一种紫花苜蓿对羟基苯丙酮酸双加氧酶基因及应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及分子生物学领域，特别是设及一种紫花首猜对径基苯丙酬酸双加氧酶 基因 MsHPPD及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 维生素 E是一种脂溶性的维生素，天然产物依疏水性尾端的饱和度和芳香环上甲 基数目和位置的不同分为八种类型，分别是3、β、丫、σ-生育酪和3、β、丫、σ-生育Ξ締酪，其 中a-生育酪的生物活性最高。
[0003] 维生素 E是人体必需的微量营养物质，而人体不能自身合成，只能通过饮食摄入。 研究表明维生素 E可W提高动物体的免疫力。相关研究表明，补饲维生素 E的家畜其肉质要 优于正常饲养的家畜。而且可W提高肉和奶的质量，延长保鲜期。维生素 E具有抗氧化作用。 维生素 E的主要作用是清除活性氧，保护多不饱和脂肪酸不被氧化。对于动植物都有重要作 用。此外，维生素 E还在植物的抗逆性调控中发挥作用。
[0004] 紫花首猜是重要豆科牧草，也是全国乃至世界上种植最多的牧草品种.由于其适 应性广、产量高、品质好等优点，素有"牧草之王"之美誉。随着我国畜牧业的发展，对牧草品 质的要求也不断提高。维生素 E能够提高动物肉质的保鲜程度，延长上架时间，提高动物的 生育能力，还具有抗氧化、抗逆的作用，在牧草品质改良方面具有很好的利用价值。但紫花 首猜属于异花授粉的四倍体豆科牧草，其遗传转化困难，生长周期长，基因功能的研究比较 滞后，到目前为止，对紫花首猜维生素 E合成相关基因的研究还处于空白。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种紫花首猜对径基苯丙酬酸双加氧酶基因 MsHPPD,本发明 为进一步研究紫花首猜MsHPPD基因的功能，W及MsHPPD基因改良牧草品质，特别是分子改 良牧草维生素 E含量的应用奠定基础。
[0006] 本发明的另一目的是提供一种紫花首猜对径基苯丙酬酸双加氧酶基因的制备方 法。
[0007] 本发明的另一目的是提供一种上述紫花首猜对径基苯丙酬酸双加氧酶基因在提 高拟南芥中的维生素 E含量和抗逆性调控中的应用。
[000引本发明所采用的第一技术方案是，一种紫花首猜对径基苯丙酬酸双加氧酶基因， 其核巧酸序列如序列表中SEQ ID NO: 1所示。
[0009] 本发明所采用的第二技术方案是，一种紫花首猜对径基苯丙酬酸双加氧酶基因的 制备方法，具体按照W下步骤实施：
[0010] 步骤1、采用化izol试剂法提取紫花首猜总RNA;
[00川步骤2、对步骤1中提取的紫花首猜总RNA进行RACE克隆cDNA全长，并对PCR进行胶 回收;所述RACE引物包括GSP1和GSP2，其中，GSP1的序列如序列表中SEQ ID NO: 4所示，具体 为：5 ' -ATGGCACCGTTGTTTACGCTGGTGGTG-3 ' ； GSP2的序列如序列表中 SEQID NO: 5所示，具体 为：5 '-GACGCCGAACTGGCTTTCACCACC-3 '。
[001。步骤3、构建PCR产物的重组质粒，并转化大肠杆菌畑5α感受态细胞，得到菌液；
[0013] 步骤4、对得到的菌液进行PCR检测，挑选阳性菌液，送Invitrogen公司进行测序， 将测序结果进行拼接，得到紫花首猜对径基苯丙酬酸双加氧酶基因 cDNA全长序列，紫花首 猜对径基苯丙酬酸双加氧酶基因的核巧酸序列如序列表中SEQ ID NO: 1所示。
[0014] 本发明所采用的第Ξ技术方案是，一种上述的紫花首猜对径基苯丙酬酸双加氧酶 基因在提高拟南芥维生素 E含量和抗逆性调控中的应用。
[0015] 本发明的有益效果是:本发明基于对紫花首猜中品质形成的生物学机制的研究， 一方面提供了紫花首猜MsHPPD基因及该基因编码的蛋白，另一方面还提供了含有所述首猜 MsHPPD基因的表达载体和细胞，W及培育维生素 E含量提高的拟南芥的方法，还提供了它们 的应用。
[0016] 本发明对了解HPPD基因在牧草品质和抗逆性调控中的作用，对牧草品质分子改良 具有非常重要的意义。本发明提供的紫花首猜MsHPPD基因在拟南芥中的增强表达可W显著 提高拟南芥维生素 E的含量。本发明的重要应用前景在于:该基因的发现为提高主要牧草植 物(特别是豆科植物，如紫花首猜）中维生素 E提供了基因资源，在基因工程改良牧草的研究 中，特别是品质改良的转基因新种质创制中发挥重要作用。
[0017] 下面结合附图对本发明作进一步说明。
【附图说明】
[0018] 图1是对紫花首猜植株进行农杆菌介导的MsHPPD基因同源转化所用的插入有 MsHPPD基因的PPBI121载体的结构图；
