专利名称：布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验奶液抗体检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫学检验方法，具体说就是布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验奶液抗体检测试剂盒。
(二)
背景技术：
免疫学检测方法是应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因子的实验方法。随着学科间的相互渗透，免疫学涉及的范围不断扩大，新的免疫学检测方法层出不穷。免疫学方法的应用范围亦在日益扩大，不仅成为多种临床疾病诊断的重要方法，也为众多学科的研究提供了方便。
抗原与相应抗体相遇可发生特异性结合，并在外界条件的影响下呈现某种反应现象，如凝集或沉淀，藉此可用已知抗原(或抗体)检测未知抗体(或抗原)。试验所釆用的抗体常存在于血清中，因此又称之
为血清学反应(serological reaction)。抗原种类繁多，按其物理性状可分颗粒性和可溶性两类。前者指细胞性抗原(包括细菌抗原)，其制备较为简便， 一般用新鲜细胞以无菌生理盐水或磷酸缓冲液洗涤后配成一定浓度。若系细菌抗原，则取新鲜培养物，经集菌作如下处理，H抗原因不耐热用0. 3% ~0. 5%甲醛处理，0抗原耐热可加热IO(TC2h去除H抗原后应用。可溶性抗原可以是细胞膜、细胞浆、细胞核及核膜等细胞组成部分，也可能是经细胞分泌至体液中的一些可溶性因子。细胞组成部分常需经过机械或酶解法等破碎、离心获得粗制抗原，并通过选择性沉淀或层析等方法进一步纯化。而体液中(如血清等)的可溶性抗原则可直接用生化手段获得所需成分。有些可溶性抗原仅具有免疫反应性，而无免疫原性，此类抗原尚需与载体偶联方可成为完全抗原。
布鲁氏菌病(Brucellosis)又称地中海弛张热，马尔他热，波浪热或波状热，是由布鲁氏菌引起的人畜共患性全身传染病，其临床特点为长期发热、多汗、关节痛及肝脾肿大等。1886年英国军医Bruce在马尔他岛从死于"马尔他热"的士兵脾脏中分离出"布鲁氏菌"，首次明确了该病的病原体。1897年Wright与其同事发现病人血清与布鲁氏菌的培养物可发生凝集反应，称为Wright凝集反应，从而建
立了迄今仍用的血清学诊断方法。我国古代医籍中对本病虽有描述，
但直到1905年Boone于重庆对本病作正式报道。目前该病在世界分布，只有几个国家消灭此病，而在中国的东北，华北，西北一带有流行和分布，其它地区有散发，且日益广泛和危害严重。对畜牧业和人类来严重经济损失。
布鲁氏菌是一类革兰阴性的短小杆菌，内毒素是重要的致病物质。布鲁氏菌有强侵袭力，细菌可通过完整皮肤和粘膜进入宿主。布鲁氏菌有6个生物型，我国流行的是羊布鲁氏菌，牛布鲁氏菌和猪布鲁氏菌三种，其中以羊布鲁氏菌最常见。自然情况下，有60多种动物可感染布鲁氏菌，其主要是山羊，绵羊，牛和猪，以流产为主，孕期动物最为宜感。人类对布鲁氏菌易感，细菌进入人体后，迁延不愈，反复发作，发热呈波浪式，如不治疗，后果严重。
根据临床症状、流行病学特点和特征性病变，不难做出布鲁氏菌病的初步诊断，但由于在临床上小肠结肠炎耶氏菌、乙型副伤寒杆菌、大肠杆菌0: 157感染存在相似的症状，必须借助实验室诊断技术才能对布鲁氏菌病进行最后确诊。为了建立适合本病诊断和流行病学调查的快速、敏感、特异、准确的方法，国内外许多学者进行了大量研究，并取得了显著的成绩。先后建立了病原鉴定、荧光抗体中和检测等检测方法。然而，我国目前应用的虎红平板和试管凝集方珠为国际贸易淘汰方法，技术落后，假阳性也相对较高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种满足我国动物防疫需求的、快速、敏感、特异、稳定的布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验奶液抗体检测试剂盒。
