专利名称：控制水稻花粉育性的基因及其使用方法
技术领域：
本发明涉及控制水稻花粉育性的基因，水稻低分子量GTP结合蛋白基因osRACD；以及通过反义mRNA表达法阻断水稻中控制水稻花粉育性的基因的正常表达，改变水稻育性的方法；和通过抑制控制水稻花粉育性的基因编码的蛋白质在水稻中的活性，改变水稻育性的方法。
水稻是最重要的粮食作物之一，全世界年产量已高达50000万吨，全球约一半以上的人口以水稻作为主要的食品来源，因此提高水稻的产量、改良稻米的品质，是世界各国水稻育种学家迫切解决的首要问题。我国是世界上水稻种植历史最为悠久，产量最多的国家之一，存在着丰富的水稻种质资源，为水稻的育种栽培研究提供了良好的物质基础。光敏核不育水稻农垦58S就是由我国科学家首先发现的一种重要的水稻资源。它具有由细胞核基因决定的，在长日照高积温的环境条件下导致水稻花粉雄性不育，在短日照低积温的环境条件下，恢复水稻花粉雄性可育的光周期育性转换遗传特性。因此光敏核不育水稻农垦58S可以一系两用，在不育期可用作母本进行杂交育种，在可育期可以通过自交繁殖不育系种子，即它既能充当不育系也能充当保持系，因此为按“两系法”育种利用水稻杂交优势提供了可能性(李泽炳，1995)。在农垦58S的基础上，通过“两系法”杂交育种，已先后繁育出了N5074S、77001S等一批具有生产应用价值的优良品系。这些两系法杂交水稻同传统的三系法杂交水稻相比，不仅明显缩短了育种周期，提高了土地的利用面积，同时比同熟期三系杂交稻要增产10％左右，而且米质也有明显的提高(童哲，1998)。
为了进一步探索光敏核不育水稻农垦58S的光周期育性转换遗传特性的分子本质，拓广“两系法”杂交水稻的育种范围，近20年来，我国科学家对光敏核不育水稻农垦58S开展了生理学、细胞学和遗传学等多方面深入的研究，并取得了丰硕的研究结果。植物生理学研究表明，光敏核不育水稻农垦58S感受光周期的器官是叶片，产生光周期应答的效应器主要是幼穗中的花药。育性转换敏感期在小孢子尚未发生的枝梗原基分化期(第II期)到花粉母细胞形成期(第V期)。光敏色素和隐花色素很可能是光敏核不育水稻感受光周期应答产生育性转换特性的光受体。遗传学研究表明，光敏核不育水稻农垦58S的花粉育性在一定温度范围内受光周期诱导。控制光周期育性转换的主效基因为一对或两对隐性核基因。遗传学作图定位分析显示光敏核不育主效基因很可能位于第3、5、7、11、12染色体上(李泽炳，1995；童哲，1998；贺超兴，1999；张锐，1999；李子银，1999；梅明华，1999)。
尽管对光敏核不育水稻农垦58S的生物学研究取得了如上所述丰硕的结果，但是对于光敏核不育水稻农垦58S光周期育性转换的分子机理目前仍知之甚少，光敏核不育基因至今还尚未克隆。这些基础性研究的滞后已严重阻碍了光敏核不育水稻的进一步应用，以及在其它农作物材料间的推广。因此加快对光敏核不育基因的克隆，加深对光敏核不育水稻光周期育性转换分子机理的了解，是摆在我国水稻育种学家面前急需解决的重要课题。
我们认为光敏核不育水稻农垦58S光周期育性转换特性，并不仅仅是由单基因决定的遗传学性状问题，它既涉及到水稻植株对环境光温等因素作用的反应，又涉及到植物体自身的发育状态。因此不能简单地仅从遗传学角度考察光敏核不育现象，还应从光温效应，光信号传导以及特异转录因子等诸多方面，特别是基因表达的发育调控方面综合考虑。正确地选用有效的技术手段，是关系到能否分离到水稻光敏核不育基因的一个重要条件。植物光温的育性效应，本质上是由于基因表达的发育调控与差异表达造成的。因此比较不同类型的细胞或不同发育状态细胞之间基因表达的差别，即mRNA种的差别，为分离水稻光敏核不育基因打开了方便之门。
基于上述观点，本研究采用mRNA差别显示的方法，比较经不同光周期处理的光敏核不育水稻农垦58S光周期育性转换敏感期幼穗基因表达活性的差异，克隆参与控制光敏核不育水稻农垦58S光周期育性转换性状的相关基因。以期为深入了解光敏核不育水稻光周期育性转换分子机理，为最终克隆并分离水稻光敏核不育基因奠定良好的前期工作基础。
本发明的一个目的是提供控制水稻花粉育性的基因。
本发明的再一个目的是提供一种由本发明的控制水稻花粉育性的基因编码的蛋白质。
