一种重组乳酸菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，设及到一种W乳酸乳球菌为载体的抗I型糖尿病疫苗 及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 糖尿病值i油etes)是一组W高血糖为特征的代谢性疾病。高血糖则是由于膜岛 素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起。长期高血糖会导致各种组织，特别是眼、 肾、屯、脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。临床上主要表现为"Ξ多一少"即多尿、多饮、 多食、消瘦等表现。糖尿病是现代疾病中的第二杀手，其对人体的危害仅次于癌症。I型糖 尿病（IDDM)是由于膜岛β细胞破坏或功能缺失导致膜岛素绝对缺乏所引起的糖尿病，患 者血糖水平持续升高，出现糖尿病。目前治疗I型糖尿病的方法主要有W下几种：皮下注射 膜岛素及其类似物、膜岛移植、干细胞治疗、通过基因工程技术再造能分泌膜岛素的克隆细 胞来代替膜岛细胞、W及预防或治疗性疫苗。目前，利用疫苗来预防I型糖尿病的越来越受 到人们的关注。
[0003] 热休克蛋白化eatshockprotein,服巧60是膜岛β细胞主要的自身抗原之一， 它具有抗原肤分子伴侣作用；巨隧细胞、DC和ΝΚ细胞等表面均存在HSP60受体，抗原和 HSP60的融合蛋白具有祀向免疫细胞的作用；另外，HSP60也具有免疫佐剂功能，可诱导DC 活化，HSP60通过其受体与APC细胞作用，可诱发一系列的免疫激活事件，包括免疫细胞成 熟、活化和抗原的交叉激活。实验发现，结合分歧杆菌HSP65与人源HSP60有大约50 %的 同源性，且HSP65作为卡介苗的主要抗原已广泛用于人类肺结核的防治，因此本疫苗选用 HSP65作为抗原表位的载体。
[0004] IA2P2是一段小肤，含有至少一个对I型糖尿病发生有重要作用的T细胞表位。其 相应的自身抗体也是I型糖尿病的特异性血清标志物，对新发病的I型糖尿病患者敏感性 很高。实验证实，通过诱发机体产生针对IA2P2的强免疫应答，可有效地抑制I型糖尿病 的发生。但IA2P2的免疫源性较弱，发明人通过多次重复串联和大分子承载的方法发现可 增强其免疫源性。因此，鉴于HSP65可承载的表位长度及IA2P2可能含有的表位数，本发明 IA2P2进行6次重复串联，并与HSP65融合，构建出服P65-6IA2P2的编码基因序列。 阳0化]乳酸乳球菌化actococ州Slactis)在食品工业中应用广泛，是一种公认的食品级 微生物，安全性较高。此外，乳酸乳球菌作为一种肠道益生菌，具备多种生理功能：控制肠 内感染、抗肿瘤活性等，还能促进小肠局部细胞免疫和体液免疫。并且乳酸乳球菌的遗传背 景明确，基因操作技术纯熟。因此，乳酸乳球菌是安全的疫苗递送载体，不会在肠道内定植， 不会危害肠道内正常益生菌群和造成潜在的基因污染。消化道每天都会接触到食物中的非 已抗原，但多数人对食物均不产生免疫反应，主要因为人类的肠道黏膜免疫系统能及时诱 导对食物中无害抗原的耐受。运种粘膜耐受机制能够扩散到全身，诱导全身性的耐受反应。 而用乳酸菌递呈的蛋白也会被识别为食物中的无害抗原而产生耐受。因此，本疫苗选用乳 酸乳球菌作为载体。通过口服活菌疫苗的方式，达到黏膜耐受的效果，克服了传统疫苗安全 性差、生产成本高、接种方式难接受的缺陷。
【发明内容】
[0006] 本发明目的之一是提供一种W乳酸乳球菌为载体的抗I型糖尿病疫苗的制备和 应用，该疫苗能有效预防和治疗I型糖尿病。
[0007] 一种重组乳酸菌，其特征在于该重组乳酸乳球菌命名为乳酸乳球菌NZ9000PCYT: 服P65-6IA2P2Lactococ州SlacticsNZ9000pCYT出SP65-6IA2P2;保藏于中国典型培养 物保藏中屯、，保藏地址中国武汉武汉大学；保藏时间：2014年11月28日；保藏编号：CCTCC NO：M2014609〇
[0008] 该重组乳酸乳球菌由融合蛋白服P65-6IA2P2的编码基因通过质粒PCYT电转入乳 酸乳球菌中获得；其中所述融合蛋白服P65-6IA2P2是由疫苗肤IA2P2重构肤段重复六次融 合在服P65载体的C端构成；所述乳酸乳球菌为LactococcuslactisNZ9000基因工程重 组菌；所述服P65-6IA2P2融合蛋白的氨基酸序列如SEQNO:1所示。
