专利名称：可控性肿瘤活细胞疫苗及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种可控性肿瘤活细胞疫苗及其制备方法和用途，属于肿 瘤生物免疫治疗和细胞免疫学领域。
背景技术：
目前，癌症仍然为人类的主要死亡原因。癌症治疗的常规方法，如手 术、放疗和化疗等，虽然在治疗一^良性及生长速度较慢的肿瘤效果较好， 但对于浸润生长、增殖快速的恶性实质肿瘤，这些常规的治疗措施疗效很 不理想。
大量研究表明，肿瘤细胞之所以能在生物体内失控生长、增殖，主要 原因是机体抗肿瘤免疫机制的缺陷或不完善，从而使肿瘤细胞逃避机体的 "免疫监视"而处于"免疫逃逸"状态，尤其反映在机体免疫细胞不能对 肿瘤抗原进行特异性免疫识别，自身难以激发足够的免疫反应。
近年来，肿瘤细胞疫苗的发展为治疗恶性肿瘤带来了希望。目前用于 制备肿瘤细胞疫苗的细胞主要有肿瘤细胞和抗原提呈细胞(Antigen Presenting Cells, APC)两种，所采用的方法通常有以下几种1、直接 将死亡全肿瘤细胞或肿瘤细胞裂解辆作为肿瘤疫苗；2、将基因修饰的APC (一般是树突状细胞Denditic Cells, DC)作为肿瘤疫苗；3、将APC尤 其是DC与肿瘤细胞进行融合形成杂交瘤，以其提取物作为肿瘤疫苗；4、 将基因修饰的肿瘤细胞灭活后制成肿瘤疫苗。
虽然采用上述方法制备的肿瘤细胞疫苗在体外、动物试验和临床前研 究方面证明其具有一定的有效性，但临床试验有效果不好，主要存在以下 缺陷或不足 ，
1、 抗原提呈效率低，抗原提呈不完全，如肿瘤DNA疫苗、RNA疫苗不 能通过MHC或HLA-II类分子对肿瘤抗原进行提呈，而灭活肿瘤细胞或其裂 解物与APC或T细胞共同培养又不能有效通过MHC或HLA- I类分子进行肿
瘤抗原提呈。 '
2、 多数为单价肿瘤疫苗，仅供特定个体免疫治疗，而绝大多数肿瘤 抗原异质性高，缺乏特异抗原表型，单价疫苗效果差。3、疫苗效价低，活的肿瘤疫苗具有高效的抗肿瘤免疫能力，肿瘤疫 苗的失活是导致其效价降低的主要原因之一。研究表明，细胞因子基因修 饰的瘤苗，其细胞因子的表达与细胞活性呈线性相关，经放射线处理后的 瘤苗与活瘤苗比较，细胞因子分泌量显著减少，经放射线处理后的肿瘤细 胞有可能产生肿瘤特异性抗原基因突变，导致肿瘤疫苗的特异性下降；而 DC经放射线照射后，其表面共刺激分子和MHC分子表达均下降，必然影响 DC提呈抗原的活性，刺激T淋巴细胞增殖的能力也显著降低。
发明内容
本发明的第一个目的，是为了克服现有的肿瘤细胞疫苗存在抗原提呈 效率低、抗原提呈不完全、单价疫苗效果差和g价低的缺陷，提供一种可 控性肿瘤活细胞疫苗。
本发明的第二个目的，是为了提供可控性肿瘤活细胞疫苗的制备方法。
本发明的第三个目的，是为了il供可控性肿瘤活细胞疫苗的用途。
本发明的第--.个目的可以通过采取如下技术方案达到 可控性肿瘤活细胞疫苗，其特点是
1) 由自杀基因胸苷激酶TK和免疫调节基因，通过转染肿瘤细胞进行
转基因操作形成双基因修饰的可控肿瘤活细胞疫苗；
2) 可直接接种宿主或与抗原提呈细胞DC融合后接种宿主，可控肿瘤 活细胞疫苗在接种-周后可以于体内给予GCV灭活；
3) 既可控制活疫苗体内生长，又可使目的基因充分分泌表达。 本发明的第一个目的还可以通过采取如下技术方案达到
所述的免疫调节基因可以是IL-18、 IL-12、 IL-2、 B7-l、 IFN-Y 、 GM-CSF
等各种免疫基因，以及其他治疗用具有免疫活性的目的基因等。
本发明的第二个目的可以通过釆取如下技术方案达到
可控性肿瘤活细胞疫苗的制备方法，其特征在于将自杀基因胸苷激
酶TK和免疫调节基因如IL-18通过慢病毒感染和脂质体介导的方式转染 肿瘤细胞进行转基因操作，筛选稳定表达上述目'的基因的细胞克隆培养扩 增获得双基因修饰的肿瘤细胞疫苗；具体包括如下歩骤1) 建立稳定表达TK基因的肿瘤细胞系；