本发明的目的是这样实现的它是利用平滑型布氏杆菌(B. abortus S1119. 3)与粗後型布氏杆菌(B. abortus RB51)的纯化脂多糖混合物作抗原包被酶标板，用S1119. 3免疫健康牛制备阳性对照奶液，用健康非免疫牛制备阴性对照奶液，以酶标记的与哺乳动物Fc段结合的受体一蛋白质AG作酶标记结合物，配以稀释液、洗涤液、底物溶液A、底物溶液B、 H202、终止液，组装组成。本发明还有以下技术特征
1. 所述的抗原包被酶标板的制备方法如下
(1) 包被无菌条件下，将两种纯化的冻干抗原用蒸馏水悬浮到冻干前的体积，按1: 5的比例混合光滑型与粗糙型抗原，再用0. 05MpH9. 6的碳酸缓冲液按1:1000稀释，以100(al/孔，包被聚苯乙烯96孔板(NUNC620或同等材料)，加盖于4匸温孵18小时；
(2) 洗涤以0.01mo1/1 pH值为7. 2的PBST作洗涤液，加入足量室温作用3分钟后甩去，如上重复3次，或用洗板机重复洗3次，拍干至无水印为止；
(3) 封闭用含O. P/。牛奶液白蛋白的0.01mo1/1 pH值为6.3的PBST按100ul/孔，加入至酶标板中，37X:作用l小时，甩去，加入足量洗涤液，室温作用3分钟后甩去，如上重复3次，或用洗板机重复洗3次，拍干至无水印为止，自然干燥；
(4) 包装将封闭好的抗原包被酶标板放于铝箔袋中，加入lg包装的干燥剂，用真空包装机将抗原包被酶标板包装好，贴上标签。
2. 所述的阳性对照奶液制备方法如下
(1)制造用动物制备阳性对照奶液的牛需要经过实验室检测，必须是18月龄性成熟、健康牛，无小肠结肠炎耶氏菌、乙型副伤寒杆菌、大肠杆菌0: 157感染、以及无繁殖系统感染等抗体阴性的健康牛。观察一周；
(2 )免疫原制备将布氏杆菌S1119. 3接种马铃薯浸液琼脂扁瓶，置37'C培养48小时，待形成一层菌落时，选取纯净扁瓶，吸弃凝集水，用含O. 5%苯酴的灭菌生理盐水将菌苔洗下，倾入中性玻瓶中，加甲醛溶液至终浓度为O. 2y。，置37'C振荡灭活48小时，按《中国兽药典》检验合格，于4X:以20000转/分钟离心10分钟，取沉淀，用生理盐水做IO倍稀释，用作免疫原；于2t: 8'C冰箱保存备用；
(3)免疫程序用免疫原按5ml/点分4点肌肉注射，免疫怀孕晚期动物，14日后，同法免疫一次，再14日，等待分娩，收集奶液，用
7ELISA检测;奶液OD450nm和阴性奶液OD450nm的比值(P/N) >1方可大量釆奶液；如检验不合格，应再加强免疫一次；
(4) 阳性奶液制造以常规方法釆血，分离其奶液，将其作为待检奶液，用奶液稀释液作l: 2, 1: 4...…l: 128稀释，用质控阳性奶液作参照进行ELISA试验，取待检奶液OD450nm/质控阳性奶液
OD450nm值-l时的待检奶液稀释度作为奶液稀释倍数，用奶液稀释液对奶液进行稀释；
(5) 除菌与分装将奶液用0.45jam的滤器进行抽滤除菌，无菌条件下加入硫柳汞和庆大霉素使其终浓度均为O. 02%以防腐，然后无菌条件下定量分装、冻干，贴上标签。
3. 所述的阴性对照奶液的制备方法如下
(1) 以常规方法釆集健康动物奶液，分离其奶液；
