包括鉴定特定大小的片段和比较所述片段的大小。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，测定所述片段不同大小的步骤包括在存在已知大小的对照DNA片段时，用凝胶电泳按大小分离所述片段；使所述分离的片段与一探针接触，该探针能与所述片段杂交形成探针—片段复合物；通过检测探针—片段复合物的存在与否来确定所分离的片段的大小；确定它们与所述对照DNA片段的相对位置。
8.根据权利要求4所述的方法，其中，该方法还包括在所述消化步骤之前扩增一定量的含所述多态性的生殖基因或其片段。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，用Taq聚合酶进行所述扩增。
10.根据权利要求8所述的方法，其中，所述扩增包括选择正向和反向引物序列的步骤，这些引物能扩增含有多态性位点的所述生殖基因区域。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述基因是视黄醇结合蛋白4基因，所述正向和反向引物选自或基于图1所示的序列。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述引物是TTCCGAGTCAAAGAGAACTTCG和TCATAGTCCGTGTCGATGATCC。
13.根据权利要求11所述的方法，其中，所述引物是GAGCAAGATGGAATGGGTT和CTCGGTGTCTGTAAAGGTG。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述限制性酶是MSPI。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述多态性是190bp限制性长度多态性。
16.根据权利要求14所述的方法，其中，所述多态性是125bp限制性长度多态性。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述引物是ACTGTGCTCTTTGTGCTG和CTCGGTGTCTGTAAAGGTG。
18.一种测定猪视黄醇结合蛋白4基因中与每窝产仔数增加相关联的多态性位点存在与否的引物，其中，所述引物含有选自或基于图1所示序列的至少4个碱基。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述引物选自TTCCGAGTCAAAGAGAACTTCG和TCATAGTCCGTGTCGATGATCC，GAGCAAGATGGAATGGGTT，CTCGGTGTCTGTAAAGGTG，ACTGTGCTCTTTGTGCTG和CTCGGTGTCTGTAAAGGTG。
20.一种与每窝产仔数增加相关联的基因标记，其中，所述标记包括视黄醇结合蛋白4基因。
21.根据权利要求20所述的标记，其中，所述标记可通过用引物ACTGTGCTCTTTGTGCTG和CTCGGTGTCTGTAAAGGTG扩增出的所述基因区域中的MSPI多态性来鉴定。
22.根据权利要求20所述的标记，其中，所述标记可通过用引物GAGCAAGATGGAATGGGTT和CTCGGTGTCTGTAAAGGTG扩增出的所述基因区域中的MSPI多态性来鉴定。
23.纯化和分离的猪视黄醇结合蛋白4基因的序列，其中，所述序列由图1所示序列组成。
24.一种筛选猪的方法，用以确定哪些猪更可能每窝生育更多猪仔和/或哪些猪不大可能每窝生育较少猪仔，其特征在于，该方法包括如下步骤测定动物中存在的视黄醇结合蛋白4基因的等位基因；测定已知能影响每窝产仔数的基因中其它标记的等位基因；挑选具有等位基因优良组合的动物和剔除携带不良组合的那些动物。
25.根据权利要求24所述的方法，其中，生殖基因等位基因的测定包括测定是否存在直接或间接与所述视黄醇结合蛋白4基因相连锁的至少一种DNA标记相关联的至少一种等位基因。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，DNA标记是微卫星标记。
27.一种筛选动物以确定那些动物更可能每窝具有更多幼仔的方法，其特征在于该方法包括获得所述动物的遗传材料样品，测定视黄醇结合蛋白4基因中多态性的存在，所述多态性是可用引物ACTGTGCTCTTTGTGCTG和CTCGGTGTCTGTAAAGGTG扩增的区域中是否存在MSPI多态性来鉴定的多态性。
28.一种筛选动物以鉴定与特定生殖基因相连锁的多态性标记的方法，该生殖基因与每窝产仔数改变相关联，其特征在于所述方法包括选择与该生殖基因RBP4连锁的核酸序列；获得生殖性能繁殖价值不同的各个动物的核酸；测定所述基因中的多态性；以及将这种多态性与繁殖价值高或低相关联。
全文摘要
本文公开了动物优良生殖性能,例如每窝仔数和断奶体重的基因标记,鉴定这种标记的方法和筛选动物以确定更可能产生优良生殖性能的动物,以及为了将来的繁殖目的优先选择这些动物方法。此标记是基于猪生殖基因,视黄醇结合蛋白4中是否存在某种多态性。
文档编号C12Q1/68GK1334880SQ99816168
公开日2002年2月6日 申请日期1999年1月15日 优先权日1999年1月15日
发明者M·F·罗特希尔德, C·K·塔格尔, L·A·梅瑟 申请人:衣阿华州立大学研究基金会股份有限公司