2) 建立双基因修饰的肿瘤活细胞疫苗；
3) 活肿瘤细胞疫苗的体外调控抑瘤观察；
4) 活肿瘤细胞疫苗的体内调控抑瘤观察；
5) 活细胞疫苗致敏DC诱导制备特异性抗J3，瘤CTL。
本发明中进行转基因操作需要应用慢病毒载体，所述载体可以是腺相 关病毒载体、慢病毒载体或质粒DNA载体。
本发明中应用的慢病毒载体可以是第三代慢病毒载体质粒，所应用的 慢病毒表达系统ViraPowerTM Lentiviral Expression Systems 为载体质 粒、包装质粒、rev质粒和包膜蛋白质粒4质粒共转染293T细胞生产假病 毒颗粒。应用该系统包装的基因质粒克服了腺病毒作为载体转染时不能建 立长期稳定表达目的基因细胞系的缺点。
该包装系统中①去掉了 HIV的大部分的蛋白编码基因，不存在产生复 制型HIV的可能性；②慢病毒载体的包装质粒中缺失掉了 LTRs，因而载体 基因组只能在生产细胞中表达，而不可能被整合入病毒粒子中；③假型慢 病毒载体无复制性，只携带外源基因，相当均一，无类似于复制型腺病毒 (replication competent adenoviruses, RCA)之类的成分；④载体基因 组有自灭活机制，整合于宿主基因组后，不可能再被拯救而产生可被包装 的病毒基因组，因而其生物安全性极高。
本发明所述包装系统中去掉了 HIV的大部分的蛋白编码基因；慢病毒 载体的包装质粒中缺失掉了 LTRs;假型慢病毒载体无复制性，只携带外源 基因；载体基因组有自灭活机制。
本发明的第三个目的可以通过采取如下技术方案达到
可控性肿瘤活细胞疫苗的用途，其特征在于通过基因修饰的活肿瘤
细胞疫苗激活免疫系统淋巴细胞增殖，产生特异性CTL杀伤效应和/或非 特异性NK杀伤效应，在宿主体内产生显著增强的抗肿瘤免疫应答。
本发明所述的可控肿瘤活细胞疫苗可以单独使用，或与手术、放疗、 化疗及其他生物治疗联合应用以取得最佳疗效。
本发明所述的可控肿瘤活细胞疫苗可以直接使用，也可以在体外刺激产生细胞毒性T淋巴细胞，间接使用。
本发明所述的可控肿瘤活细胞疫苗使用途径包括但不限于以下几种 皮下、皮内、肿瘤内注射，其中以靠近腋窝、腹股沟附近的皮内注射为佳。
应用本发明处理细胞时，外源基因表达效率的提高不是由转导的基因 种类引起的，因此多种基因都可以用于转染，以适应不同设计需要，例如 IL-12、 IL-2、 B7-1、 IFN-y、 GM-tSF等各种免疫基因，以及其他治疗用 具有免疫活性的目的基因等。
本发明具有如下有益效果
1、本发明克服了现有技术中的缺点，通过对肿瘤细胞进行转基因操 作，制备成可调控的活细胞疫苗免疫治疗恶性肿瘤的新策略以及制备方 法，经过这样的处理后，肿瘤疫苗的效价更高，肿瘤抗原的提呈更加完全， 外源免疫调节基因的表达增高并且稳定，更好的实现转基因的效果，从而 增强肿瘤疫苗激发的特异性免疫反应，增加肿瘤疫苗的疗效。
2 、本发明利用HSV-TK/GCV系统在特定时间控制免疫调节基因修饰的 肿瘤细胞疫苗死活，有机地结合免^基因工程化技术和DC疫苗的优势达 到抗原提呈及目的基因分泌最大化的双重效应。在保证安全性的前提下， 这一疫苗策略可扩展为使用同种异体肿瘤细胞系建立活细胞通用疫苗库， 克服自身肿瘤取材及培养的不足，同时有利于克服自身肿瘤抗原免疫逃逸 的缺点，刺激机体产生更强的免疫识别和杀伤效应。
3、 本发明首次利用慢病毒载体取代传统的逆转录病毒包装携带TK基 因，大大提高了转染效率，可以高效整合入肿瘤细胞基因组中，经过加压 筛选获得稳定传代表达的细胞系，为活疫苗构建奠定了前提基础。
4、 本发明能满足大量肿瘤疫苗制备要求，适于建立通用抗肿瘤疫苗 库，可缩短现有疫苗方法的制备时间和成本，并且容易形成一种恶性肿瘤 免疫治疗标准。 ，
图l为本发明通过HSV-TK/GCV系统对U87/TK/I1-18肿瘤细胞疫苗 "死活"的体外调控示意图。
