专利名称：一种乙酰胆碱酯酶荧光生物传感器的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种乙酰胆碱酯酶荧光生物传感器的制备方法。
背景技术：
我国是一个农业大国，农药是农业生产中十分重要的生产资料。由于有机 磷类农药具有药效高、品种多、防治对象多、在环境中易降解等优点，在我国
农业生产上得到大量使用。有机磷农药及残留物致使人、畜中毒的情况时常发 生。解决农产品的关键问题是检测技术建立一种准确快速、简单廉价的农药残 留检测技术是食品安全和环境保护的当务之急。
有机磷生物传感器快速检测方法的研制国内外均有报道，电化学酶电极生
物传感器的研制较多，但存在受环境影响造成酶活性丧失，造成假阳性；酶的 价格昂贵，不可逆反应造成生物传感器无法多次使用，仪器成本过高；选择性 不高。与电化学酶传感器相比，荧光型酶传感器具有不需连接外部电源不用参 考电极、体积小、质量轻、易于小型化、信息容量大、响应速度快等优点。
本发明制备的乙酰胆碱酯酶荧光生物传感器，具有贮存稳定性高、分离回 收容易、可多次重复使用、操作连续及可控、工艺简便、成本低廉等一系列优 点。可应用于食品中有机磷农药的快速检测。
发明内容
为了解决现有酶生物传感器受环境影响造成酶活性丧失、造成假阳性；酶 的价格昂贵、不可逆反应造成生物传感器无法多次使用、仪器成本过高等问题， 本发明提供了一种乙酰胆碱酯酶荧光生物传感器的制备方法，能有效提高食品 中有机磷农药残留测定的速度和精度。本发明中一种乙酰胆碱酯酶荧光生物传 感器的制备方法，其特征在于乙酰胆碱酯酶荧光生物传感器的制备方法的步骤 如下 一、乙酰胆碱酯酶的提取1、将购买的活鲫鱼头于自制冰盒保存，剪 开头骨，再用镊子将整个脑组织取出，以滤纸吸去血丝，并除去非脑组织，放 入表面皿中称重。2、 Tris-HCl浸提法含0.1%TritonX-100和0.05mol/LNaCl 的Tris-HCl冰浴条件下匀浆(每15s,间歇5s)。匀浆液在0 4。C离心(10000 r/min)10min。 二、纯化1、脱盐将硫酸铵分级盐析后，Tris-Hcl (0.07mol/l，pH=8)溶解的酶液装入透析袋中，对蒸馏水透析48h，并用BaCl2溶液检测透 析袋外溶液，直至透析袋外溶液与BaCl2溶液无沉淀生成。2、使用 SephadexG-200凝胶层析柱(2.5cmx60cm)，洗脱液为缓冲液，以一定的流速 每管3ml进行收集，测定每管酶液比活力，检测时做三个平行样。三、乙酰胆 碱酯酶固定化壳聚糖膜吸附-交联法固定化乙酰胆碱酯酶取0,2g壳聚糖粉 末，加入1%醋酸lOmL,室温下磁力搅拌5-10min，至形成黄色溶胶。4°C, lOOOOrymin离心3min，除去不溶颗粒。将纤维素膜(lcmxlcmx0.04cm)置于该 溶胶中浸泡12h，取出在自制晾干床上晾干后再置于0.1mol/L、 pH值为8.0的 PBS浸泡12h，取出，晾干备用。将5(^1酶液用移液器喷涂在已制备的壳聚 糖膜两面，置于4"C吸附，用戊二醛于4t:进行交联，取出旗，用PBS将多余 的戊二醛洗净，吸干，即制得壳聚糖酶膜。晾干最后得到乙酰胆碱酯酶荧光生 物传感器。
本发明中，在乙酰胆碱酯酶固定化方法中，采用壳聚糖吸附-交联法固定 化乙酰胆碱酯酶，克服了游离乙酰胆碱酯酶稳定性差,易失活、乙酰胆碱酯酶 催化反应后与反应体系混在一起,无法回收和重复利用、生产成本偏高等缺点。 与游离酶相比,固定化酶在保持其高效、专一及温和的酶催化反应特性的同时, 还呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用。所制备的乙酰胆碱酯 酶荧光生物传感器，具有贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操 作连续及可控、工艺简便、成本低廉等一系列优点。可应用于食品中有机磷农 药的快速检测。
具体实施例方式
具体实施方式
一本具体实施方式
中，1、 一种乙酰胆碱酯酶荧光生物传 感器的制备方法，其特征在于乙酰胆碱酯酶荧光生物传感器的制备方法的步骤 如下 一、乙酰胆碱酯酶的提取1、将购买的活鲫鱼头于自制冰盒保存，剪 开头骨，再用镊子将整个脑组织取出，以滤纸吸去血丝，并除去非脑组织，放
入表面皿中称重。2、 Tris-HCl浸提法含0.1 % Triton X-100和0.05mol/LNaCl 的Tris-HCl冰浴条件下匀浆(每15s，间歇5s)。匀浆液在0~4°(3离心(10000 r/min)10min。 二、纯化1、脱盐将硫酸铵分级盐析后，Tris-Hcl C0.07mo1/1， pH=8)溶解的酶液装入透析袋中，对蒸馏水透析48h，并用BaCl2溶液检测透析袋外溶液，直至透析袋外溶液与BaCl2溶液无沉淀生成。2、使用 SephadexG-200凝胶层析柱(2.5cmx60cm)，洗脱液为缓冲液，以一定的流速 每管3ml进行收集，测定每管酶液比活力，检测时做三个平行样。三、乙酰胆 碱酯酶固定化壳聚糖膜吸附-交联法固定化乙酰胆碱酯酶取0.2§壳聚糖粉 末，加入1%醋酸10mL，室温下磁力搅拌5 10min,至形成黄色溶胶。4'C， 10000r/min离心3min，除去不溶颗粒。将纤维素膜(lcmxlcmx0.04cm)置于该 溶胶中浸泡12h，取出在自制晾干床上晾干后再置于0.1mol/L、 pH值为8.0的 PBS浸泡12h，取出，晾干备用。将50pl酶液用移液器喷涂在已制备的壳聚 糖膜两面，置于4r吸附，用戊二醛于4"C进行交联，取出膜，用PBS将多余 的戊二醛洗净，吸干，即制得壳聚糖酶膜。晾干最后得到乙酰胆碱酯酶荧光生 物传感器。
