本发明涉及天然维生素E的生产方法，具体地说是一种利用制备色谱技术从母育酚中分离纯化制备高纯度、高相对含量生育三烯酚的方法。
背景技术：
生育三烯酚是天然维生素E族的成员，在自然界，已知的天然维生素E族成员有8种，统称为母育酚(tocols)，分别为α、β、γ及δ-生育酚和α、β、γ、δ-生育三烯酚。生育酚和生育三烯酚之间的区别在于后者的侧链上有3个双键，不同生育酚或生育三烯酚之间的区别是环状结构上的甲基的数目和位置不同。
生育三烯酚的自然来源十分有限，在正常食物中不大可能摄取到大量的生育三烯酚。生育三烯酚现有的三种商业来源——棕榈油、米糠油脱臭馏出物及脂树红豆(Annatto)；其中棕榈油含有600-1000ppm的母育酚，其脱臭馏出物中大约含有0.1-2％的母育酚，是生育三烯酚最可靠的商业来源。目前全球棕榈油每年产量超过2000万吨，每年均在稳步上升，而且资源高度集中，主要分布于马来西亚和印度尼西亚。除此之外，生育三烯酚另外的一个商业来源是米糠油脱臭馏出物，现估计全球米糠油产量约80-100万吨左右，主要分布于亚洲的中国、印度及泰国等水稻主产国。
由于生育酚研究较早，生理功能也得到认可，并且已经广泛应用，因此通常所说的天然维生素E是指生育酚。随着科学研究的深入，研究人员生育酚与生育三烯酚的生理功能及活性是有差别的，尤其是生育三烯酚在某些方面有比生育酚更优越的生理功能，是生育酚所欠缺的，这些研究资料显示出生育三烯酚可取代一些现有药品的潜质，而且包含了多种治疗功能的性质，且未有发现副作用及可能产生的毒性。同时，也有研究表明较高纯度的生育酚会削弱生育三烯酚的生理功能，因此有必要将二者分离。
天然生育三烯酚的提取难点在于以下几个方面：1：含有生育三烯酚的植物资源有限(米糠油、棕榈油及大麦油等少数几种油料作物)且含量低，提取难度大；2：生育三烯酚含有双键，较生育酚更容易氧化损失，提取条件较苛刻；3：生育三烯酚与生育酚结构和性质高度相近，不易分离。
目前高含量的生育三烯酚分离纯化绝大部分是以其植物油脂的脱臭馏出物为原料，粗提技术与生育酚类似，可以借鉴当期较成熟的生育酚提取纯化方法浓缩母育酚，以提高原料中母育酚的含量，减轻后续提取的负荷，后期则需着重考虑生育酚与生育三烯酚在一些特定方面的性质差异，从而使之与生育酚分离。
美国专利US 5157132公开了一种从棕榈油脱臭馏出物中提取类胡萝卜素及母育酚的方法，首先利用KOH的甲醇溶液皂化PFAD中的FFA，然后用石油醚萃取分层，上层即为富含类胡萝卜素的石油醚层，下层再用石油醚萃取，如此反复多次萃取分层，合并石油醚层并减压脱去溶剂即得到类胡萝卜素浓缩物，下层水洗，脱气、分子蒸馏蒸去低沸点的脂肪酸甲酯，残余物即为富含母育酚的浓缩物。此浓缩物上氧化铝柱色谱，首先利用正己烷洗脱脂肪酸甲脂等非极性不吸附物，然后再利用异丙醇正己烷的混合溶液梯度洗脱，分段收集，最后选择性合并含有母育酚的馏分并减压蒸干溶剂后，最后母育酚含量20.7％，母育酚中生育酚和生育三烯酚没有分离。
美国专利US 5190618以PFAD为原料，采用酯化、酯交换将FFA和甘油酯转换为低沸点的脂肪酸甲酯，之后采用高真空蒸馏的方式去除脂肪酸甲酯，总VE浓度从最初的0.4％-0.5％浓缩到8-9％；之后利用溶剂冷冻结晶析出甾醇，提取液上阴离子交换树脂进行纯化，最后经分子蒸馏和脱臭精制得到纯度高达95％的母育酚产品，生育酚与生育三烯酚也没有分离。
中国专利CN1079795公开了一种从米糠原料中以高产率稳定和回收生育酚和生育三烯酚产物的方法，该方法包括加热米糠原料以使破坏性的酶失活，稳定米糠，再萃取得到富含母育酚的米糠油，然后通过物理精炼，分子蒸馏提取母育酚，母育酚中生育酚与生育三烯酚也没有分离。
美国专利US6224717也以PFAD为原料，先将PFAD中的醇类物质如甾醇、单甘酯、双甘酯与FFA反应生成甾醇酯与脂肪酸甲酯，然后精馏分离母育酚，之后再用生育酚及生育三烯酚在各类溶剂中(尤其是含水的醇类)分配的差异采用逆流萃取法分离生育酚和生育三烯酚，最终能获得高含量的混合生育酚三烯酚及其单体。