图2为本发明通过MTT法测试GCV对U87/ TK/IL-18肿瘤细胞疫苗的
增殖抑制示意图。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于 说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的 实验方法，如大肠杆菌感受态细胞的制备与转化、质粒提取及限制性内切 酶消化、DNA片段的回收、线性DNA片段的连接、重组质粒的筛选与鉴定、 PCR扩增反应、蛋白印迹等按照常规条件如Sambrook等，分子克隆实验 室手册 (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 中 所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1:
本实施例提供一种可控肿瘤活细胞疫苗，其特点是
1) 由自杀基因胸苷激酶TK和免疫调节基因，通过转染肿瘤细胞进行
转基因操作形成双基因修饰的可控i中瘤活细胞疫苗；
2) 可直接接种宿主或与抗原提呈细胞DC融合后接种宿主，可控肿瘤 活细胞疫苗在接种一周后可以于体内给予GCV灭活；
3) 既可控制活疫苗体内生长，又可使目的基因充分分泌表达。 本实施例的制备方法包括如下步骤
1、建立稳定表达TK基因的肿瘤细胞系 '
本实施例以脑胶质瘤细胞株U87为例进行说明，所述操作均在无菌条
件下进行。
(1) 肿瘤细胞体外培养 ，
按照ATCC (http : 〃www. atcc.org)哺乳动物细胞培养方案及U87细胞 系培养方案，用含10。/。胎牛血清(FBS)、青霉素100U/ml、链霉素100Pg/ml 和1%L-谷氨酰胺的DMEM(高糖)完全培养基培养，置于5%C02、 37°C、饱 和湿度条件培养箱中培养。
(2) TK基因修饰肿瘤细胞
对数生长期的胶质瘤U87细胞铺6孔板，2.'0X105 cells/per well, 在37°C、5%C02饱和湿度培养箱培养；感染前更换新鲜DMEM完全培养基， 置于培养箱中待用；将表达TK基因的载体pLenti-TK质粒(含抗性基因 BSD)慢病毒液，由-7(TC冰箱取出，37。C水浴融化，按10-2终稀释比，加入培养孔板感染肿瘤细胞，前后晃板混匀，置于箱中培养24h后更换培 养液继续培养24h更换含BSD(终浓度6 u g/ml)的新鲜DMEM完全培养基 筛选；每3 4d更换培养基，给予BSD压力培养10d后，采用画圈法挑取 单克隆细胞株，扩增传代，RT-PCR及Western鉴定目的基因的表达。
2、 建立双基因修饰的肿瘤活细胞疫苗 '
本实施例以免疫调节基因IL-18为例进行说明，以筛选获得稳定高表 达目的基因的肿瘤细胞株为活疫苗的主体。
利用LipofectamineTM 2000纟旨质体转染试剂盒(Sigma产品)介导的 pcDNA3. l-hIL-18转染U87/TK细胞。U87/TK细胞以1X105 cells/500 u 1 /well铺24孔板培养，达到90%融合度时转染；将lug的质粒稀释于 50 u 1无血清的DMEM培养基中，轻轻混匀；2u 1的LipofectamineTM 2000 溶于50y 1无血清的匿EM培养基中，室温下孵育5min;稀释后的质粒与 LipofectamineTM 2000轻轻均匀混合，室温下孵育20min;将转染液 (100u l)加入待转染的细胞孔中，前后轻摇培养板充分混匀，置于37"C、 5%C02饱和湿度培养箱；转染后次闩更换为DM'EM完全培养基继续培养， 转染后48h更换为含G418及BSD的DMEM完全培养基筛选培养；每3 4d 更换培养基，给予G418及BSD压力培养10d后，采用画圈法挑取单克隆 细胞株，扩增传代，RT-PCR、 ELISA及Western鉴定目的基因的表达。