(2) 奶液处理与分装将奶液用0.45pm的滤器进行抽滤除菌，无菌条件下加入硫柳汞和庆大霉素使其终浓度均为O. 02%以防腐，然后无菌条件下定量分装，贴上标签。
4. 所述的酶标记结合物是酶标记的与哺乳动物Fc段结合的受体--蛋白质AG，酶标记蛋白质AG，用pH7. 2，PBS溶液作为酶标记结合物稀释液，按O. 5mg/ml稀释酶标记结合物；过滤除菌；将酶标记绪合物用0.45iam的滤器进行抽滤除菌，无菌条件下加入硫柳汞和庆大霉素使其终浓度均为O. 02%以防腐；分装冻干无菌条件下按O. 2ml/瓶分装酶标记结合物。
本发明布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验奶液抗体检测试剂盒，建立适合布鲁氏菌病诊断和流行病学调查的快速、敏感、特异、准确的检验方法，满足我国动物防疫的需求。
具体实施例方式
下面对本发明作进一步说明。
实施例1,本发明布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验奶液抗体检测试剂盒，它是利用平滑型布氏杆菌(B.abortus S1119. 3)与粗糙型布氏杆菌(B. abortus RB51)的纯化脂多糖混合物作抗原包被酶标板，用S19疫苗免疫健康牛制备阳性对照奶液，用健康非免疫牛制备阴性对照奶液，以酶标记的与哺乳动物Fc段结合的受体一蛋白质AG作酶标记结合物，配以稀释液、洗涤液、底物溶液A、底物溶液B、HA、终止液，组装组成。本发明还有以下技术特征
1. 所述的抗原包被酶标板的制备方法如下
(1 )包被无菌条件下，将两种纯化的冻干抗原用蒸馏水悬浮到冻干前的体积，按1:5的比例混合光滑型与粗糙型抗原，再用0. 05M pH9. 6的碳酸缓冲液按1:1000稀释，以lOO^il/孔，包被聚苯乙烯96孔板(冊NC620或同等材料)，加盖于4'C温孵18小时；
(2) 洗涤以0.01mo1/1 pH值为7. 2的'PBST作洗涤液，加入足量室温作用3分钟后甩去，如上重复3次，或用洗板机重复洗3次，拍干至无水印为止；
(3) 封闭用含O. P/。牛奶液白蛋白的0.01mo1/1 pH值为6. 3的PBST按100ul/孔，加入至酶标板中，37匸作用1小时，甩去，加入足量洗涤液，室温作用3分钟后甩去，如上重复3次，或用洗板机重复洗3次，拍干至无水印为止，自然干燥；
(4) 包装将封闭好的抗原包被酶标板放于铝箔袋中，加入lg包装的干燥剂，用真空包装机将抗原包被酶标板包装好，贴上标签。
2. 所述的阳性对照奶液制备方法如下
(1)制造用动物制备阳性对照奶液的牛需要经过实验室检测，必须是18月龄性成熟、健康牛，无小肠结肠炎耶氏菌、乙型副伤寒杆菌、大肠杆菌0: 157感染、以及无繁殖系统感染等抗体阴性的健康牛。观察一周；
(2 )免疫原制备将布氏杆菌S1119. 3接种马铃薯浸液琼脂扁瓶，置37。C培养48小时，待形成一层菌落时，选取纯净扁瓶，吸弃凝集水，用含O. 5%苯酴的灭菌生理盐水将菌苔洗下，倾入中性玻瓶中，加甲醛溶液至终浓度为O. 2%，置37°。振荡灭活48小时，按《中国兽药典》检验合格，于4。C以20000转/分钟离心10分钟，取沉淀，用生理盐水做IO倍稀释，用作免疫原；于2'C 8'C冰箱保存备用；
(3) 免疫程序用免疫原按5ml/点分4点肌肉注射，免疫怀孕晚期动物，14日后，同法免疫一次，再14日，等待分娩，收集奶液，用ELISA检测;奶液OD450nm和阴性奶液OD450nm的比值(P/N) 〉l方可大量釆奶液；如检验不合格，应再加强免疫一次；