[0019] 图2是转MsHPPD基因的拟南芥株系化1，L2，L3)与空载体对照株系（CK)中维生素 E 含量的比较分析结果图。
[0020] 图3为本发明实施例4中辅氨酸含量测定的结果图；
[0021 ]图4为本发明实施例4中过氧化物酶(POD)活性测定的结果图。
【具体实施方式】
[0022] 实施例1紫花首猜对径基苯丙酬酸双加氧酶基因 MsHPPD的制备
[0023] 本发明提供的紫花首猜MsHPPD基因是通过W下方法筛选得到的：
[0024] 通过BLAST对比分析，根据截形首猜中已经克隆的对径基苯丙酬酸双加氧酶基因 (Genbank登记号为：XM_003617343 )保守域设计引物（RT-PCR引物为：F: 5 此八(：1'1'1'(：1'此6〔41'此4(：1'了61'1'1'(：-3'，其核巧酸序列如序列表中569 10^:2所示；1?:5'-CCTCAATGTCCTAAATATATCCTCAG-3'，其核巧酸序列如序列表中沈Q ID ^:3所示）。从紫花首 猜(Medicago sativa L.cv.Zhongmu No.l，中首一号，北京中畜东方草业科技有限责任公 司）中进行扩增，回收预期大小为6(K)bp的片段(跑电泳后回收此长度的片段），将回收的片 段连入PMD18-T Vector(化kara)，测序结果在NCBI的非冗余蛋白数据库中进行BLASTx分 析，获得了 一段与已公布的近源物种册PD基因高度同源的cDNA序列。利用SMARTer? race cDNA Amplification Kit(Clontech，USA)分别对该序列进行5'RACE和3'RACE克隆，最后获 得了该基因全长序列（核巧酸序列如序列表中SEQ ID N0:1所示）。其中，基因克隆的方法为 分子生物学领域的常规实验操作，具体方法如下：
[0025] 1、紫花首猜总RNA的提取：
[0026] 紫花首猜总RNA的提取采用Trizol试剂法，具体步骤如下：
[0027] (1)将0.3g左右紫花首猜组织材料加入大约3000μ1化izol试剂，加入液氮快速磨 碎，放在无菌环境中直至变为匀浆。
[00%] (2)用移液枪吸取大约ImL匀浆到1.5mL Eppendorf离屯、管中，剧烈振荡混匀，于室 溫放置 5min，4°C，13，000巧m 离屯、1 Omin。
[00巧](3)取上清，加入200化氯仿，剧烈振荡，室溫放置2-3111111，4。0，13,000巧111离屯、 15min。
[0030] (4)溶液从下到上依次分为Ξ层：有机相、蛋白质、无色水相；取上层移入新 Eppendorf离屯、管，加等体积氯仿，重复第3步。
[0031] (5)取其上清加入等体积异丙醇，混合混匀，室溫放置lOmin左右，4°C，13，00化pm 离屯、1 Omin，得到白色RNA沉淀。
[0032] (6)弃上清，加 ΙΟΟΟμΙ 75% 乙醇（用DEPC(diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙 醋)水配制），将沉淀冲起，于4°C，13000巧m离屯、lOmin，倒掉乙醇，留下沉淀。
[0033] (7)重复第6步，在无菌环境下惊干。加 20~50μ1无菌DEPC水溶解。
[0034] 进行RNA电泳，检测RNA提取质量，IMPLEN微量核酸蛋白分析仪测定RNA浓度。
[0035] 2、34〔6克隆基因〇0臟全长
[0036] RACE-ready cDNA的合成
[0037] (1)准备缓冲液：2.0μ1 5X 第一链缓冲液（First-S 化 and Buffer)，1.0yl DTT (20πιΜ)，1.0μ1 dNTP Mix(lOmM);
[003引 （2)制备用于5'^〔6的。0臟反应液：2.7扣13酷，1.0415'-〔08?'山6'4，制备用 于3'34〔6的。0臟反应液：3.7化11?酷，1.0413'-〔08口'山6'八；
[0039] (3)将步骤(2)中制备好的液体混匀，短暂离屯、，72°C解育3分钟，再于42°C冷却2分 钟，短暂离屯、收集反应液液体；
[0040] (4)向5'RACE的cDNA反应液中加入化1的SMARTer IIA oligo,短暂离屯、收集液体； [0041 ] (5)制备5'RACE和3'RACE-Ready cDNA反应液(Master Μ?χ):4.0μ1 步骤（1)中得到 的缓冲液，0.2扣1 RNA酶抑制剂(4〇υ/μ1)，1.0μ1 SMARTScribe逆转录酶（100U)，将W上试 剂混匀；
[0042] (6)向步骤(3)中得到的3 ' RACE和步骤(4)中得到的5 ' RACE反应液中分别加入5.25 μ1步骤(5)中得到的反应液，轻柔混合，短暂离屯、收集液体