3、 活肿瘤细胞疫苗的体外调控抑瘤观察
将U87/TK/IL-18细胞接种96孔板，每孔接种细胞2 4X 103，置于 37°C、 5%C02培养箱培养使细胞贴壁生长；6h或过夜后加入GCV，使GCV 终浓度为0、 0.01、 0.1、 1、 10、 50ug/ml，每组设3个复孔，置于培养 箱中培养6天，每天观察细胞存活情况；6天后，吸除96孔板中培养液， 加入200ixl无血清纯培养液稀释的0.5mg/mlMTT溶液，37'C避光培养 4-6h;除去MTT液，加入100u 1DMS0溶液，在ll联免疫检测仪上以570nm 吸收波长测定各孔吸光度值，计算细胞存活率。细胞存活率=(实验孔吸 光值/对照孔吸光值)X100%，细胞杀伤率=1一细胞存活率。
4、 活肿瘤细胞疫苗的体内调控抑瘤观察
(1)将生长状态良好的体外培养的活细胞疫苗以4.2X106个/只分 别皮下接种于裸鼠腋下， 一周后随机分组，给予GCV100mg/kg，给药途径 为腹腔注射给药，给药容量0. lml/10g体重，l次/天，连续给药7天。
9(2)实验过程中比较各组动物存活时间的'差异；根据以下公式计算 肿瘤体积V4/2X长径X短径2，计算肿瘤体积并比较各组间肿瘤生长曲
线的差异。
(3 )疗效评价按照RTV=Vt /,V0公式计算相对肿瘤体积(RTV )和相 对肿瘤增殖率T/C%， T/Cy^给药组的RTV平均值/阴性对照组的RTV平均值
X100%， (Vt:每天测量肿瘤得到的瘤体积；V0:初始瘤体积(给药前))，
如果1/0%>40%，为无效，如果T/C。/。《40。/。，经统计学处理P<0. 05，为有效。
(4)肿瘤组织的病理组织学观察观察各主要脏器有无转移瘤形成，
肿瘤及心肝脾肺肾等组织制备石蜡切片，进行病理组织学观察。
5、活细胞疫苗致敏DC诱导制备特异性抗肿瘤CTL
(1) DC细胞的培养和成熟
无菌操作抽取健康人外周血，jp素抗凝后缓慢加入装有淋巴细胞分离 液的离心管中，分层后离心弃上清，吸取中间的白色细胞层；在含有5% FCS和1%双抗的RPMI-1640中培养2小时，将悬浮的细胞(含T细胞) 吸出，置入含10U/ml人重组白介素-2(rhlL-2) 、 80ng/ml人重组GM-CSF、 10%FCS和1%双抗的RPMI-1640中培养，每二天换液一次。贴壁的细胞 加入DC培养液(含RPMI-1640、 5%FCS、 100U/ ml GM-CSF、 500 U/ml IL-4)， 于37。C、 5%C02的孵箱中培养，每三天换液，可加入40 ng/ml的TNF-a 或l y g/ml的LPS刺激DC成熟，第七天收获DC细胞备用。
(2) 肿瘤细胞疫苗在体外刺激DC
将制备好的肿瘤细胞疫苗加入成熟的DC细胞中，按DC与肿瘤细胞的 比例为5:1-10:1混合，37°C， 5%(:，02温箱孵育24 48h，作为致敏的抗原 提呈细胞。
(3) 特异性抗肿瘤CTL的诱导制备
将致敏的肿瘤细胞疫苗与10 20倍的自体淋巴细胞等体积混合，37 °C， 5%(:02温箱培养5 6天，3天后加入30U/ml的IL-2诱导抗原特异性 CTL的活化和扩增，收集通过Nylon wool分离的T cell，此特异性抗肿 瘤CTL细胞可直接应用于临床治疗。
(4) 细胞毒性T细胞(CTL)检测收集通过Nylon wool分离的T cell,与51Cr标记的肿瘤细胞混合， 在37'C、 5% C02培养箱内培养5小时，在Y射线检测仪上检测51Cr的 释放的强度，即可反映细胞毒性T细胞(CTL)对相应靶细胞的杀伤作用。
研究结果表明，本发明是一种安全、有效的基因工程肿瘤活细胞疫苗， 具有丌发成为用于恶性肿瘤治疗性疫苗的良好前景。
