glk3:
[0091] 日'-CGGTGGAACCCATGCGCGTTTCTCTATTG-3'(沈Q ID NO. 8)
[009引反向引物glfglk4:
[0093] 5' -ACATGCATGCGACTAGTCAGCCTCTTAAATTCAGTTC-3/ (沈Q ID NO.9)
[0094] PCR反应体系和反应条件同实施例1第1步。
[009引质粒祀T28a(购于Merck公司）用XbaI、S地I双酶切，回收5.化b的载体片段，与经同 样酶切的glf-glk连接，连接产物转化大肠杆菌ToplO感受态细胞(购于北京全式金生物技 术公司），挑取转化子，Wglfglkl和glfglk4为引物PCR鉴定，取阳性转化子抽提质粒，并用 甜曰1、5地1双酶切鉴定，所得阳性重组质粒祀了28-肖相肖化大小应为8.4化。
[0096] 双酶切反应体系：10 X酶切反应缓冲液化L，Xba I和Sph I限制性内切酶各化L，待酶 切质粒载体或PCR片段，加水补足20yL37°C酶切15-30min。
[0097] 连接反应体系：10 XT4DNA连接缓冲液化L，载体片段与祀基因片段的摩尔比为1: 3-7，T4DNA 连接酶 0. ，加水补足 ΙΟμΙ^; 22°C 连接 15-30min。
[0098] PCR反应体系和反应条件同实施例1第2步。
[0099] 2.重组质粒pMG56的构建
[0100] 质粒pET28-glfglk用XbaI、SphI双酶切，回收3.3kb的glf-glk基因片段；质粒 pMG43(CGMCC No. 6864)用Spel、S地I双酶切，回收约12.5化的载体片段，与经Xbal、S地I双 酶切的glf-glk基因片段连接，连接产物转化大肠杆菌ToplO感受态细胞，挑取转化子，W glfglk巧日glfglk4为引物PCR鉴定，取阳性转化子抽提质粒，并用SpeI、S地I双酶切鉴定，所 得阳性重组质粒PMG56大小应为15.8化。
[0101] 酶切、连接反应体系和反应条件同实施例2第1步;PCR反应体系和反应条件同实施 例1第涉。
[0102] 实施例2中PCR扩增反应所用的酶和试剂均购于北京全式金生物技术公司；酶切、 连接反应所用的酶和试剂均购于Fermentas公司；质粒提取和DNA琼脂糖凝胶回收参考 Tiangen公司质粒提取试剂盒和DNA回收试剂盒;大肠杆菌ToplO感受态细胞的制备和转化 方法参考《分子克隆实验指南虹》第1章96页。
[0103] 实施例3:产心色氨酸重组菌株的获得
[0104] 将实施例1获得的ptsHIcrr基因敲除的大肠杆菌突变体SAOlAptsHIcrr制成感受 态细胞(感受态细胞的制备和转化方法参考《分子克隆实验指南虹》第1章96页），将实施例2 获得的重组质粒PMG56转化宿主菌SAOlAptsHIcrr，获得了k色氨酸发酵生产基因工程菌 株MHZ-0811 (PMG56/SA01 AptsHIcrr，保藏号：11940)。
[0105] 将所述基因工程菌株MHZ-0811进行生物保藏，其相关信息如下：
[0106] 菌株Μ监-0811:分类命名：大肠埃希氏菌，Escherichia coli.于2015年12月25日 保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微7生物中屯、，地址为北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 11940。
[0107] 实施例4:利用k色氨酸基因工程菌株发酵生产心色氨酸
[010引从冻存管中分别取大肠杆菌菌株Μ监-0800和Μ监-0811在含四环素抗性（lOyg/mL) 的LB平板上划线，37°C静置培养18-24小时;将菌体从平板上刮下一环，接种到装有50mL含 四环素抗性（1化g/mL)种子培养基培养基的摇瓶中，37°C、240巧m培养5-10小时，0化00控制 在6-10;取2mL种子液转接至装有20mL含四环素抗性（1化g/mL)发酵培养基的摇瓶中，37°C、 24化pm培养20-30小时，培养过程中流加稀氨水，控制发酵液抑值至6.5-7.0，直至残糖耗 尽，发酵结束。
[0109] 发酵结束后，采用HPLC法测定发酵液上清中的心色氨酸含量，HPLC测定条件如下： 册 LC(Agi lent technologies ,1200)，色谱柱：XDB-C18 (4.6 X 250mm δμL?);流动相为： 8.5mmo 1 /L NaACWAC调抑至4.0):甲醇=95:5(V/V)，流速为 1.5mL/min;进样量 1 扣!^;检测 器:VWD，检测波长280nm;检测环境:溫度16.3°C，湿度20 %畑。
[0110] 种子培养基组分：