[0009] 所述的服P65-6IA2P2融合蛋白的编码基因的核巧酸序列如SEQNO:2所示。
[0010] 具体的来说：将IA2P2重构肤段，重复六次融合在HSP65载体的C端 (服P65-6IA2P2)，共由690个氨基酸组成。序列表中SEQNO:1的氨基末端第1-540位为 HSP65序列，氨基末端第541-542位为AS(丙氨酸-丝氨酸），氨基末端第543-565位为 IA2P2序列，其中IA2P2段中的前10个氨基酸来自于IA2,后13个氨基酸来自于人服P60 蛋白序列。自氨基酸第566-567、591-592、616-617、641-642、666-667为5个重复的柔性连 接肤SS(丝氨酸-丝氨酸）。氨基酸第 568-590、593-615、618-640、643-665、668-690 为 5 个重复的IA2P2肤段。
[0011] 所述服P65-6IA2P2融合蛋白的核巧酸序列具体可如序列表中SeqNO. 3所示。
[0012] 所述服P65-6IA2P2融合蛋白的编码基因可通过重组质粒PCYT:服P65-6IA2P2导 入乳酸乳球菌。所述重组质粒PCYT出SP65-6IA2P2是将PCYT:服P65-6P277中的P277基 因用所述融合蛋白编码基因替代得到的重组质粒；而所述的PCYT:服P65-6P277是将PCYT: NUC中的NUC基因用服P65-P277编码基因代替得到。所述表达载体PCYT:NUC为PWV01衍 生载体，启动子为化isA，携带氯霉素抗性基因W及多克隆位点（MC巧。
[0013] 所述的重组乳酸乳球菌在制备治疗I型糖尿病药物中的应用。
[0014] 所述的服P65-6IA2P2在制备治疗I型糖尿病药物中的应用。
[0015] 一种抗I型糖尿病疫苗，其特征在于其活性成分含有权利要求1所述的重组乳酸 乳球菌。
[0016] 一种检测试剂盒，其特征含有权利要求1所述的权利要求1所述的重组乳酸乳球 菌或服P65-6IA2P2。
[0017] 本发明所提供的重组乳酸乳球菌可为Lactococcus lactis NZ9000型，也可为其 它许可在人体使用的乳酸菌。
[0018] 本发明所提供的表达载体可为PCYT-NUC，也可为其它许可在人体使用的乳酸菌表 达载体。
[0019] 有益效果：
[0020] 1、由于IA2P2为小肤，免疫原性较弱。而服P65的强抗原性可W起到免疫佐剂的 作用，可显著增强与其结合的抗原肤的免疫原性，并且6次串联IA2P2重复表位序列，也可W加强免疫原性。因此，本疫苗将6次串联IA2P2重复表位序列与HSP65簇基端融合，更容 易产生高滴度、高特异性的抗体，从而对于I型糖尿病的治疗效果更好。
[0021] 2、研究表明，HSP65自身有蛋白酶的催化活性，容易被自身的蛋白酶降解。运样 就限制了热休克蛋白的应用。在服P65的分离纯化过程中，HSP65及其融合蛋白容易发生 降解。即使在纯化过程中添加蛋白酶抑制剂或者对HSP65进行改构，也不能得到明显抑制 HSP65降解的效果。因此，需要严格控制操作条件及利用组氨酸标签系统来尽量减少热休克 蛋白及其融合蛋白降解程度。运给纯化过程造成极大不便，而本疫苗通过乳酸乳球菌作为 递送融合蛋白服P65-6IA2P2的载体，使蛋白在机体中进行表达，巧妙地避免了蛋白降解的 问题，同时也省去了复杂的纯化过程，间接的节约了生产成本，对于实现大规模生产有重要 意义。
[0022] 3、本疫苗选用PCYT质粒作为载体，适用于异源性抗原在乳酸菌中的诱导表达。 PCYT载体不仅能在E.coliD册i中复制，而且可W在LactococcuslactisNZ90000中稳定 表达。
[0023] 4、传统疫苗一般通过皮下注射的方式进行给药，不仅存在安全性问题，而且运种 侵入式的给药方式很难被接种者接受，尤其是青少年和儿童。而本疫苗打破程措，通过口服 给药的方式，方便快捷，经济适用，易为青少年儿童接受。经实验证实，本疫苗经过抗体检测 能稳定表达融合蛋白，实现粘膜给药发挥药效。
[0024] 5、本疫苗采用乳酸乳球菌作为载体。乳酸乳球菌不会在肠道内定植，也不会危害 肠道内正常益生菌群和造成潜在的基因污染。口服乳酸乳球菌试验显示其在肠道内能够存 活3天，且4天后在排泄物中检测不到任何关于乳酸乳球菌的特征基因标记。乳酸乳球菌 能够顺利避开胃酸的侵袭，但在十二指肠却有大部分的被溶解，但其余的乳酸乳球菌能够 在小肠的后段得到复苏。小肠内环境溫和，肠道长度较长，蠕动缓慢。分泌表达的蛋白能定 向在运里得到较好的吸收，并被免疫细胞所识别。此外乳酸菌基因操作技术成熟，抗原蛋白 能稳定表达，也便