本发明的又一个目的是提供一种通过反义mRNA表达法阻断水稻中控制水稻花粉育性的基因的正常表达，改变水稻育性的方法。
本发明的又一个目的是提供一种通过抑制控制水稻花粉育性的基因编码的蛋白质在水稻中的活性，改变水稻育性的方法。
本发明提供了一种控制水稻花粉育性的基因，该基因的cDNA全长850bp，从112bp至705bp含有一个长度为594bp的开放阅读框，编码197个氨基酸和一个终止密码子。osRACD中存在的594bp开放阅读框编码着水稻低分子量GTP结合蛋白基因的全长cDNA序列，是首次分离并克隆的一种水稻低分子量GTP结合蛋白基因，命名为osRACD，其编码的蛋白质产物命名为osRACDP，其核苷酸序列为AGCAAGCAGC AGCTGAGGTG AGGTCCGTGG CGTTGGAGTG AGGACTGAGG AGGAAGAAGA 60GGGCGGGATC TAGGGTACCG GATGCGCTGG CTGTGCTGAG TGAGAGTAGA GATGAGCGCG120TCTCGGTTCA TCAAGTGCGT CACCGTGGGG GACGGCGCCG TGGGCAAGAC CTGCATGCTC180ATCTCCTACA CCTCCAACAC CTTCCCCACG GACTATGTTC CAACTGTTTT TGATAACTTC240AGTGCAAATG TTGTGGTCGA TGGGAGCACT GTGAACTTGG GGTTGTGGGA TACAGCAGGA300CAAGAGGACT ACAATAGGCT ACGCCCGTTG AGCTATCGTG GCGCTGATGT TTTCCTGCTG360GCCTTTTCTC TGATCAGCAA AGCAAGCTAT GAGAATGTTT CTAAAAAGTG GATACCTGAA420TTAAGGCATT ATGCTCCTGG TGTGCCAATA ATTCTCGTTG GAACAAAGCT TGATCTGCGG480GATGATAAGC AATTTTTCGT AGATCACCCT GGTGCTGTAC CTATTTCCAC TGCTCAGGGC540GAAGAGCTGA GGAAACTCAT TGGTGCAGCG GCATACATTG AATGCAGTTC AAAAACACAG600CAAAACATCA AGGCAGTTTT CGATGCTGCG ATTAAGGTGG TTCTCCAGCC TCCAAAGCAA660AAGAAGAAGA AGAAAAAGGC GCAGAAAGGA TGTGCCATCT TGTAATTAAA TGGTAGACAG720TGCAGTGCAG ATCGATGTAT CCCTTCATTT GTAGCCTCTG GCTTCAATCG TCGCTTGTTT780GTATAATTAC GCTAGATGCC ACCGGCAGAA GATATAATAT AGTCCTCCTG CCTTTGTGGT840GTTGGTCTCT 850
本发明还提供了一种由本发明的控制水稻花粉育性的基因编码的蛋白质。这种低分子量GTP结合蛋白包含有GTP结合结构域、GTPase酶活性结构域和Mg2+离子结合效应区三个典型的结构域。水稻低分子量GTP结合蛋白osRACDP具有与已报道的Rac亚类低分子量GTP结合蛋白完全一致的保守结构域。在由水稻osRACD基因开放阅读框推导的氨基酸序列中，第118位至第121位编码氨基酸和第157位至第161位编码氨基酸组成GTP结合结构域；第13位至第20位编码氨基酸和第59位至第64位编码氨基酸组成GTPase酶活性结构域；第37位至第43位编码氨基酸形成Mg2+离子结合效应区，其氨基酸序列如下所示 VVVDGSTVNLGLWDTAGQEDYNRLRPLSYRGADVFLLAFSLISKASY KKKKAQKGCAIL*osRACD基因编码蛋白质的结构域分析划线处为GTPase酶活性结构域；边框处为Mg2+离子结合效应区；划线边框处为GTP结合结构域本发明还提供了一种通过反义mRNA表达法阻断水稻中控制水稻花粉育性的基因的正常表达，改变水稻育性的方法，该方法包括a.反向选取水稻osRACD基因中连续长度在200bp至基因全长的任意区段序列，将其与花粉组织特异型启动子(如LAT52启动子)和真核生物表达载体(如WM101)连接构建重组反义表达质粒；b.利用农杆菌侵染转化的方法转化水稻，获得转基因表达植株，其花粉具有天然败育的特性。
