铁皮石斛内生真菌及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种铁皮石斛内生真菌，它是从兰科石斛属植物铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）植物活体中采用内生真菌分离纯化技术分离获得的，经微生物分类学鉴定为Pestalotiopsis sp. DO14。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2015180。本发明还通过与铁皮石斛组培苗共培养，促进铁皮石斛组培苗的茎加粗、加长与茎、叶的颜色加深，促使茎中多糖含量的提高、茎中醇溶性成分与叶中黄酮类成分的改变，是与铁皮石斛生长与代谢产物密切相关的重要微生物，具有促使铁皮石斛生长和代谢成分变化的应用潜力。CCTCC M201518020150331
【专利说明】
铁皮石斛内生真菌及其应用
技术领域
[0001]本发明涉及微生物技术领域，特别涉及铁皮石斛内生真菌及其应用。
【背景技术】
[0002]铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo(兰科石斛属植物)，是我国名贵中药材，具有滋阴清热、益胃生津、润肺明目、抗癌防老等功效，位列“中华九大仙草”之首。2010年版《中华人民共和国药典》将铁皮石斛从石斛类药材中划出，单独收录。随着铁皮石斛栽培技术的突破，产业得到了快速的发展，全国铁皮石斛现有种植面积突破4万亩，产值突破50亿元，成为我国产销量最大、发展最快的中药材之一。提高栽培药材的品质和保持质量稳定性成为了当前铁皮石斛产业可持续发展的重点，而明确其品质形成的作用机制是关键。
[0003]铁皮石斛作为兰科植物有其生长的特殊性，在自然生境中部分或全部依靠与其共生的菌根真菌为其提供营养才能促使种子萌发及后继的生长发育。近年来，另一个重要群体一非菌根内生真菌因其多种生态作用得到了越来越多的关注。大量的研究发现植物内生真菌作为微生物生态的一个重要组成部分，不仅能促进宿主生长、提高宿主对生物胁迫或非生物胁迫的抗性，还引起宿主次生代谢产物的变化，甚至能够诱导和促进药用植物有效成分的合成或积累，一些药用植物内生真菌还能产生与宿主相同或相似的生物活性物质。与根关联的非菌根内生真菌逐渐被人们认识和发现。一些证据证明与叶和根部相关的内生真菌对宿主植物的有利作用被低估。然而药用兰科植物，尤其是石斛属植物内生真菌研究缺乏，近年来石斛属植物与其真菌的关系研究也多集中在石斛菌根真菌的作用方面，仅有极少数关于石斛属非菌根内生真菌的报道，仍有大量的石斛属植物内生真菌以及它们对宿主植物的影响作用有待于探究。
[0004]我们在研究中发现不同种质的铁皮石斛具有极其丰富的内生真菌资源，将从铁皮石斛叶、茎、根中分离得到的内生真菌逐一与铁皮石斛无菌组培苗共培养，从中筛选出了对铁皮石斛生长、代谢成分变化有明显作用的优良菌株。这项工作为铁皮石斛内生真菌对宿主植物的影响研究提供实验基础和科学依据，为铁皮石斛品质改良开辟新的途径。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种新的铁皮石斛内生真菌，并提出其用途，即能够通过与铁皮石斛组培苗共培养，促进铁皮石斛组培苗的茎加粗、加长与茎、叶的颜色加深，促使茎中多糖含量的提高、茎中醇溶性成分与叶中黄酮类成分的改变，在于有效地促进铁皮石斛苗的生长，提高活性代谢成分的含量，为铁皮石斛内生真菌对宿主植物的影响研究提供实验基础和科学依据，为铁皮石斛品质改良开辟新的途径。
[0006]本发明提供了一种铁皮石斛内生真菌，命名为Pestalot1psissp.D014。本发明所述的铁皮石斛内生真菌是从兰科石斛属植物铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimuraet Migo)植物活体中采用内生真菌分离纯化技术分离获得的，经微生物分类学鉴定为Pestalot1psissp.D014。该菌株已保藏，保藏日期为2015年03月31日，保藏号为CCTCC M2015180，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址:中国武汉，武汉大学，邮编:430072。
[0007]本发明所述的铁皮石斛内生真菌的固体培养特征为:在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上26 °C培养，菌落白色絮状。
[0008]本发明所述的铁皮石斛内生真菌显微特征为:分生孢子具有5个细胞，中间细胞着色，顶孢和尾孢均为三角形。
