br>[0080] (1)取3mL过夜培养菌液，8000 X g离屯、2分钟收集菌体。
[0081 ] (2)在菌体沉淀中加入25化L Buffer P1吸打或振荡至充分悬浮菌体。
[0082] (3)加入250化的Buffer P2,立即溫和颠倒离屯、管5-10次混匀，室溫静置2-4min。
[0083] (4)加入35化L Buffer P3,立即溫和颠倒离屯、管5-10次充分混匀，然后室溫静置 2min〇
[0084] (5)于离屯、机中室溫12000 Xg离屯、12min，将上清全部小屯、移入吸附柱，9000 Xg离 屯、30sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。
[00化](6)在吸附柱中加入50化1去蛋白液Buffer DWl ,9000 Xg离屯、30sec。倒掉收集管 中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。
[0086] (7)向吸附柱中加入500μ1 Wash Solution，9000Xg离屯、30sec。倒掉收集管中的 液体，将吸附柱放入同一个收集管中。
[0087] (8)重复步骤7。
[0088] (9)将空吸附柱和收集管放入离屯、机，9000 Xg离屯、Imin。
[0089] (10)在吸附膜中加入60化Elution Buffer,静置2min，9000Xg离屯、Imin。将所得 的质粒DM溶液置于-20°C保存。
[0090] 2.5.2目的片段和质粒载体的双酶切
[0091] 将纯化后的plnD基因片段和PNZ8048质粒进行40化体系双酶切，如下表4所示。
[0092] 表4双酶切反应体系
[0093]
[0094] 注:plnD和PNZ8048双酶切体系
[0095] 在37°C水浴中酶切3小时后，取化L产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检验酶切是否完 全。
[0096] 2.6PCR产物和表达载体酶切回收
[0097] 2.6.1目的片段双酶切回收
[0098] 使用生工SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒除去反应液中少量的限制性内切酶和 金属盐离子，方法2.4。
[0099] 2.6.2质粒双酶切回收
[0100] 载体质粒PNZ8048的酶切产物用AxyPr邱公司的DNA凝胶回收试剂盒
[0101] 进行琼脂糖凝胶割胶回收，具体步骤如下。
[0102] (1)称取〇.2g琼脂糖溶解于20mL 1XTAE缓冲液，加热溶解，加2化gelred?染料， 倾倒制胶，插Π 孔梳子;按10:1的比例混合样品和Loading Buffer，上样，进行110V恒压琼 脂糖凝胶电泳3 5m i η。
[0103] (2)在紫外灯下切割出含有目的基因条带的琼脂糖凝胶，尽量切除不含目的基因 的琼脂糖凝胶。将切下的琼脂糖凝胶块称重，切碎，放入1.5mL的离屯、管中。
[0104] (3)将琼脂糖凝胶重量换算为凝胶体积（100yg=l(K)化体积）。加入3个凝胶体积的 Buffer DE-A，混合均匀后75°C加热，间断混匀，直至胶块完全烙化。
[0105] (4)加入0.5个Buffer DE-A体积的Buffer-DE-B，混合均匀。
[0106] (5)将上步骤的溶液转移到试剂盒提供的2mL DNA制备管，置于2mL离屯、管上， 12000 X g离屯、Imin，弃滤液。
[0107] (6)将制备管重新放回2血离屯、管，加500化Buffer W1 12000Xg离屯、30sec，弃滤 液。
[010引 （7)将制备管重新放回2血离屯、管，加700化Buffer W2，12000Xg离屯、30sec，弃滤 液。
[0109] (8)重复步骤7,将制备管重新放回2mL离屯、管，12000Xg离屯、Imin。