具体实施方式
二本具体实施方式
与具体实施方式
一不同的是其特征在 于步骤一中，乙酰胆碱酯酶的提取，采用pH=8.0~10.0Tris-HCl溶液，冰浴条 件下匀浆4 10min(每15s，间歇5s)，匀浆比(质量体积)为1:5。其它与具体实 施方式一相同。
具体实施方式
三本具体实施方式
与具体实施方式
一不同的是其特征在 于步骤二中使用SephadexG-200凝胶层析柱纯化，洗脱液为0.1~0.2mol/L的磷 酸盐缓冲液，流速0.15mL/min。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
四本具体实施方式
与具体实施方式
一不同的是其特征在 于步骤三中50jil酶液置于4。C吸附12h，用0.1~0.4%戊二醛于4"C进行交联 1.0~3.0h。其它与具体实施方式
一相同。
权利要求
1、一种乙酰胆碱酯酶荧光生物传感器的制备方法，其特征在于乙酰胆碱酯酶荧光生物传感器的制备方法的步骤如下一、乙酰胆碱酯酶的提取1、将购买的活鲫鱼头于自制冰盒保存，剪开头骨，再用镊子将整个脑组织取出，以滤纸吸去血丝，并除去非脑组织，放入表面皿中称重。2、Tris-HCl浸提法含0.1％Triton X-100和0.05mol/LNaCl的Tris-HCl冰浴条件下匀浆(每15s，间歇5s)。匀浆液在0～4℃离心(10000r/min)10min。二、纯化1、脱盐将硫酸铵分级盐析后，Tris-Hcl(0.07mol/l，pH＝8)溶解的酶液装入透析袋中，对蒸馏水透析48h，并用BaCl2溶液检测透析袋外溶液，直至透析袋外溶液与BaCl2溶液无沉淀生成。2、使用SephadexG-200凝胶层析柱(2.5cm×60cm)，洗脱液为缓冲液，以一定的流速每管3ml进行收集，测定每管酶液比活力，检测时做三个平行样。三、乙酰胆碱酯酶固定化壳聚糖膜吸附-交联法固定化乙酰胆碱酯酶取0.2g壳聚糖粉末，加入1％醋酸10mL，室温下磁力搅拌5～10min，至形成黄色溶胶。4℃，10000r/min离心3min，除去不溶颗粒。将纤维素膜(1cm×1cm×0.04cm)置于该溶胶中浸泡12h，取出在自制晾干床上晾干后再置于0.1mol/L、pH值为8.0的PBS浸泡12h，取出，晾干备用。将50μl酶液用移液器喷涂在已制备的壳聚糖膜两面，置于4℃吸附，用戊二醛于4℃进行交联，取出膜，用PBS将多余的戊二醛洗净，吸干，即制得壳聚糖酶膜。晾干最后得到乙酰胆碱酯酶荧光生物传感器。
2、 根据权利要求1所述的一种乙酰胆碱酯酶荧光生物传感器的制备方法， 其特征在于步骤一中，乙酰胆碱酯酶的提取，采用pH=8.0~10.0Tris-HCl溶液， 冰浴条件下匀浆4 10min(每15s，间歇5s)，匀浆比(质量体积)为1:4 1:10。
3、 根据权利要求1所述的一种乙酰胆碱酯酶荧光生物传感器的制备方法， 其特征在于步骤二中使用SephadexG-200凝胶层析柱纯化，洗脱液为 0.1~0.2mol/L的磷酸盐缓冲液，流速0.1 0.5mL/min。
4、 根据权利要求1所述的一种乙酰胆碱酯酶荧光生物传感器的制备方法， 其特征在于步骤三中50^1酶液置于4。C吸附0~12h，用0.1~0.4%戊二醛于4°C 进行交联1.0 3.0h。
全文摘要
一种乙酰胆碱酯酶荧光生物传感器的制备方法，涉及一种乙酰胆碱酯酶荧光生物传感器的制备方法。本发明解决了现有酶生物传感器受环境影响造成酶活性丧失，造成假阳性；酶的价格昂贵，不可逆反应造成生物传感器无法多次使用，仪器成本过高；选择性不高等问题。一种乙酰胆碱酯酶荧光生物传感器的制备方法的步骤为首先对鲫鱼脑乙酰胆碱酯酶进行提取分离、纯化，然后采用壳聚糖将鲫鱼脑乙酰胆碱酯酶进行固定化，制备出固定化乙酰胆碱酯酶膜，即得酰胆碱酯酶荧光生物传感器。本发明制备的乙酰胆碱酯酶荧光生物传感器，具有不需连接外部电源、不用参考电极、体积小、质量轻、响应速度快、抗电磁干扰、防腐蚀、灵敏度很高、测量带宽很宽、操作简便、成本低廉等优点。可应用于食品中有机磷农药的快速检测。
文档编号G01N21/64GK101581670SQ200910072240
公开日2009年11月18日 申请日期2009年6月11日 优先权日2009年6月11日
发明者岩 焦, 王振宇 申请人:王振宇