于工业化生产。
【附图说明】：
[00巧]图1融合蛋白组成结构示意图。 阳0%] HSP65是结核分枝杆菌热休克蛋白65，IA2P2是由人热休克蛋白服P60中的一段肤 段和膜岛瘤抗原-2中的B表位融合形成的肤段，AS(丙氨酸-丝氨酸）和SS(丝氨酸-丝 氨酸）是柔性连接氨基酸。
[0027] 图2PCYT出SP65-6IA2P2质粒构建示意图。
[0028] WPUC19 :6IA2P2 质粒为模板，PCR扩增出 6IA-2-P2 序列。用Miel和Hindlll 双酶切6IA2P2,并插入到经Miel和Hindlll双酶切后的PCYT:服P65-6P277,得到PCYT: HSP65-6IA2P2〇
[0029] 图3经过PCR获得6IA2P2基因的琼脂糖凝胶电泳检测结果。
[0030] Μ为marker，A图中Lane1 表示PCR后的产物IA2P2，Lane2 表示pCYT:服P65-6P277 经过化el和Hindlll双酶切后的产物，Lane3表示pCYT出SP65-6P277经化el酶切后的产 物。 阳03UB图Lanel为PCR的产物IA2P2,Lane2表示质粒经过双酶切后的产物。
[0032] 图4融合蛋白编码基因的测序图。
[0033] 图5WesternBlot检测重组乳酸乳球菌在不同培养时间表达融合蛋白结果。
[0034] 图6重组乳酸乳球菌疫苗对NOD小鼠的发病率影响。
[0035] 糖尿病发病的情况用高血糖值来表示，连续两次血糖值高于11.lmmol/1判定 为发病。如图所示，在4周龄时，各组小鼠都是健康且未发病的，而从12周龄起，对照组 (L.lactisNZ9000组）N孤小鼠即陆续发病，在16周龄时发病率明显上升，到26周龄时，累 积有92%的N孤小鼠发病；而实验组化.lactisPCYT出SP65-6IA2P2组）的发病率在20~ 32周内一直维持在较低水平，到观测期结束（32周）时发病率只有58%。结果表明，重组 乳酸乳球菌疫苗可W明显降低NOD小鼠糖尿病的发病率。
[0036] 图7重组乳酸乳球菌疫苗对NOD小鼠的糖耐量影响。
[0037] 如图所示，在进食后的一段时间，实验组化.lactisPCYT:服P65-6IA2P2组）的糖 耐量始终比对照组化.lactisNZ9000组）低，表明重组乳酸乳球菌疫苗可W较好控制NOD 小鼠的糖耐量。
[0038] 图8重组乳酸乳球菌疫苗对终末期NOD小鼠的血糖影响。
[0039] 如图所示，对照组化.lactisNZ9000组）仅有一只NOD小鼠血糖正常，一只高血 糖，其余死亡。而实验组化.lactisPCYT:服P65-6IA2P2组）有5只N孤小鼠血糖正常。 表明重组乳酸乳球菌疫苗可在一定程度上控制小鼠血糖。
【具体实施方式】：
[0040]W下通过附图及实施例对本发明作进一步说明。
[0041] 本说明书中所提到的材料： 阳0创 1.菌种，质粒和动物
[0043] (1)克隆用大肠杆菌EscherichiacoliD册a来源于Novagen，（2)表达用乳酸乳 球菌LactococcuslactisNZ9000和穿梭表达载体PCYT:NUC按照文献叩noufV，Langella P，Commiss过ireJ，et过1.Bovinerot过virusnonstructur过1protein4producedby Lactococcuslactisisantigenicandimmunogenic[J].Appl.Environ.Microbiol， 2001,67(4) :1423-8."的方法制备获得（3)4周龄的雌性NOD小鼠，购自扬州大学实验动物 中屯、，许可证号：SC'XK(Su)2012-0004。
[0044] 2.酶、试剂和主要仪器
[0045] (1)分子克隆工具酶为加拿大化rmentence公司产品；（2)质粒抽提试剂盒、PCR 胶回收试剂盒、DNA产物纯化试剂盒和DAB显色试剂盒为BBI有限公司产品；(3)诱导剂 Nisin为浙江银象生物公司产品；(4)酶标仪、电击转化仪等美国Bio-Rad公司产品；PCR仪 为德国化pendo计公司产品。
[0046] 3.培养基
