水稻育性控制锌指蛋白基因的制作方法
【专利摘要】本发明公开了水稻育性控制锌指蛋白基因（OsSZP），其核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO：1所示。将SEQ?ID?NO：1所述基因片段正向和反向插入到真核载体中，获得本发明所述OsSZP基因RNA干涉真核重组质粒。将上述真核重组质粒转化水稻，获得OsSZP?RNA干涉转基因植株。实验表明：本发明所述SEQ?ID?NO：1基因能够控制水稻花粉育性；与野生型植株相比，OsZRL下调转基因植株花粉育性降低。因此，本发明所述基因对水稻雄配子发育具有负调控作用，并可在水稻遗传育种中应用。
【专利说明】水稻育性控制锌指蛋白基因
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物基因工程领域，尤其涉及一种水稻育性控制锌指蛋白基因。
【背景技术】
[0002]水稻是我国最主要粮食作物，水稻产量对保障国家粮食安全具有举足轻重的作用。我国水稻育种以杂种优势为标志的第二代“绿色革命”，使水稻产量有了前所未有的突破，杂交水稻育种三系法、两系法配套策略分别利用核质互作不育系和光、温敏不育系得以实现。另一方面，杂种不育又是远源杂种优势利用的主要障碍，因而育性在水稻遗传育种研究中备受关注。育性控制基因的分离克隆不仅可以促进对水稻育性形成分子机制的深入了解，还可以推动利用分子标记辅助育种、利用基因工程创造不育性和广亲和材料的研究，且对其它禾本科粮食作物遗传育种也具借鉴作用。
[0003]与其他植物一样，水稻的生殖发育也是在外部温度、光照和内部营养、激素等信号诱导下多个基因以复杂方式相互作用的综合结果。与拟南芥菜相比，水稻生殖发育基因调控研究结果相对较少，但在近年也取得了重要进展:(I)在水稻细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility, CMS)及其育性恢复基因定位分离方面,水稻第10染色体长臂被认为是不同类型CMS恢复基因的密集区。Wang等(Plant Cell，2006)对Boro II型细胞质雄性不育机制的研究表明，CMS由线粒体异常基因orf79编码的细胞毒素肽引起，在第10染色体Rf-1基因座位鉴定的两个恢复基因Rfla和Rflb均可破坏或降解细胞毒素肽而使水稻育性恢复，从而在分子水平解释了 Boro II型水稻细胞质雄性不育及育性恢复的机理。(2)对于水稻光、温敏性不育基因的精细定位已有较多的报道(Qiu等，HubeiAgricultural Sciences, 2007)。Chen 等(Plant Cell, 2007)在水稻育性转换机制的研究中发现，水稻尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因Ugpl是花粉发育所必需的，并认为Ugpl基因的温度敏感型可变剪接是其温敏不育表型的分子基础。(3)在水稻杂种不育分子机制研究方面，Chen等(Proc Natl Acad Sci USA, 2008)报道了编码天冬氨酰蛋白酶的S5基因在籼粳稻中的差异造成其杂种雌配子不育，广亲和品种的S5基因则因大片段缺失导致功能丧失而不影响杂种育性。Long等(Proc Natl Acad Sci USA, 2008)的研究则针对水稻籼粳杂种雄性不育进行，认为水稻第I染色体Sa基因座位两个邻近基因SaM和SaF的等位基因之间的互作影响了籼粳稻杂种一代的花粉育性，并由此提出“两基因/三组分互作”(two-gene/three-component interaction)水稻杂种不育分子机制。这些研究工作必然推动对水稻生殖发育基因调控的进一步系统阐述和对水稻丰富品种资源的优势利用。
[0004]植物生殖发育涉及众多基因，其中一些基因起到更重要的枢纽作用。在已经分离的植物开花调控和花器官发育基因中，锌指蛋白(zinc-finger protein)基因占有重要地位。锌指蛋白因其具有可以结合锌离子的指状结构域-锌指结构域(zinc-finger domain)而命名。根据锌指结构域中半胱氮酸(C)和组氨酸(H)残基的数目和位置可将锌指蛋白分为C2H2、C2HC、C2C2等亚类。锌指蛋白中有单个或成簇出现的锌指结构域，依赖在长期进化过程中形成的锌指结构域的多变组合，使其不仅可以结合DNA，还可以结合RNA、蛋白质和脂类底物，甚至同一类锌指蛋白也显示不同的结合特性。因此，锌指蛋白具有调控基因转录、染色质重构等多种生理功能(Gamsjaeger等,Trends Biochem Sci, 2007)。在植物中普遍存在锌指蛋白，模式植物基因组中发现几十甚至上百个锌指蛋白基因，其中有些锌指蛋白是植物所特有的，它们参与调控植物各个时期的生长发育。在拟南芥菜开花诱导中处于核心地位的CONSTANS(CO)基因编码锌指蛋白转录因子，它在长日照条件下激活下游基因的表达促进开花；水稻中CO的同源基因Hdl也编码锌指蛋白转录因子，但与CO不同的是Hdl在短日照条件下激活下游基因表达而促进水稻开花(Yano等，Plant Cell, 2000)。仙等(Proc Natl Acad Sci USA, 2008)在水稻中分离鉴定的锌指蛋白转录因子RID1，通过调控Hdl, RFTl等下游开花调控基因而影响水稻从营养生长向生殖生长的转化。在花粉发育方面，在矮牵牛中已发现有多个锌指蛋白在花药中特异表达并呈现明显的先后顺序(Kapoor等，Plant Cell, 2002)。拟南芥菜的PHD型锌指蛋白基因MALE STERILITY1 (MSl)是雄性不育基因，其功能是调控花粉和绒毡层的发育(Ito等，Plant Cell, 2007)。