本发明利用基因工程技术，用免疫细胞因，基因修饰肿瘤细胞的瘤 苗，在体内细胞因子仅需极微量的表达，就可以达到大剂量全身系统给药 才能产生的生物学免疫反应，而且基因的持续表达，可以避免反复大剂量 给药对机体的副损害。经基因修饰的细胞疫苗更加高效地增强细胞的抗原 提呈能力，增加细胞的免疫原性，纠正患者的"免疫耐受"状态，激发和 强化患者自身的特异性抗肿瘤免疫功能。
权利要求
1、可控性肿瘤活细胞疫苗，其特征是1)由自杀基因胸苷激酶TK和免疫调节基因，通过转染肿瘤细胞进行转基因操作形成双基因修饰的可控肿瘤活细胞疫苗；2)可直接接种宿主或与抗原提呈细胞DC融合后接种宿主，可控肿瘤活细胞疫苗在接种一周后可以于体内给予GCV灭活；3)既可控制活疫苗体内生长，又可使目的基因充分分泌表达。
2、 根据权利要求1所述的可控性肿瘤活细胞疫苗，其特征是所述的免 疫调节基因是IL-18、 IL-12、 IL-2、 B7-l、 IFN-Y或GM-CSF免疫基因，或者是 治疗用具有免疫活性的目的基因。
3、 可控性肿瘤活细胞疫苗的制备方法，其特征在于将自杀基因胸 苷激酶TK和免疫调节基因如IL-18通过慢病毒感染和脂质体介导的方式 转染肿瘤细胞进行转基因操作，筛选稳定表达上述目的基因的细胞克隆培 养扩增获得双基因修饰的肿瘤细胞疫苗；具体包括如下步骤1) 建立稳定表达TK基因的肿瘤细胞系；2) 建立双基因修饰的肿瘤活细胞疫苗；3) 活肿瘤细胞疫苗的体外调控抑瘤观察；4) 活肿瘤细胞疫苗的体内调控抑瘤观察；5) 活细胞疫苗致敏DC诱导制备特异性抗肿瘤CTL。
4、 根据权利要求3所述的可控性肿瘤活细胞疫苗的制备方法，其特 征在于进行转基因操作需要应用慢病毒载体，所述载体是腺相关病毒载 体、慢病毒载体或质粒DNA载体。
5、 根据权利要求4所述的可控性肿瘤活细胞疫苗的制备方法，其特 征在于所应用的慢病毒载体为载体质粒、包装质粒、rev质粒和包膜蛋 白质粒4质粒共转染293T细胞生产假病毒颗粒。
6、 根据权利要求4所述的可控性肿瘤活细胞疫苗的制备方法，其特 征在于所应用的慢病毒载体中去掉了 HIV的大部分的蛋白编码基因；慢 病毒载体的包装质粒中缺失掉了 LTRs;假型慢病毒载体无复制性，只携带 外源基因；载体基因组有自灭活机制。
7、 可控性肿瘤活细胞疫苗的用途，其特征在于通过基因修饰的活 肿瘤细胞疫苗激活免疫系统淋巴细胞增殖，产生特异性CTL杀伤效应和/ 或非特异性NK杀伤效应，在宿主体内产生显著增强的抗肿瘤免疫应答。
8、 根据权利要求7所述的可控性肿瘤活细胞疫苗的用途，其特征在 于可控肿瘤活细胞疫苗单独使用，或与手术、放疗、化疗及其他生物治疗联合应用。
9、 根据权利要求7所述的可控性肿瘤活细'胞疫苗的用途，其特征在 于可控肿瘤活细胞疫苗可以直接使用，或者在体外刺激产生细胞毒性T 淋巴细胞，间接使用。
10、 根据权利要求7所述的可控性肿瘤活细胞疫苗的用途，其特征在 于可控肿瘤活细胞疫苗使用途径包括皮下、皮内、肿瘤内注射，其中以 靠近腋窝、腹股沟附近的皮内注射为佳。
全文摘要
本发明涉及一种可控性肿瘤活细胞疫苗及其制备方法和用途，其特征在于将自杀基因胸苷激酶TK和免疫调节基因通过慢病毒感染和脂质体介导的方式转染肿瘤细胞进行转基因操作，筛选稳定表达上述目的基因的细胞克隆培养扩增获得双基因修饰的肿瘤细胞疫苗。本发明疫苗能够激活免疫系统淋巴细胞增殖，产生特异性CTL杀伤效应和/或非特异性NK杀伤效应，在宿主体内产生显著增强的抗肿瘤免疫应答。本发明肿瘤疫苗的效价更高，肿瘤抗原的提呈更加完全，外源免疫调节基因的表达增高并且稳定，更好的实现转基因的效果，从而增强肿瘤疫苗激发的特异性免疫反应，增加肿瘤疫苗的疗效。
文档编号A61K39/00GK101559220SQ20081019875
公开日2009年10月21日 申请日期2008年9月25日 优先权日2008年9月25日
发明者戴学军, 健 林, 王伟民 申请人:广州军区广州总医院