[0047](1)LB培养基，配方如下：称取lOg膜蛋白腺、5g酵母提取物和5g氯化钢，加蒸馈 水至1000ml，调整抑至7. 4,121°C高压蒸气灭菌。 W48] 〇)GM17培养基，配方如下：称取大豆腺5.Og，蛋白腺2. 5g，酪蛋白腺2. 5g，酵母浸 粉2. 5g，牛肉粉5.Og，乳糖5.Og，抗坏血酸钢0. 5g，β-甘油憐酸钢19.Og，硫酸儀0. 25邑， 葡萄糖5g，加蒸馈水至1000ml，调整抑值至7. 2,115°C高压蒸气灭菌。 W例本说明书所提及的方法中质粒提取、PCR反应、限制性内切酶酶切、DNA片段的回 收、连接、化学转化大肠杆菌和电击转化乳酸乳球菌，运些都是基因工程研究领域的常规操 作方法，具体参见SambrookJ，FristshEF，ManiatisT.ΜolecularClonin邑；ALaboratory Manual2nded.NY:ColdSpring化rborL油oratoryPress，1989，PP.16-；340。
[0050] 4.抗体
[0051] (1)大鼠IA2P2抗血清按照文献"黄丽，潘科，孙远明.克喘免疫原化13. 2-BSA制 备3中鼠抗血清效果比较[J].食品科学，2005,26巧）：494-497."的方法制备获得，用作 WesternBlot-抗；（2)辣根过氧化物酶标记羊抗大鼠IgG抗体为武汉博±德生物工程有 限公司产品，用作WesternBlot二抗。 阳化引 5.酶连免疫吸附实验巧LISA)试剂
[0053] (1)包被液：〇. 〇5mol/L碳酸盐缓冲液（pH9. 6)。称取0.75g碳酸钢，1. 46g碳酸 氨钢，加去离子水定容至500ml。（2)PBS缓冲液：0. 02mol/L憐酸盐缓冲液（pH7. 4)。称取 0. 2g憐酸二氨钟，2. 90g憐酸氨二钢，8g氯化钢，加去离子水定容到1000ml。（3)抗体稀释 液：0. 02mol/LPBS(pH7. 4)和0. 2%BSA。称取0. 2浊SA加入配好的0. 02mol/L憐酸盐缓冲液 溶解定量至100ml。（4)封闭液：0. 05mol/L碳酸盐缓冲液（pH9. 6)和2. 0%BSA。2. 0浊SA 加配好的0. 05mol/L碳酸盐缓冲液溶解定量至100ml。（5)洗涂液：0. 02mol/LPBS(pH7. 4) 和0. 05%Tween-20。将50ulTween-20溶入lOOmlO. 02mol/L憐酸盐缓冲液中，震荡混匀。 (6)底物液：可溶性单组份TMB底物溶液。（7)终止液：2mol/L硫酸溶液。10ml98%浓硫酸 加入60ml双蒸水中，定容至100ml，室溫保存。
[0054] 实施例1服P65-6IA2P2基因的克隆 阳化引 W载体上位于目地基因两侧的通用引物M13F:5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3' 和M13R:5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3'分别作为上游、下游引物，两条引物由上海生工 生物工程有限公司合成。PUC19质粒为模板进行PCR，获得了编码6IA2P2序列的基因片段。 再用Miel和Hindlll双酶切，连入同样用Miel和Hindlll双酶切后的PCYT:服P65-6P277 载体，构建出PCYT出SP65-6IA2P2。
[0056]PCR反应按如下条件进行：每步反应中上下引物都按1 : 1比例混合，反应程序设 置为94°(：，13;50°(：，453;72°(：，503;共30个循环，0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定？〇?产物（参 见图3)，条带位置与预期的一致。
[0057] 将重组质粒PCYT:服P65-6IA2P2转化至EcoliD册a感受态细胞后，涂布到含 12. 5μg/mL氯霉素的LB固体培养基上，37 °C培养过夜，挑取单菌落。经酶切初筛阳性克隆， 将阳性克隆送至上海生工生物公司进行测序，测序结果经比对后完全正确，至此融合蛋白 基因，在大肠杆菌中构建完成。
[0058] 实施例2重组质粒PCYT出SP65-6IA2P2经电击转化导入乳酸乳球菌感受态细胞
[0059] 乳酸乳球菌感受态细胞制备的过程大致如下：从新鲜GM17琼脂平板挑选单个 菌落，接种10mLGM17培养基，30°C过夜静置培养。然后将ImL过夜培养物接种于50mL含 1-2.5%甘氨酸的预热的GM17培养基中，30°C静置培养。监测孤e。。?。当培养物的0D值接 近0. 2-0. 7时，取出培养物在冰上冷却10min-30min，再用灭菌管离屯、培养物，4°C5000g离 屯、15min，弃上清，用等体积的冰预冷的0SPS缓冲液悬浮细胞沉淀两次，用1/100的0SPS