通过该方法获得的转基因植株为水稻杂交育种提供了简便快速的手段。
本发明还提供了一种通过抑制控制水稻花粉育性的基因编码的蛋白质在水稻中的活性，改变水稻育性的方法，该方法包括
a.在原核生物表达系统(如PET-BL21系统)中，表达osRACD蛋白质，并利用，例如，亲和层析的方法纯化osRACD蛋白质；b.将纯化的osRACD蛋白质免疫家兔获得其单克隆抗体；c.对该抗体进行蛋白质序列测定，人工合成该抗体的编码基因核苷酸序列；d.将该合成序列与含有花粉组织特异性表达启动子(如LAT52启动子)的真核生物表达载体(如WM101)连接构建重组表达质粒；e.通过农杆菌转化方法，转化水稻愈伤组织，获得转基因花粉败育的水稻。
通过该方法获得的转基因水稻在花粉形成期可特异性地表达osRACD蛋白质的抗体，阻断osRACD蛋白质在水稻中的生物学功能，导致转基因水稻花粉的败育，利用植物组织培养的方法可以扩增繁殖这种转基因水稻，迅速进行商品化推广。
作物育种的关键是雄性不育植株的获得，现在水稻常规的制种方法是三系法和两系法，从实际应用来看，这两种方法都存在着制种周期长、受天气变化影响等不足之处。转反义osRACD基因水稻植株的获得，从根本上克服了上述问题，为水稻制种提供了一种新的简便快速的制种手段。
以RDP-8为探针对农垦58N-LD雌雄蕊形成期幼穗cDNA文库进行筛选，获得一阳性杂交噬菌斑，DNA序列测定结果表明该噬菌斑所携带的重组噬菌体含有长度为850bp的cDNA插入片段，其中包含594bp的开放阅读框，编码197个氨基酸和一个终止密码子。通过国际互联网络在GenBank/EMBL/DDBJ数据库中分别进行核苷酸、氨基酸同源性比较分析，结果均未发现与该cDNA插入片段序列相同的或已发表的水稻基因序列，据此推断该cDNA插入片段中存在的594bp开放阅读框编码着水稻低分子量GTP结合蛋白基因的全长cDNA序列，是首次分离并克隆的一种水稻低分子量GTP结合蛋白基因，命名为osRACD。osRACD基因在GenBank中的注册序号为AF218381。2.osRACD基因与光敏核不育水稻农垦58S光周期育性转换性状相关的实验证据(1)mRNA差别显示分析表明水稻osRACD基因的表达与光周期育性转换之间存在着相关性通过对不同批次种植的农垦58S-LD，农垦58S-SD和农垦58N-LD三种材料的雌雄蕊形成期(第IV期)幼穗进行的mRNA差别显示分析，结果均表明osRACD基因在可育材料农垦58S-SD和农垦58N-LD中发生特异扩增，在不育材料农垦58S-LD中极低水平扩增，这说明水稻osRACD基因的表达与光周期育性转换之间存在着相关性。(2)水稻osRACD基因与光周期育性转换性状相关性的RT-PCR检测为了验证水稻osRACD基因表达与光敏核不育水稻农垦58S光周期育性转换的相关性，利用RT-PCR检测的方法对水稻osRACD基因表达特性进行了分析。首先按照异硫氰酸胍-酸酚法分别提取农垦58S-SD，农垦58S-LD和农垦58N-LD雌雄蕊形成期幼穗的总RNA，经RNA甲醛变性琼脂糖凝胶电泳确认RNA完整性后，利用适量DNaseI消除残留的微量基因组DNA，使用Oligo(dT)12-18，分别对三种材料的总RNA样品进行反转录。根据组成型表达的水稻泛素基因RUBQ2(GenBank注册序号为AF184280)设计水稻泛素基因5′-末端特异引物和3′-末端特异引物，分别对三种材料的总RNA反转录产物进行水稻泛素基因RT-PCR扩增，扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离。用Bio-RAD公司Gel-Doc 2000凝胶电泳自动成像分析仪对三种材料的水稻泛素基因RUBQ2的RT-PCR产物定量比较，以此为基础调整三种材料总RNA反转录产物的浓度，使它们保持一致根据水稻osRACD基因的5’UTR和3’UTR核苷酸序列，设计合成水稻osRACD基因5’UTR和3’UTR特异引物对，分别对三种材料总RNA的反转录产物进行RT-PCR扩增，扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离，结果显示在可育材料农垦58S-SD和农垦58N-LD样品中出现扩增条带，而在不育材料农垦58S-LD中未观察到扩增条带。