(4) 阳性奶液制造以常规方法釆血，分离其奶液，将其作为待检奶液，用奶液稀释液作l: 2， 1: 4...…l: 128稀释，用质控阳性奶液作参照进行ELISA试验，取待检奶液OD450nm/质控阳性奶液OD450nm值4时的待检奶液稀释度作为奶液稀释倍数，用奶液稀释液对奶液进行稀释；
(5) 除菌与分装将奶液用0.45jam的滤器进行抽滤除菌，无菌条件下加入硫柳汞和庆大霉素使其终浓度均为O. 02%以防腐，然后无菌条件下定量分装、冻干，贴上标签。
3. 所述的阴性对照奶液的制备方法如下
(1) 以常规方法釆集健康动物奶液，分离其奶液；
(2) 奶液处理与分装将奶液用0.45nm的滤器进行抽滤除菌，无菌条件下加入硫柳汞和庆大霉素使其终浓度均为O. 02%以防腐，然后无菌条件下定量分装，贴上标签。
4. 所述的酶标记结合物是酶标记的与哺乳动物Fc段结合的受体--蛋白质AG;酶标记蛋白质AG,用pH7. 2，PBS溶液作为酶标记结合物稀释液，按O. 5mg/ml稀释酶标记结合物；过滤除菌；将酶标记结合物用0.45jam的滤器进行抽滤除菌，无菌条件下加入硫柳汞和庆大霉素使其终浓度均为O. 02%以防腐；分装冻干无菌条件下按O. 2ml/瓶分装酶标记结合物。
5. 所述的稀释液、洗涤液、底物溶液A、底物溶液B、 H202、终止液为O. 05M碳酸溶液、r/。的BSA溶液、IO倍洗液(PBST)、 IO倍样品稀释液、IO倍底物溶液A、底物溶液B 、 HA液和10倍终止液；所述的O. 05M碳酸溶液制备如下碳酸钠，1.93克；碳酸氢钠，3.80克；加蒸馏水至1000亳升，pH 9.6， 10磅高压15分钟；
所述的iy。的BSA溶液配制方法是取PBST溶液1000亳升，力口BSA 10克，调pH值7. 0,过滤除菌；
所述的10倍洗液(PBST)配制氯化钠，8克；磷酸二氢钾，0.2克；磷酸氢二钠(12H20)， 6. 29克；加蒸馏水至100毫升，力口O. 5毫升吐温20;调pH值7.2, 10磅高压15分钟；
所述的10倍样品稀释液的配制氯化钠，8. 5克；磷酸二氢钾，0. 2克；磷酸氢二钠(12H20)， 6. 29克;0. 5亳升吐温20， EDTA, 5.7克，加蒸馏水至100亳升，pH6. 3， 10磅高压15分钟；
所述的10倍底物溶液A的配制取柠檬酸4. 2g，醋酸钠13. 5g,加去离子水100ml，调pH值4. 0,过滤除菌；1. 2ml/瓶分装，密封瓶口，粘贴标签；
所述的底物溶液B配制取TMB 0. 2192g， 二甲基亚砜20ml,室温下溶解；0.5ml/瓶分装于黑瓶，密封瓶口，粘贴标签；
所述的11202液为0. 3%， 0. 2ml/瓶分装于黑瓶，密封瓶口 ，粘贴标签；
所述的10倍终止液的配制取55. 6毫升98%的浓硫酸加入80毫升水中，调至总体积100毫升；1.2亳升/瓶分装于小瓶，密封瓶口，粘贴标签、批次。
实施例2，就本发明布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验奶液抗体检测试剂盒的有关问题作如下说明
1菌种选择
布鲁氏菌牛型S1119. 3是传统的提取抗原的菌株。它来源于美国USDA,因S1119. 3不易转变为粗糙型，是国际动物卫生组织(OIE)认可的提取平滑型细菌脂多糖的菌株。RB51是牛布鲁氏菌粗糙型的变异菌株，作为一种牛布鲁氏菌疫苗株，也是国际通用提取粗糙型细菌脂多糖的菌株。用两种细菌脂多糖的混和物作抗原检测布鲁氏菌病抗体，目的是为了能够检测所有血清型布鲁氏菌抗体，提高检测试剂盒的检出率，避免漏检。2抗原制备
2.1细菌繁殖尽管布鲁氏菌在我国划为二类病原，但由于是人畜共患病原，所有活菌的繁殖与检定工作均在P3实验室内进行。