以上公开的专利文献中描述了从植物油脱臭馏出物中分离或者富集母育酚的方法，但是这些方法通常生产的是天然母育酚的混合物，包含了生育酚和生育三烯酚，少数溶剂萃取能分离生育酚和生育三烯酚，但是在商业规模方面经济上是不可行的。为了获得纯的生育三烯酚家族成员，后期必须借助色谱层析的方式分离。如公开专利EP1336610、 JP61-151186、US6395915及US20140179933所述的方法。专利EP1336610及US20140179933采用模拟移动床层析色谱分离棕榈油来源的母育酚浓缩物，由于模拟移动床各区间阀门切换时间上不易操作，溶剂的选择和回收上存在一定的困难，尤其是这种设备成本很高，国内尚未有工业化分离母育酚的报道。专利US6395915采用两次反相色谱分离，分离效率低，分离成本高。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是克服上述现有技术存在的缺陷，提供一种利用制备色谱纯化技术从母育酚中低成本分离纯化制备高纯度、高相对含量生育三烯酚的方法。
为此，本发明采用如下的技术方案：从母育酚中分离纯化制备高纯度生育三烯酚的方法，其特征在于：使用正相制备色谱，将母育酚吸附于正相制备色谱的固定相，母育酚的含量为70-90％，其中生育三烯酚相对含量为50-80％，来源于棕榈油脱臭馏出物或其浓缩物，所述的母育酚为生育三烯酚及至少一种生育酚同系物的混合物，经过一次色谱纯化得到母育酚含量≥90％，其中生育三烯酚相对含量≥90％的产物；
该方法包括下述步骤：
A)将适量的母育酚溶解在流动相一中，常温下充分溶解，得上样液；
B)用制备泵将上样液打入正相色谱层析柱中，层析柱中预先装填正相色谱固定相，上样结束后，再利用制备泵依次将流动相一、二和三加入正相色谱层析柱中；
C)分段收集洗脱液，减压回收溶剂后，获得流出液一、二和三，其中流出液二中母育酚含量≥90％，生育三烯酚相对含量≥90％；
其中，所述的正相色谱固定相为非键合硅胶，其粒径为20～200μm，孔径为形状为球型或不定型；
所述的流动相一为低极性有机溶剂；流动相二为低极性有机溶剂与高极性有机溶剂的混合溶剂，其中低极性有机溶剂的体积百分比大于60％；流动相三为高极性有机溶剂；
所述的低极性有机溶剂选自正己烷、环己烷、正庚烷、石油醚中的一种，所述的高极性有机溶剂选自异丙醇、乙酸乙酯、四氢呋喃、甲基叔丁基醚中的一种。
进一步，所述非键合硅胶的粒径优选为40～100μm，孔径优选为实验发现粒径较小则分离效果较好、收率相对较高，但粒径越小，层析柱压越高，配套仪器精密度、密封性要求也高。
进一步，上样液中母育酚的质量为硅胶质量的0.05-0.5倍。
制备色谱纯化技术一般分为正相制备色谱纯化与反相制备色谱纯化。
所谓正相制备色谱是指用的固定相通常为非键合硅胶或键合其他具有极性官能团，如胺基团和氰基团的键合相填料。由于硅胶表面的硅羟基或其他团的极性较强，因此，分离的次序是依据样品中的各组份的极性大小，即极性强弱的组份最先被冲洗出色谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低。反相色谱填料常是以硅胶为基础，表面键合有极性相对较弱的官能团的键合相。反相色谱所使用的流动相极性较强，通常为水与甲醇，己腈等混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强组合最先被冲出，而极性弱的组份会在色谱柱上有更强的保留。常用的反相填料有C18、C8、C4及C6H5等。