将1％琼脂糖凝胶电泳分离后的RT-PCR扩增产物原位转移到NC膜上，利用同位素α-32P-dATP标记的osRACD探针进行Southern杂交分析。杂交结果表明在可育材料农垦58S-SD和农垦58N-LD样品中出现阳性杂交信号，在不育材料农垦58S-LD中未出现阳性杂交信号。说明RT-PCR扩增产物为osRACD基因。该基因在可育材料的雌雄蕊形成期幼穗中表达，在相同发育时期的不育材料幼穗中不能检测到其表达水平，反映出osRACD基因表达与育性转换性状密切相关。(3)水稻osRACD基因mRNA表达组织特异性的检测分别提取光敏核不育水稻农垦58S-SD雌雄蕊形成期幼穗、根、茎、叶的总RNA，经甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，并且利用Gel-Doc200凝胶自动成像分析仪以25S rRNA亮度为标准，对四种材料提取的总RNA量进行比较，调整它们浓度一致后，使用Oligo(dT)12-18分别进行总RNA样品的反转录。以水稻osRACD基因的5’UTR和3’UTR特异引物对进行RT-PCR扩增，扩增产物经含EB的1％琼脂糖凝胶电泳分离。电泳结果显示，在对照材料农垦58S-SD雌雄蕊形成期幼穗的样品中扩增出单一的电泳条带，将琼脂糖凝胶原位转移到NC膜上，利用α-32P-dATP标记的osRACD基因为探针进行Southern杂交分析，杂交结果显示，只在雌雄蕊形成期幼穗样品中呈现阳性杂交条带。上述结果表明，osRACD基因在光敏核不育水稻农垦58S-SD的雌雄蕊形成期幼穗、根、茎、叶四种样品中，具有仅在雌雄蕊形成期(第IV期)幼穗中特异表达的特性。而在叶片、茎、根中均无表达信号。这表明osRACD基因的表达与光敏核不育水稻幼穗的光周期育性转换性状密切相关。(4)osRACD基因体外表达蛋白质产物活性检测通过将osRACD基因与PET22表达载体相连接构建重组表达质粒，在原核生物表达系统(如BL21)中，表达并纯化osRACD基因的蛋白质产物，检测结果表明osRACD基因的蛋白质产物具有与GTP特异结合和GTP水解酶的活性。这说明osRACD基因是编码低分子量GTP结合蛋白的基因。(5)osRACD基因转基因表达功能鉴定将osRACD基因的反向200bp与真核生物表达载体(如WM101)连接构建重组表达质粒，在拟南芥中反义表达osRACD基因，结果导致拟南芥花粉的不育。在花粉败育的水稻中正义表达osRACD基因，结果导致花粉可育。
以上5个方面的实验结果以比较充分的事实表明，我们从光敏核不育水稻幼穗中分离的osRACD基因，与光周期育性转换性状之间，确实存在着密切的相关性。3.水稻osRACD基因转基因植株的获得方法将花粉组织特异型启动子LAT52与水稻反义osRACD基因(片段长度在200bp以上的任意区段)相融合，并克隆到真核生物表达载体WM101，构建成重组反义表达质粒，利用农杆菌侵染转化的方法转化水稻愈伤组织，培养转化后的愈伤组织，获得转基因表达植株，其花粉具有天然败育的特性，该转基因植株的获得为水稻杂交育种提供了简便快速的手段。4.水稻osRACD蛋白质的生物学应用在原核生物表达系统PET-BL21中，表达并纯化osRACD蛋白质，通过免疫家兔获得其单克隆抗体。对该抗体进行蛋白质序列测定，人工合成该抗体的编码基因核苷酸序列，将该合成序列与含有花粉组织特异性表达启动子LAT52启动子的真核生物表达载体WM101连接构建重组表达质粒，通过农杆菌转化方法，转化水稻愈伤组织，获得转基因水稻。该转基因水稻在花粉形成期可特异性地表达osRACD蛋白质的抗体，阻断osRACD蛋白质在水稻中的生物学功能，导致转基因水稻花粉的败育。
权利要求
1.一种控制水稻花粉育性的蛋白质，其氨基酸序列如下MSASRFIKCVTVGDGAVGKTCMLISYTSNTFPTDYVPTVFDNFSANVVVDGSTVNLGLWDTAGQEDYNRLRPLSYRGADVFLLAFSLISKASYENVSKKWIPELRHYAPGVPIILVGTKLDLRDDKQFFVDHPGAVPISTAQGEELRKLIGAAAYIECSSKTQQNIKAVFDAAIKVVLQPPKQKKKKKKAQKGCAIL*