2.2细菌灭活方式出于生物安全性考虑，除活菌操作外，其他工作可在P2级实验室进行。灭活检验效果表明，布鲁氏菌RB51和S1119. 3的0. 5。/。苯酚生理盐水洗液80OC维持90分钟，能够有效杀死细菌，并对脂多糖提取没有影响。
2.3纯化、浓缩抗原的纯度是保证试剂盒特异性的关键指标。为提高脂多糖的纯度，利用布鲁氏菌脂多糖能特异性地存在于有机相苯酚的特性，釆用将醋酸钠甲醛溶液沉淀脂多糖抗原，再用水透析，从而获得纯化、浓缩的抗原。
2.4效价测定提纯抗原为用于包被酶标板，需用抗脂多糖的单克隆抗体测定抗原效价，根据试验研究，因为单克隆抗体识别单一抗原位点的专一性，按生产规程制备的抗原纯度基本符合试剂盒要求，但每批抗原的制造过程中LPS的量不是确定不变的，所以每批抗
原均需进行效价测定。使用经过标定的单克隆抗体，在抗原量足够时，其OD应为l. 5~2. 0，这个显色区间是ELISA最敏感，抗原量稍有变化，其OD即迅速变化，抗原量小于标准时，OD值可能偏低，试验不灵敏，OD值偏高(大于3.0)，可能会出现超出酶标仪的检测范围。
3酶标结合物
抗哺乳类动物Fc受体一蛋白质AG为克服传统间接ELISA方法酶标二抗宿主的单一性问题，采用酶标记的与哺乳动物Fc段结合的受体-蛋白质AG作为均一的酶标记物且与所有哺乳类动物抗体的Fc段结合。
4阴性对照动物奶液和阳性对照动物奶液
阳性对照奶液是试剂盒中验证ELISA试验操作是否正确、反应是否特异的一个重要成分，也是反应试剂盒是否工作的指标。为降低对照奶液的非特异性，制备阴性对照奶液和阳性对照奶液的动物均需进行布鲁氏菌抗体、小肠结肠炎耶氏菌抗体、乙型副伤寒杆菌抗体，大
肠杆菌0: 157抗体检验，并且检测阴性。
用大剂量灭活布鲁氏菌多次免疫的方法制备阳性奶液。动物首次
免疫10天后开始产生抗体，随着多次免疫刺激，其抗体水平在第二次免疫后20天左右达到高峰，持续时间达半年左右；
确诊为自然感染布鲁氏菌动物的奶液经无菌过滤后也可用作阳性对照血清，但必须经质控血清进行标定。
根据动物奶液布鲁氏菌病抗体间接ELISA试验的灵敏性试验研究，阳性对照奶液对单抗的阳性率接近10(W(阳性百分率)，基本上
完全显色。阴性对照奶液对单抗没有竟争抑制，由于奶液的影响，在间接ELISA实验中其OD值就略大于空白对照。
5关于临界值(cutoff )值确定阴阳性限值是决定检测结果准确性非常重要的指标。理论上检测限应为检测大量的阴性血清样品，进行阳性百分率分布研究，以排除非特异性反应影响特异性，但在实际工作上，难以得到大量的确定阴性样品，只能通过和其他的检测试剂进行比对来确定。
本发明的研究实验中，应用研制的动物奶液布鲁氏菌病抗体间接ELISA试剂盒检测30份布鲁氏菌病阴性奶液，53份免疫动物布鲁氏菌感染奶液及免疫奶液，应用国际上OIE已确认准确性的动物奶液结果进行比对，30份确定阴性样品其阳性百分率率均在20%以下。因此，确定检测限为20% P (阳性百分率)。
6试剂盒的特异性特异性是确定诊断结果准确与否的重要指标之一。为验证其特异性，用OIE标准阳性动物奶液、标准阴性奶液、阴性参考奶液、人工感染奶液、免疫奶液检测，阴性检出率为100%。用乙型副伤寒杆菌、小肠结肠炎耶氏菌、大肠杆菌0:157阴、阳性奶液进行检测，克服交叉反应的特异性达96.5%。试验结果表明，根据动物奶液布鲁氏菌病抗体间接ELISA试剂盒具有较高的特异性。
在实际应用时和对每批产品进行检测时不可能也没有必要对所
13有病进行一一检测，所以在制订特异性标准时只对与小肠结肠炎耶氏