色谱层析处理量小，分离精度高，所以富含母育酚的原料一般采用其它简单，快速、处理量大、成本低的分离手段预浓缩，以富集母育酚，最后再借助精密、高效的色谱层析分离母育酚中生育酚和生育三烯酚。所以用于本发明的母育酚浓缩物中母育酚含量一般大于等于70％，优选≥80％。可用于本发明的商购可得的产品有日本谷维素油化(Oryza oil&Fat Co.Ltd)的(90％的总母育酚，生育三烯酚相对含量60％，来源于米糠油)、马来西亚超维特(Carotech)(90％的总母育酚、生育三烯酚相对含量75.8％，来源于棕榈油)、马来西亚Supervitamin公司Super-T80(棕榈油来源、母育酚含量80％，三烯酚相对含量68.1％)北京绿色金可(beijing Gingko Group)Ginnoway TM，棕榈油来源的T90(母育酚90％，三烯酚相对含量72.1％)及米糠油来源的T90(90％的母育酚，生育三烯酚相对含量占55.0％)浓缩物。
在本发明涉及的制备高纯度、高相对含量的生育三烯酚的正相层析色谱纯化方法中，其所述的流动相的流速根据制备柱的大小、制备泵所承受的流量大小，以及流动相对杂质的分离度决定的；其中所述的产物的收集，由于样品的上样量比较大，会在图谱中形成平顶峰，可根据分离效果来决定收集的起止时间，划分馏分；如果杂质的分离效果特别好，可以从产物刚出来就可以收集，如果杂质的分离效果比较差，也可以收集平顶峰中间的某一段。收集到含有产物的馏分后，减压回收溶剂，得到产物，产物的纯度用HPLC检测。
本发明采用的另一技术方案如下：从母育酚中分离纯化制备高纯度生育三烯酚的方法，其特征在于：使用反相制备色谱，将母育酚吸附于反相制备色谱的固定相，母育酚的含量为70-90％，其中生育三烯酚相对含量为50-80％，来源于棕榈油脱臭馏出物、米糠油脱臭馏出物、棕榈油脱臭馏出物的浓缩物或米糠油脱臭馏出物的浓缩物，所述的母育酚为生育三烯酚及至少一种生育酚同系物的混合物，经过一次色谱纯化得到母育酚含量≥90％，其中生育三烯酚相对含量≥90％的产物；
该方法包括下述步骤：
A)将适量的母育酚溶解在流动相一中，充分溶解，得上样液；
B)用制备泵将上样液打入反相色谱层析柱中，层析柱中预先装填反相色谱固定相填料，上样结束后，再利用制备泵依次将流动相一和二加入反相色谱层析柱中；
C)分段收集洗脱液，减压回收溶剂后，可获得流出液一、二和三，其中流出液二中母育酚含量≥90％，生育三烯酚相对含量≥90％；
其中，所述的固定相为键合硅胶，其粒径为20～200μm，孔径为形状为球型或不定型；
所述反相色谱固定相的键合基团选自烷基、苯基、烷基甲硅烷基中的至少一种，
所述的流动相一为极性有机溶剂的水溶液，水的体积百分比为1-20％；流动相二为极性有机溶剂；
所述的极性有机溶剂为甲醇、乙醇及乙腈中的一种。
进一步，所述反相色谱固定相的键合基团优选烷基，所述的烷基优选丁基、辛基、十八烷基的至少一种，更优选十八烷基。
进一步，上样液中母育酚的质量为硅胶质量的0.01-0.5倍。
进一步，所述键合硅胶的粒径为40～100μm，孔径为实验发现粒径较小则分离效果较好、收率相对较高，但粒径越小，层析柱压越高，配套仪器精密度、密封性要求也高。
在本发明涉及的制备高纯度、高相对含量的生育三烯酚的反相层析色谱纯化方法中，其所述的流动相的流速根据制备柱的大小、制备泵所承受的流量大小，以及流动相对杂质的分离度决定的；其中所述的产物的收集，由于样品的上样量比较大，会在图谱中形成平顶峰，可根据分离效果来决定收集的起止时间，划分馏分；如果杂质的分离效果特别好，可以从产物刚出来就可以收集，如果杂质的分离效果比较差，也可以收集平顶峰中间的某一段。收集到含有产物的馏分后，减压回收溶剂，得到产物，产物的纯度用HPLC检测。
采用本发明的方法，能在中低压条件下实现原料一次上柱分离得到高纯度、高相对含量的生育三烯酚浓缩物。色谱层析柱内填料能够再生，使用的溶剂可以回收套用，设备简单，步骤简洁，大大降低生产成本。本发明的色谱层析方法分离得到的生育三烯酚单体经过分子蒸馏后的纯度能够达到95％以上，生育三烯酚的收率大于等于80％，能够用于食品添加剂、膳食补充剂、药品等领域，延长产品链，提高产品附加值。