2.一种编码权利要求1所述的蛋白质的基因。
3.按照权利要求2所述的基因，它具有如下所示的核苷酸序列AGCAAGCAGC AGCTGAGGTG AGGTCCGTGG CGTTGGAGTG AGGACTGAGG AGGAAGAAGA 60GGGCGGGATC TAGGGTACCG GATGCGCTGG CTGTGCTGAG TGAGAGTAGA GATGAGCGCG120TCTCGGTTCA TCAAGTGCGT CACCGTGGGG GACGGCGCCG TGGGCAAGAC CTGCATGCTC180ATCTCCTACA CCTCCAACAC CTTCCCCACG GACTATGTTC CAACTGTTTT TGATAACTTC240AGTGCAAATG TTGTGGTCGA TGGGAGCACT GTGAACTTGG GGTTGTGGGA TACAGCAGGA300CAAGAGGACT ACAATAGGCT ACGCCCGTTG AGCTATCGTG GCGCTGATGT TTTCCTGCTG360GCCTTTTCTC TGATCAGCAA AGCAAGCTAT GAGAATGTTT CTAAAAAGTG GATACCTGAA420TTAAGGCATT ATGCTCCTGG TGTGCCAATA ATTCTCGTTG GAACAAAGCT TGATCTGCGG480GATGATAAGC AATTTTTCGT AGATCACCCT GGTGCTGTAC CTATTTCCAC TGCTCAGGGC540GAAGAGCTGA GGAAACTCAT TGGTGCAGCG GCATACATTG AATGCAGTTC AAAAACACAG600CAAAACATCA AGGCAGTTTT CGATGCTGCG ATTAAGGTGG TTCTCCAGCC TCCAAAGCAA660AAGAAGAAGA AGAAAAAGGC GCAGAAAGGA TGTGCCATCT TGTAATTAAA TGGTAGACAG720TGCAGTGCAG ATCGATGTAT CCCTTCATTT GTAGCCTCTG GCTTCAATCG TCGCTTGTTT780GTATAATTAC GCTAGATGCC ACCGGCAGAA GATATAATAT AGTCCTCCTG CCTTTGTGGT840GTTGGTCTCT 850
4.一种通过反义mRNA表达法阻断水稻中控制水稻花粉育性的基因的正常表达，改变水稻育性的方法，该方法包括a.反向选取权利要求2或3中所述的水稻osRACD基因中连续长度在200bp至基因全长的任意区段序列，将其与花粉组织特异型启动子和真核生物表达载体连接构建重组反义表达质粒；b.利用农杆菌侵染转化的方法转化水稻愈伤组织，培养转化后的愈伤组织，获得转基因表达植株，其花粉具有天然败育的特性。
5.一种通过抑制控制水稻花粉育性的基因编码的蛋白质在水稻中的活性，改变水稻育性的方法，该方法包括a.在原核生物表达系统中表达权利要求1中所述的osRACD蛋白质，并纯化该osRACD蛋白质；b.将纯化的osRACD蛋白质对一种动物免疫获得其单克隆抗体；c.对该抗体进行蛋白质序列测定，人工合成该抗体的编码基因核苷酸序列；d.将该合成序列与含有花粉组织特异性表达启动子的真核生物表达载体连接构建重组表达质粒；e.通过农杆菌转化方法，转化水稻愈伤组织，培养转化后的愈伤组织，获得转基因花粉败育的水稻。
全文摘要
本发明提供了一种控制水稻花粉育性的蛋白质;一种编码所述蛋白质的基因;一种通过反义mRNA表达法阻断水稻中控制水稻花粉育性的基因的正常表达改变水稻育性的方法;以及一种通过抑制控制水稻花粉育性的基因编码的蛋白质在水稻中的活性,改变水稻育性的方法。本发明的蛋白质,基因和方法为水稻制种提供了一种新的简便快速的手段。
文档编号A01H1/00GK1348962SQ0013014
公开日2002年5月15日 申请日期2000年10月17日 优先权日2000年10月17日
发明者米志勇, 吴乃虎 申请人:中国科学院发育生物学研究所