菌阳性奶液、乙型副伤寒杆菌阳性奶液，大肠杆菌O: 157阳性奶液，疫苗型抗体，OIE标准阳性和标准阴性奶液进行检验验证。
7试剂盒的敏感性
由于我国大规模强制免疫动物，畜群中存在免疫抗体，从而使得一般血清学检测方法很难区分诊断。ELISA是目前检测抗布鲁氏菌病抗体最敏感的方法之 一 ，但在实际检测普查等工作中急需 一 种可以应用于快速，敏感，交叉反应小又尽量避免免疫抗体干扰的筛选检测方法。
研究过程中选用人工布鲁氏菌攻毒奶液37份，OIE标准阳性奶液16份，0IE标准阴性奶液8份，免疫疫苗阳性奶液5份分别用动物奶液布鲁氏菌间接ELISA试剂盒进行了检测，结果51份鲁氏菌病阳性奶液为阳性，敏感性为96. 23% (51/53)。
8关于用法与判定试验方法与试验结果密切相关，正确的操作和恰当的判定才能得出正确的结果，ELISA是非常敏感的检测方法，往往因为实验搡作不当造成检测结果差异很大，因此对用法与结果判定方法也做出具体规定试剂盒在使用前应恢复至室温，因冰冷的诊断试剂加入到酶标板上需要时间才能使反应条件达到18 ~ 28QC，这样就造成实际反应时间不足，影响抗原抗原结合。在洗板机操作条件下，4次洗板就足够。结果计算中，设计了两个阴阳性及空白对照以计算平均值，检测试验的准确性。阳性百分率的计算方法为国际上通用的计算方法。
9关于注意事项因为ELISA检测试剂盒中的成分均为生物活性成分，其中的抗体等又都是蛋白成分，在室温下及频繁升降温能够造成蛋白变性从而影响试剂盒的检测效果，所以必须按要求存放使用；另外，试剂盒中的显色剂及终止液均含有对人有害的化学物质，实验中应避免皮肤接触。
10关于稳定性、贮存和有效期布鲁氏菌病抗体I-ELISA检测试剂盒后分别放置在2 ~ 8QC和室温，每隔l个月取几条包被好的酶标板条进行检验，结果表明检测试剂盒在2 80C保存12个月，室温保存至
少4个月，其物理性状，检测特异性及灵敏性均不受影响。因此将保存期暂定为2-8i:保存，有效期1年。
实施例3,诊断布鲁氏菌病的初级结合试验，包括荧光偏振检测和酶联免疫吸附试验。荧光偏振法是一种均相法，不需要除去未结合试剂，操作速度快，两分钟便得到结果，可以消除一些疫苗反应。它既可以用于实验室检测，也可以运用于牧场和野外，适合野生动物布鲁氏菌病的检测。FPA的敏感性高，是优秀的筛选试验。价格相对低廉，准确度与其它的初级结合试验一样。这种类型的测定，也适合自动化。它的原理是测量分子反应率变化，这种改变是由于在试验样品中抗体与可溶性抗原反应引起。如果抗体结合抗原，抗原的旋转率将下降，则可测量这种反应。FPA的基本原理是分子在溶液中旋转随机利率与其大小成反比(小分子旋转快速，较大的分子更慢)。如果一
个小分子通过依附在一个更大的分子上使其变大，就可以测量小分子的旋转速度变化。FPA使用的是通过水解特异多糖再标记荧光制备的抗原。这种分子的平均相对分子质量为22kD ，使其远小于分子量为160kD的抗体分子(如IgG抗体)。FPA的操作方法中，可在玻璃管或96孔板内稀释血清、血液或牛奶后，使用FPA分析仪去掉本底的荧光读数。这个读数被存储并且在以后的读值中减去它。FPA分析仪通过偏振光通过特定的角度测量分子的转动速度。然后加入荧光标记的特异多糖抗原，混合后，孵育2分钟(血清或牛奶；全血孵育15秒)，最后用分析仪读取最终数值。如果在被验样品有抗体，抗原分子的旋转时间增加，导致较高的毫偏振单位(mP)读数。亳偏振单位(mP)读数的大小与抗体存在的数量成比例。