[0009]本发明所述的铁皮石斛内生真菌的ITS和5.8S rDNA碱基序列如SEQ ID N0.1所示为:
CCTCTGTACGCGGAGGGACATTATAGAGTTTTCTAAACTCCCAACCCATGTGAACTTACCTTTTGTTGCCTCG
GCAGAAGTTATAGGTCTTCTTATAGCTGCTGCCGGTGGACCATTAAACTCTTGTTATTTTATGTAATCTGAGCGTCT
TATTTTAATAAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAA
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GCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTTAAGCCTAGCTTAGTGTTGGGAATCTACTTCTCTTAGGAGTTGTAGTTCCT
GAAATACAACGGCGGATTTGTAGTATCCTCTGAGCGTAGTAATTTTTTTCTCGCTTTTGTTAGGTGCTATAACTCCC
AGCCGCTAAACCCCCAATTTTTTGTGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATAAo
[0010]本发明还提供了铁皮石斛内生真菌的应用。
[0011]本发明所述的铁皮石斛内生真菌，与铁皮石斛组培苗共培养，促进铁皮石斛组培苗生长，促使铁皮石斛组培苗中代谢成分改变，其实施步骤如下:
菌种活化—与组培苗共培养—共培养组培苗生长状况观察—组培苗茎、叶中主要代谢成分提取—组培苗茎、叶中主要代谢成分分析；
其中菌种活化采用平板固体培养基，培养基为PDA;内生真菌与组培苗共培养培养基为香蕉培养基(大量50 mL/L，微量10 mL/L，有机10 mL/L，铁盐10mL/L，NAA I mL/L，琼脂4.2g/L，白糖30g/L，香蕉150/L，花宝1.0 g/L，pH=7.09)。培养时间:菌种平板培养活化7_14天，内生真菌与组培苗共培养I个月。培养温度:菌种活化为26 ± I °C，共培养为25 ± TC。共培养光照时间为8?12小时/天，光强为1000?20001X。组培苗茎中多糖含量测定:参照《2010版中国药典一部》中的苯酚-硫酸比色法。
[0012]茎中醇溶性成分提取:精密称定1.0g茎粉末，置250mL圆底烧瓶中，精密加入10mL甲醇，80°C水浴回流lh，过滤，滤液旋干，甲醇溶解并定容至2mL，0.45ym微孔滤膜过滤，SP得。
[0013]叶中黄酮类成分提取:精密称定0.4g叶粉末，置50mL具塞三角瓶中，精密加入20mL80%甲醇，密塞，20°C超声30π?η，0.45μπι微孔滤膜过滤，即得。利用HPLC指纹图谱技术分析组培苗茎中醇溶性成分与叶中黄酮类成分。
[0014]本发明所述的铁皮石斛内生真菌，通过与铁皮石斛组培苗共培养，促进铁皮石斛组培苗的茎加粗、加长与茎、叶的颜色加深，促使茎中多糖含量的提高、茎中醇溶性成分与叶中黄酮类成分的改变，具有较大的应用前景。
【附图说明】
[0015]图1本发明所述铁皮石斛内生真菌在PDA平板培养基上的形态图；
图2本发明所述铁皮石斛内生真菌的显微镜(1000Χ)观察图； 图3本发明所述铁皮石斛接菌组培苗与无菌组培苗形态特征比较图；
图4本发明所述铁皮石斛接菌组培苗与无菌组培苗茎中多糖含量比较图；
图5本发明所述铁皮石斛接菌组培苗与无菌组培苗叶中黄酮类成分对比指纹图谱；
图6本发明所述铁皮石斛接菌组培苗与无菌组培苗叶茎中醇溶性成分对比指纹图谱。
【具体实施方式】
[0016]下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求所限定的范围。
[0017]本发明的铁皮石斛内生真菌是从浙江省乐清市雁荡山铁皮石斛叶、茎、根中均能得到的菌株。本发明的铁皮石斛内生真菌按以下步骤分离获得:将采集的新鲜健康的铁皮石斛茎、叶与根在自来水下冲洗干净，用无菌滤纸吸干表面水分，将根和茎切成3cm长的小段，叶片切成3cmX3cm的小块，进行75%乙醇I min—2.5%次氯酸钠3 min—75%乙醇30 s三步表面消毒处理。消毒后，材料表面用无菌水冲洗3次再用无菌滤纸吸干，用消毒后的剪刀分别将根和茎剪成小段(1.0 cm)、叶片剪成小块(0.5 cmX0.5 cm)，置于含有50 mg/L青霉素的PDA(土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15g/L)培养基上26±2°C培养。每天观察样品真菌生长的情况。5-7天后有菌丝长出，挑取菌丝尖端转移到新的TOA培养基上纯化培养，并按形态合并，最终得到本发明的铁皮石斛内生真菌菌株。