本发明与现有技术相比的优点在于，经过预提纯得到的母育酚，通过一次低压柱色谱纯化方法，可以直接得到高纯度，高相对含量的生育三烯酚浓缩物，而不需进一步精制纯化。本发明方法的收率较高，从而提高了效率，降低产品成本。本发明的低压柱色谱纯化方法还可以很方便的放大到工业级，无需对方法进行大的更改，只需根据层析柱的大小成比例的调节流速的大小。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明。应该理解的是，本发明实施例所述制备方法仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例1：生育三烯酚的正相制备色谱纯化
仪器：中低压制备色谱系统，不锈钢色谱柱()，内装填400.0g Fuji公司“Chromatorex MB”系类非键合球型硅胶，柱体积650ml(1BV)，粒径40-75μm，孔径
洗脱剂一∶正己烷；
洗脱剂二∶正己烷：乙酸乙酯＝90：10(体积比)；
洗脱剂三：乙酸乙酯；
检测波长：292nm，柱压0.1-0.3Mpa，载样量10％；
母育酚中生育酚及生育三烯酚的含量测定参见GB/T 26635-2011《动植物油脂-生育酚及生育三烯酚含量测定高效液相色谱法》；
将60ml洗脱剂一于常温下溶解40g母育酚浓缩物(来源于棕榈油，Catotech母育酚含量90.5％，生育三烯酚相对含量75.8％)，用制备泵将样品溶液打入色谱层析柱中，然后依次用2BV洗脱剂一、4BV洗脱剂二和2BV洗脱剂三顺序洗脱。首先非极性杂质和弱极性生育酚先被分离，然后生育三烯酚产物被洗脱，最后强极性杂质被洗脱，分段收集减压回收溶剂后分别得到生育酚组份、生育三烯酚组份和强极性组份。其中生育三烯酚组份中母育酚含量93.5％，生育三烯酚相对含量92.6％，收率82.5％。
实施例2：生育三烯酚的正相制备色谱纯化
根据实施例1相同的方法只是将填料换成Fuji“Chromatorex GS”系类非键合不定型硅胶，粒径40-75μm，孔径流动相一换成环己烷，流动相二换成环己烷：异丙醇＝98： 2，流动相三换成异丙醇，其它条件与实施例1相同。分段接收减压回收溶剂后得到生育酚组份、生育三烯酚组份及强极性组份。其中生育酚组份中母育酚含量89.2％，生育三烯酚相对含量91.4％，收率68.9％。
实施例3-6为分别按实施例1中的步骤通过正相色谱层析制备混合生育三烯酚，其结果见下表1；
实施例7：生育三烯酚的反相制备色谱纯化
仪器：中低压制备色谱系统，不锈钢色谱柱()，内装填400.0g富“ChromatorexMB”系类键合球型C18硅胶，粒径40-75μm，孔径
洗脱剂一∶甲醇：水＝95：5(体积比)；
洗脱剂二∶甲醇；
检测波长：292nm，柱压0.1-0.5Mpa，载样量3％；
将36ml洗脱剂一于常温下溶解12.0g母育酚浓缩物(来源于棕榈油，Catotech生育三烯酚相对含量75.8％)，用制备泵将样品溶液打入色谱层析柱中，然后依次用5BV洗脱剂一、3BV洗脱剂二顺序洗脱。首先强极性的杂质首先被分离，接着生育三烯酚组份被洗脱，最后生育酚组份被洗脱，分段收集减压回收溶剂后分别得到极性组份、生育三烯酚组份和生育酚组份。其中生育三烯酚组份中母育酚含量93.6％，生育三烯酚相对含量95.6％，收率82.5％；
实施例8：生育三烯酚的反相制备色谱纯化
根据实施例7相同的方法只是将填料更换为Silicycle公司的SiliasPhere PC C18系列键合球型硅胶，粒径40-75μm，孔径洗脱剂一换成乙醇：水＝90：10，洗脱剂二换成乙醇，原料来源于米糠油(生育三烯酚相对含量60.0％)，其它条件与实施例7相同。分段接收减压回收溶剂后得到强极性组份、生育三烯酚组份和生育酚组份。其中生育三烯酚组份中母育酚含量92.4％，生育三烯酚相对含量90.5％，收率73.2％。
实施例9-12为分别按实施例7中的步骤通过反相色谱层析制备混合生育三烯酚，其结果见下表2；