两种类型的酶联免疫吸附试验用于对抗体的检测。它们是间接酶联免疫吸附试验和竞争酶联免疫吸附试验。间接酶联免疫吸附试验，以抗体结合在固相上，用一种能与所选择的或所有同种型的抗体结合的酶标记试剂的反应。因为疫苗抗体也可能用这个法检测到，所以它主要是用来作为筛选试验。它有几个优点，包括自动化、商业供货、准确性、相对短的检验时间、相对便宜等适应性。间接酶联免疫吸附试验(IELISA)用于检测平滑或粗糙型布鲁氏菌产生的抗体，可用于大部分哺乳动物。此检验法可在90分钟内完成也可作为优秀的筛选 试验，用于实验室检测。它的敏感性最高，主要有于布鲁氏菌菌病的 消除计划。
快速间接酶联免疫吸附试验(RIELISA)，用于检测平滑或粗糙型 布鲁氏菌产生的抗体，可用于大部分哺乳动物。此检验法可在15分
钟内完成可作为优秀的筛选试验，最大优点是可以在牧场、田间操作、 快捷。
奶液间接酶联免疫吸附试验(MIELISA),用于检测反刍动物奶水 内的布鲁氏菌抗体，此常规检测法可测出平滑型布鲁氏菌在牛羊奶内 的抗体。耗时90分钟，为作为混合奶样品的筛选试验。因为检测动 物的奶液可以用于布鲁氏菌病的监测，同时也减少了对产奶动物的刺 激。
竟争酶联免疫吸附试验使用单克隆抗体与检验样品中的抗体竟 争。它不仅具有间接酶联免疫吸附试验属性，且有选择合适的亲和力 竟争抗体用以消除由于疫苗和交叉反应的抗体引起的血清学反应。竟 争酶联免疫吸附试验(CELISA)，用于检测平滑型布鲁氏菌产生的抗 体，适用于人和几乎全部动物。此检测法以高敏感度的单克隆抗体为 基础，是很好的最后布鲁氏菌病的确诊试验，也是用于区分疫苗免疫 和野毒感染的唯一方法。
权利要求
1.一种布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验奶液抗体检测试剂盒，其特征在于它是利用平滑型布氏杆菌(B.abortus S1119.3)与粗糙型布氏杆菌(B.abortus RB51)的纯化脂多糖混合物作抗原包被酶标板，用S1119.3疫苗免疫健康牛制备阳性对照奶液，用健康非免疫牛制备阴性对照奶液，以酶标记的与哺乳动物Fc段结合的受体--蛋白质AG作酶标记结合物，配以稀释液、洗涤液、底物溶液A、底物溶液B、H2O2、终止液，组装组成。
2. 根据权利要求l所述的一种布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试 验奶液抗体检测试剂盒，其特征在于所述的抗原包被酶标板的制备 方法如下(l)包被无菌条件下，将两种纯化的冻干抗原用蒸馏水悬浮 到冻干前的体积，按1: 5的比例混合光滑型与粗糙型抗原，再用0. 05M pH9. 6的碳酸缓冲液按1:1000稀释，以100|11/孔，包被聚苯乙烯96 孔板(NUNC620或同等材料)，加盖于4'C温孵18小时；(2 )洗涤以0. 01mol/l pH值为7. 2的PBST作洗涤液，加入 足量室温作用3分钟后甩去，如上重复3次，或用洗板机重复洗3次， 拍干至无水印为止；(3) 封闭用含O. 1%牛奶液白蛋白的0. 01mol/l pH值为6.3的 PBST按100ul/孔，加入至酶标板中，37。C作用l小时，甩去，加入足 量洗涤液，室温作用3分钟后甩去，如上重复3次，或用洗板机重复洗 3次，拍干至无水印为止，自然干燥；(4) 包装将封闭好的抗原包被酶标板放于铝箔袋中，加入lg 包装的干燥剂，用真空包装机将抗原包被酶标板包装好，贴上标签。