[0005]目前对水稻育性控制锌指蛋白基因(Oryza sativa Sterile-relatedZinc-finger Protein,缩写为OsSZP)及其同源锌指蛋白亚家族基因的功能还未有报道,对OsSZP在水稻育性形成中的作用的研究，可以开拓新的水稻不育基因资源，为作物杂种优势利用和新品种分子设计提供理论基础。
【发明内容】
[0006]本发明要解决的技术问题是提供一种水稻育性控制锌指蛋白基因。
[0007]为了解决上述技术问题，本发明是通过以下的技术方案实现的:
[0008]第一方面，本发明涉及一种水稻育性控制锌指蛋白基因(Oryza sativaSterile-related Zinc-finger Protein,缩写为 OsSZP),其核苷酸序列如序列表中 SEQ IDNO:1所示。
[0009]第二方面，本发明涉及上述水稻育性控制锌指蛋白基因编码的蛋白，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。
[0010]第三方面，本发明涉及上述水稻育性控制锌指蛋白基因的RNA干涉真核重组质粒，由以下步骤制备得到:
[0011](I)在序列表中SEQ ID NO:1所示核苷酸序列中选择一段基因片段，所选择的基因片段是SEQ ID NO:1所述第1317bp至1743bp的核苷酸序列，将所述基因片段正向插入到pSK载体上，再将该基因片段反向插入已含正向插入基因片段的pSK载体，获得pSK中间载体，正向插入的基因片段与反向插入的基因片段之间存在有150bp的内含子序列；
[0012](2)利用限制性内切酶切下pSK中间载体上含有正向插入与反向插入的基因片段的部分，然后连接到真核表达载体上，即获真核重组质粒。
[0013]第四方面，本发明涉及上述水稻育性控制锌指蛋白基因在水稻育性遗传育种中的应用。
[0014]第五方面，本发明涉及上述水稻育性控制锌指蛋白基因的RNA干涉真核重组质粒在培育水稻不育系方面的应用。
[0015]本发明的有益效果是:`[0016]为水稻等单子叶禾本科作物的生殖发育调控和遗传育种提供了一种新的基因资源。所用基因为水稻本身自有基因，所以转基因水稻的安全性能高。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明。
[0018]图1 是水稻育性控制锋指蛋白基因 Oryza sativa Sterile-related Zinc-fingerProtein (下称OsSZP)在野生型水稻品种日本晴幼苗、田间生长成熟植株各组织以及不同光、温生长条件下的表达情况。A:从左至右依次为=OsSZP在野生型水稻幼苗根、茎、叶中表达水平；B:从左至右依次为=OsSZP在野生型田间生长成熟水稻植株根、茎、叶、颖花中表达水平；C:野生型水稻植株在正常生长条件(28°C，12h光/12h暗)、低温(4°C，12h光/12h暗)、高温(42°C，12h光/12h暗)，以及高温暗培养条件下(42°C，24h暗)处理48h后的OsSZP基因表达水平。ACTIN为内参基因。
[0019]图2是水稻OsSZP基因RNA干涉转基因植株表型。A =OsSZP基因RNA干涉真核重组质粒(pHB-SZPRI)的示意图。B:转基因水稻植株中筛选标记潮霉素抗性基因(Hpt)PCR扩增结果。图中，M =DNA分子标记，DL2000 ；I:阴性对照，PCR模板为野生型植株基因组DNA ；2:阳性对照，PCR模板为重组质粒pHB-SZPRI ;3_5 =PCR模板为3个独立RNA干涉转基因植株R1-l、R1-2、R1-3的基因组DNA。C:RNA干涉转基因水稻株系实时定量PCR检测结果。从左至右依次为:野生型(WT)、3个RNA干涉转基因株系(R1-1~R1-3)中OsSZP基因的表达水平；D:野生型(WT)、RNA干涉转基因水稻株系(R1-1~Ri_3)秕谷率。
[0020]图3是水稻OsSZP过表达转基因植株表型。A:野生型(WT)、过表达水稻株系(0X-1~0X-3)中OsSZP基因表达水平定量检测结果；B:野生型(WT)、过表达抑制水稻株系(CS-1~CS-3)中OsSZP基因表达水平。
【具体实施方式】
[0021]下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook Russell的分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
[0022]实施例1:水稻OsSZP基因的克隆
[0023]1、试剂