[0114] 进行3次摇瓶发酵平行实验，摇瓶发酵k色氨酸产量结果如表1所示：
[0115] 表1.基因工程菌株心色氨酸产量比较：
[0116]
[0117] 从表1可得知基因工程菌Μ监-0811摇瓶发酵心色氨酸产量为5.5g/L，糖酸转化率 为10.3%，较出发菌株MHZ-0800的产酸4.5g/L提高了22%。结果表明对大肠杆菌的PTS系统 进行改造起到了明显的效果。
[0118] 综上所述，本发明所构建的k色氨酸基因工程菌能够实现发酵过程中发酵液中k 色氨酸的有效积累，k色氨酸产量明显提高，从而为心色氨酸生产的产业化奠定了基础。
[0119] W上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核屯、思想。应当指出，对 于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可W对本发明进行 若干改进和修饰，运些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
【主权项】
1. 一种产L-色氨酸基因工程菌，其特征在于，磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统中 一个或多个基因被敲除或失活，且一个或多个以非PEP为底物的葡萄糖转运蛋白或酶相关 基因被过表达。2. 如权利要求1所述基因工程菌，其特征在于，所述被敲除或失活的基因为ptsH和/或 ptsl 和/或 crr〇3. 如权利要求1所述基因工程菌，其特征在于，所述被过表达的基因为gif和glk基因。4. 如权利要求1所述基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌保藏在中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 11940。5. 权利要求1所述产L-色氨酸基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括： 步骤A、L-色氨酸生产菌PTS系统中一个或多个与葡萄糖磷酸化和转运相关的基因被敲 除或失活，获得突变菌株； 步骤B、L-色氨酸生产菌中一个或多个以非PEP为底物的葡萄糖转运蛋白或酶相关的基 因被过表达，获得重组载体； 步骤C、将步骤B重组载体转化步骤A突变菌株中即得。6. 如权利要求5所述构建方法，其特征在于，所述被敲除或失活的基因为ptsH和/或 ptsl 和/或 crr〇7. 如权利要求5所述构建方法，其特征在于，所述被过表达的基因为gif和glk基因。8. 权利要求1所述产L-色氨酸基因工程菌在L-色氨酸生产中的应用。9. 一种L-色氨酸的生产方法，其特征在于，将保藏编号为CGMCC No. 11940的产L-色氨 酸基因工程菌接种于四环素抗性的种子培养基进行扩繁，然后将扩繁后的培养物转入含四 环素抗性的发酵培养基发酵。10. 根据权利要求9所述生产方法，其特征在于，所述发酵培养基由60g/L葡萄糖、1.0g/ L酵母提取物、5g/L KH2P〇4、2.0g/L柠檬酸、2g/L MgS〇4 · 7H20、5g/L(NH4)2S〇4、0. lg/L MnS〇4、0.1g/L FeS〇4.7H20、0.1g/L ZnS〇4.H20、0.1g/L CoCl2.6H20、0.03g/L CuS〇4· 5H20、20g/L CaC03组成，pH值为7.0。
【专利摘要】本发明涉及微生物领域，公开了一种产L-色氨酸基因工程菌及其构建方法以及用途。本发明通过基因工程的方法改造大肠杆菌的中央碳代谢途径的共有途径，敲除大肠杆菌自身的以磷酸烯醇式丙酮酸为底物的磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统，并增强以非PEP为底物的葡萄糖转运系统，改变葡萄糖转运入胞的路径，获得一种产L-色氨酸基因工程菌，避免了L-色氨酸合成前体物磷酸烯醇式丙酮酸在葡萄糖转运过程中的消耗，从而提高胞内PEP的水平，进而提高菌株发酵产L-色氨酸的能力。实验表明本发明构建的产L-色氨酸基因工程菌为大肠杆菌L-色氨酸高产菌株，能有效积累L-色氨酸，提高L-色氨酸的产量，为L-色氨酸的工业化生产奠定了基础。CGMCC No. 1194020151225
【IPC分类】C12N1/21, C12N15/70, C12P13/22
【公开号】CN105543154
【申请号】CN201610021610
【发明人】吴涛, 毛贤军, 赵津津, 王小霞
【申请人】廊坊梅花生物技术开发有限公司
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年1月13日