[0018]在无菌条件下用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的固体TOA培养基平板，于26土TC活化培养14，铁皮石斛内生真菌在PDA平板培养基上的形态特征及显微特征如图1、图2所示。
[0019]准备铁皮石斛无菌组培苗，用打孔器将覆盖培养基表面的菌丝打成大小相同的菌片(直径为0.5cm)，接种在距离铁皮石斛无菌组培苗1.5cm处，25 °C每天光照12h条件下培养I个月，期间对组培苗生长情况进行观察。与铁皮石斛内生真菌共培养I个月的铁皮石斛组培苗以及铁皮石斛未接菌组培苗的形态特征如图3所示。
[0020]为检测铁皮石斛内生真菌接种后的效果，可从铁皮石斛内生真菌与组培苗共培养的组培瓶中，取出铁皮石斛组培苗，将其进行清洗，烘干，再进行铁皮石斛组培苗茎的多糖含量测定、茎中醇溶性成分指纹图谱与叶中黄酮类成分指纹图谱检测。与铁皮石斛内生真菌共培养I个月的铁皮石斛组培苗以及铁皮石斛未接菌组培苗茎中多糖含量比较如图4所示，茎中醇溶性成分、叶中醇溶性成分比较如图5、6所示。
[0021]多糖含量测定、茎中醇溶性成分指纹图谱与叶中黄酮类成分指纹图谱检测结果表明，接种后，铁皮石斛小苗与内生真菌形成了共生关系，不仅促进了铁皮石斛小苗的生长速度，同时也使铁皮石斛植株植体内多糖和醇溶性成分大幅度提高，有效地提高了铁皮石斛的品质。
【主权项】
1.一种铁皮石斛内生真菌，其特征在于，它的命名为拟盘多毛孢属Pestalot1psissp.D014，其保藏登记号为CCTCC M 2015180。2.如权利要求1所述的铁皮石斛内生真菌，其特征在于，它的ITS和5.8SrDNA碱基序列如SEQ ID N0.1所示为: CCTCTGTACGCGGAGGGACATTATAGAGTTTTCTAAACTCCCAACCCATGTGAACTTACCTTTTGTTGCCTCGGCAGAAGTTATAGGTCTTCTTATAGCTGCTGCCGGTGGACCATTAAACTCTTGTTATTTTATGTAATCTGAGCGTCTTATTTTAATAAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCATTAGTATTCTAGTGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTTAAGCCTAGCTTAGTGTTGGGAATCTACTTCTCTTAGGAGTTGTAGTTCCTGAAATACAACGGCGGATTTGTAGTATCCTCTGAGCGTAGTAATTTTTTTCTCGCTTTTGTTAGGTGCTATAACTCCCAGCCGCTAAACCCCCAATTTTTTGTGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATAAo3.如权利要求1或2所述的铁皮石斛内生真菌，其特征在于，它的显微形态为:分生孢子具有5个细胞，中间细胞着色，顶孢和尾孢均为三角形。4.如权利要求1或2所述的铁皮石斛内生真菌，其特征在于，它的固体培养为TOA培养基上26 °C培养，菌落白色絮状。5.根据权利要求1-4中任何一项所述的铁皮石斛内生真菌在促使铁皮石斛组培苗生长和代谢成分变化中的应用。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，铁皮石斛内生真菌与铁皮石斛无菌组培苗共培养包括下列步骤: (1)取铁皮石斛内生真菌菌种，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的固体PDA培养基平板，于26 ± I °(:活化培养14天； (2)准备好铁皮石斛无菌组培苗，待菌丝长满平板，用打孔器将覆盖培养基表面的菌丝打成大小相同的菌片，接种在距离铁皮石斛无菌组培苗1.5cm处，25°C每天光照12h条件下培养I个月，期间对组培苗生长情况进行观察； (3)从铁皮石斛内生真菌与组培苗共培养的组培瓶中，取铁皮石斛组培苗，将其进行清洗，进行铁皮石斛组培苗茎的多糖含量测定、茎中醇溶性成分指纹图谱与叶中黄酮类成分指纹图谱检测。
【文档编号】A01P21/00GK105886405SQ201510288283
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2015年6月1日
【发明人】吴令上, 斯金平, 董洪秀, 韩婷, 朱波
【申请人】浙江农林大学