[0024]RNA 提取试剂 Trizol 购于 Invitrogen 公司；反转录酶 ReverTraAce 购于 Toyobo公司；高保真DNA聚合酶PrimeStar购于TaKaRa公司；克隆载体pEASY?_Blunt SimpleCloning Vector购于北京全式金生物技术有限公司；引物由上海英骏生物技术有限公司合成，其余试剂均为进口分装或国产分析纯产品。
[0025]2、大肠杆菌菌株和植物材料
[0026]大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5a购于北京全式金生物技术有限公司；水稻粳稻品种日本晴(Oryza sative L.ssp.japonica cv.Nipponbare)种子由四川省农业科学院繁育提供。 [0027]3、培养基和溶液
[0028]LB培养基:胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L。用NaOH调pH至7.0，高压灭菌。[0029]SOB 培养基:胰蛋白胨 20g/L，酵母粉 5g/L，NaCl0.58g/L，KCl 0.19g/L，IOOXMg2+IOmLo 用 NaOH 调 pH 至 7.0，高压灭菌。
[0030]SOC培养基:S0B+20%葡萄糖。
[0031 ] 100 X Mg2+ 溶液:20.33g MgCl2.6H20 和 24.65g MgSO4.7H20 定容于 IOOmL H2O,高压灭菌。
[0032]20%葡萄糖溶液:20g葡萄糖定容于IOOmL H2O,过滤除菌。 [0033]4、方法
[0034]4.1水稻叶片RNA提取
[0035]I)取新鲜水稻叶片，加入液氮研磨成粉状，迅速转移100-200mg粉末于不含RNase的1.5mL Ep管中，即刻加入ImL Trizol提取液混匀,振荡IOs,室温下放置5min ；
[0036]2)加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15s，室温下放置2_3min ；
[0037]3)4。。，12000g离心15min,吸取上清约600 μ L至新EP管中，加入0.6mL异丙醇，室温下放置IOmin ；
[0038]4) 4°C,12000g离心lOmin，弃上清，沉淀用70 %乙醇冲洗两次，4°C，7500g离心5min ；
[0039]5)倒掉乙醇，常温干燥RNA沉淀lOmin，溶于50 μ L RNase-free ddH20中，保存于-80°C中备用。
[0040]4.2RT-PCR
[0041]4.2.1RT
[0042]I)取 I μ g 总 RNA 与 I μ L PolyT18(10 μ Μ)引物混合,用 RNase-free ddH20 补足到
12.75 μ L，轻轻混匀；
[0043]2) 65°C保温5min，立即转移至冰浴中，放置2min ；
[0044]3)加入 5X 反应缓冲液 4 μ L，IOmM dNTP2 μ L，RNA 抑制剂 0.25 μ L(40U/μ L)，ReverTra Ace 反转录酶 I μ L (100U/ μ L), 42°C lh,合成第一链 cDNA ；
[0045]4) 95°C加热5min,失活反转录酶,终止反应。
[0046]4.2.2PCR
[0047]水稻OsSZP基因的克隆。将200 μ L EP管放置于冰上，加入试剂:
[0048]
PrimeStar0.5 μ L
5 XPrimeStar Buffer10 μ L
dNTP Mixture (各 2.5 mi )4 pL
[0049]
【权利要求】
1.水稻育性控制锌指蛋白基因，其特征在于:其核苷酸序列如序列表中SEQID N0:1所示。
2.如权利要求1所述水稻育性控制锌指蛋白基因编码的蛋白，其特征在于:其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。
3.如权利要求1所述水稻育性控制锌指蛋白基因的RNA干涉真核重组质粒，其特征在于，由以下步骤制备得到: (1)在序列表中SEQID NO:1所示核苷酸序列中选择一段基因片段，所选择的基因片段是SEQ ID N0:l所述第1317bp至 1743bp的核苷酸序列，将所述基因片段正向插入到pSK载体上，再将该基因片段反向插入已含正向插入基因片段的PSK载体，获得pSK中间载体，正向插入的基因片段与反向插入的基因片段之间存在有150bp的内含子序列； (2)利用限制性内切酶切下pSK中间载体上含有正向插入与反向插入的基因片段的部分，然后连接到真核表达载体上，即获真核重组质粒。
4.如权利要求1水稻育性控制锌指蛋白基因在水稻育性遗传育种中的应用。
5.如权利要求3水稻育性控制锌指蛋白基因的RNA干涉真核重组质粒在培育水稻不育系方面的应 用。
【文档编号】C07K14/415GK103725692SQ201310651753
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2013年12月6日 优先权日:2013年12月6日
【发明者】牛向丽, 石玮, 刘永胜, 毛云, 吴海云 申请人:合肥工业大学