[0110] (9)制备管放到新1.5mL离屯、管，室溫静置待乙醇挥发干净，向制备膜中央加入35μ L Elution Buffer(60°C预热），室溫静置2min。室溫12000Xg离屯、Imin，洗脱DNAJ%琼脂 糖凝胶电泳检验，-20°C保存。
[0111] 2.7目的片段和质粒载体连接
[0112] 将纯化后的酶切片段即目的片段plnD分别与酶切质粒酶切质粒PNZ8048按比例混 合，16°C过夜连接，连接体系如下5:
[0113] 表5 DNA连接体系
[0114]
[0115] 2.8连接产物的转化
[0116] 2.8.1E.coli MC1061 感受态的制备
[0117] 根据《分子克隆试验指南》中化C12法制备E.coli MC1061感受态。步骤如下：
[011 引（1)配制0.05M CaCl2溶液和0.05M含15%甘油的化(：12，121°(3，灭菌15111111。
[0119] (2)取-20°C冰箱保存的E.coli MC1061菌株保藏管，在LB固体培养基上划线接种， 37°C倒置培养过夜。待长成菌落，挑选一个单菌落接种至lOmL LB液体培养基，37°C振荡过 夜。
[0120] (3)接种2mL菌液至lOOmL LB液体培养基的Ξ角瓶中，接种量为2%，37°C振荡培 养，待ODsqq达到0.3-0.4，将80mL菌液转移进灭过菌的lOOmL离屯、管，置于冰上预冷30min。 [0121 ] (4)在4°C，4000巧m的条件下离屯、15min，弃上清，加入4mL预冷的0.05M CaCl24血， 用枪头小屯、吹散，冰上放置30min。
[0122] (5)在4°C，4000rpm的条件下离屯、15min。弃上清，加入2血预冷的0.05M含15 %甘油 的化Cl2，用枪头小屯、吹散，用灭过菌的1.5mL离屯、管每管分装为10化L，-80°c保藏。
[0123] 2.8.2转化6.(3〇11]\0061感受态
[0124] (1)从-80°C冰箱取出E.coli MC1061感受态（100μL管），冰上化冻。
[012引 （2)各加入lOyL连接产物pNZ8048-plnD，缓慢吸打混匀，在冰浴静置30min。
[0126] (3)移入42°C水浴锅，热击90s，立即取出至冰浴5min。
[0127] (4)加入80化1 LB液体培养基，放置摇床，37°C，200巧m培养2小时。
[0128] (5)取20化L菌液，涂布于含有30yg/mL氯霉素的LB固体培养基。
[0129] (6)放入37°C培养箱，待培养基上的液体被吸收，倒置培养16-1化。
[0130] 2.9阳性转化子的筛选
[0131] 挑取长得粗壮的菌落接种至含有lOmL LB液体（含30yg/mL氯霉素）试管中培养 1化，从各试管种各取化L菌液，如化菌液为DNA模板进行菌液PCR，方法如2.3节。
[0132] 2.10调控基因测序及比对
[0133] 将鉴定为阳性的菌种抽提质粒送至生工生物工程(上海)有限公司测序，测序结果 利用NCBI网站和软件DNAMAN 7.0比对。
[0134] 3试验结果与分析
[01巧]3.1植物乳杆菌ZJQ基因组提取
[0136] 如图1所示，图中泳道1、2均出现一条较明亮的条带。分子量比Marker最大分子量 lOOOObp大很多，初步断定为植物乳杆菌ZJQ基因组。
[0137] 3.2植物乳杆菌2扣目的基因？0?扩增
[0138] 如图2所示，从泳道1到泳道9为W植物乳杆菌ZJQ基因组为DNA模板的plnD的PCR扩 增产物，泳道10为不加基因组模板的PCR阴性对照，阴性对照没有出现像1-9号泳道一样的 特异性DNA亮条带，且1-9号泳道特异性条带位置均在700-8(K)bp之间，大小符合plnD基因理 论值744bp，初步断定1-9号泳道中的片段为plnD。
[0139] 如图3所示，从泳道1到泳道9为W植物乳杆菌ZJQ基因组为DNA模板的plnD的PCR扩 增产物，泳道10为不加基因组模板的PCR阴性对照，阴性对照没有出现像1-9号泳道一样的 特异性DNA亮条带，且1-9号泳道特异性条带位置均在700-8(K)bp之间，大小符合plnD基因理 论值744bp，初步断定1-9号泳道中的片段为plnD。
[0140] 3.3质粒和