3. 根据权利要求l所述的一种布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试 验奶液抗体检测试剂盒，其特征在于所述的阳性对照奶液制备方法 如下(l)制造用动物制备阳性对照奶液的牛需要经过实验室检测，必须是18月龄性成熟、健康牛，无小肠结肠炎耶氏菌、乙型副伤寒杆菌、大肠杆菌0: 157感染、以及无繁殖系统感染等抗体阴性的健康牛,观察一周；(2 )免疫原制备将布氏杆菌S1119. 3接种马铃薯浸液琼脂扁瓶，置37。C培养48小时，待形成一层菌落时，选取纯净扁瓶，吸弃凝集水，用含0.5%苯酚的灭菌生理盐水将菌苔洗下，倾入中性玻瓶中，加甲醛溶液至终浓度为O. 2y。，置37。C振荡灭活48小时，按《中国兽药典》检验合格，于4'C以20000转/分钟离心10分钟，取沉淀，用生理盐水做IO倍稀释，用作免疫原，于2i: 8"C冰箱保存备用；(3) 免疫程序用免疫原按5ml/点分4点肌肉注射，免疫怀孕晚期动物，14曰后，同法免疫一次，再14日，等待分娩，收集奶液，用ELISA检测，奶液OD450nm和阴性奶液OD450nm的比值(P/N) 〉l方可大量采奶液，如检验不合格，应再加强免疫一次；(4) 阳性奶液制造以常规方法釆血，分离其奶液，将其作为待检奶液，用奶液稀释液作l: 2， 1: 4...…l: 128稀释，用质控阳性奶液作参照进行ELISA试验，取待检奶液OD450nm/质控阳性奶液OD450nm值^时的待检奶液稀释度作为奶液稀释倍数，用奶液稀释液对奶液进行稀释；(5) 除菌与分装将奶液用0.45pm的滤器进行抽滤除菌，无菌条件下加入硫柳汞和庆大霉素使其终浓度均为O. 02%以防腐，然后无菌条件下定量分装、冻干，贴上标签。
4.根据权利要求l所述的一种布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验奶液抗体检测试剂盒，其特征在于所述的阴性对照奶液的制备方法如下(1) 以常规方法釆集健康动物奶液，分离其奶液；(2) 奶液处理与分装将奶液用0.45nni的滤器进行抽滤除菌，无菌条件下加入硫柳汞和庆大霉素使其终浓度均为O. 02%以防腐，然后无菌条件下定量分装，贴上标签。
5.根据权利要求l所述的一种布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试 验奶液抗体检测试剂盒，其特征在于所述的酶标记结合物是酶标记的与哺乳动物Fc段结合的受体一蛋白质AG;酶标记蛋白质AG,用 pH7. 2，PBS溶液作为酶标记结合物稀释液，按O. 5mg/ml稀释酶标记结 合物；过滤除菌；将酶标记结合物用0.45nm的滤器进行抽滤除菌， 无菌条件下加入硫柳汞和庆大霉素使其终浓度均为O. 02%以防腐；分 装冻干无菌条件下按0.2ml/瓶分装酶标记结合物。'
全文摘要
本发明的目的在于提供一种满足我国动物防疫需求的、快速、敏感、特异、稳定的布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验奶液抗体检测试剂盒。它是利用平滑型布氏杆菌与粗糙型布氏杆菌的纯化脂多糖混合物作抗原包被酶标板，用免疫健康牛制备阳性对照奶液，用健康非免疫牛制备阴性对照奶液，以酶标记的与哺乳动物Fc段结合的受体——蛋白质AG作酶标记结合物，配以稀释液、洗涤液、底物溶液A、底物溶液B、H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>、终止液，组装组成。本发明布鲁氏菌病间接酶联免疫吸附试验奶液抗体检测试剂盒，建立适合布鲁氏菌病诊断和流行病学调查的快速、敏感、特异、准确的检验方法，满足我国动物防疫的需求。
文档编号G01N33/535GK101592660SQ20091007163
公开日2009年12月2日 申请日期2009年3月26日 优先权日2009年3月26日
发明者张晓艳 申请人:张晓艳