一种可以抑制铜绿微囊藻生长的混养式微藻培养方法
【专利摘要】本发明涉及一种可以抑制铜绿微囊藻生长的混养式微藻培养方法，以城市污水厂二级出水作为培养基，将无毒微藻与有毒蓝藻在城市污水厂二级出水中共同培养，控制初始无毒微藻与有毒蓝藻的密度比例为2:1～10:1，在培养过程中，以硝酸钠和磷酸二氢钾分别作为氮、磷的补充源，控制培养基的浓度为总氮(TN)＝14.0?16.0mg·L?1，总磷(TP)＝0.28?0.40mg·L?1，氮磷比例控制在40～50:1。与现有技术相比，本发明方法适用于无毒微藻培养的同时，实现了对铜绿微囊藻生长的抑制，是一种安全可靠、经济的培养方法。此外，该技术方法以城市污水厂的二级出水作为培养基来源，具有深度净化污水的作用。
【专利说明】
一种可以抑制铜绿微囊藻生长的混养式微藻培养方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种微藻培养方法，尤其是涉及一种可以抑制铜绿微囊藻生长的混养 式微藻培养方法。
【背景技术】
[0002] 目前，城市污水处理中常常出现出水氮磷浓度超标，若直接排入自然水体将导致 水体富营养化，引起有毒微藻恶性繁殖，引发水华现象;二级出水水量大、有机物含量较低， 若采用深度脱氮除磷处理技术，将会增加投资和运行成本。
[0003] 无毒微藻是一类自然水体中常见且具有生态资源化利用价值的微生物，以无毒微 藻作为生物质能原料和水产类饵食具有良好的发展前景。无毒微藻在进行光合作用时，对 水体中的碳源营养要求较低，并可以利用水体中的氮磷等营养元素合成自身物质。利用无 毒微藻的这一特性，将城市污水的二级出水作为微藻培养基，既可以培养微藻，也可以实现 进一步净化污水的效果。
[0004] 水体富营养化导致水体中有毒藻类大量繁殖引起水华，常见为蓝藻水华，铜绿微 囊藻则是蓝藻水华中最主要的藻类，其大量繁殖产生微囊藻毒素，不仅威胁到水体中水生 生物的生命，更有可能威胁人类的健康。因而控制水体中蓝藻数量，对于抑制水体蓝藻水华 的爆发具有实质性的意义。若采用化学药剂等方法抑制水体中有毒微藻的生长，杀死有毒 微藻的同时也会对水体其他有益微生物造成影响，另外成本较高，还会导致二次污染。
[0005] 不同微藻生长过程对氮磷的需求不同，当环境中氮磷浓度较低时，特定的氮磷浓 度与氮磷比对微藻生长影响尤其显著。利用无毒微藻与有毒微藻培养的氮磷要求和比例不 同，通过控制水中氮磷的浓度及比例，使其适于无毒微藻的生长，利用无毒微藻对氮磷等营 养物质的竞争，抑制有毒蓝藻生长，同时对城市污水厂二级出水进行深度脱氮除磷。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于针对蓝藻过度繁殖引起水华的问题，提供一种可以抑制铜绿微 囊藻生长的混养式微藻培养方法，本发明方法能够抑制蓝藻恶性增殖，处理方法简单有效、 成本低、生态效益好。选取对氮磷吸收能力强、营养水平相似的无毒微藻(蛋白核小球藻、椭 圆小球藻、斜生栅藻)与有毒蓝藻(铜绿微囊藻）同时接种于调配好氮磷浓度的城市二级出 水中，以接近自然水体的环境条件进行培养，通过调节水体氮磷浓度和比例，从而控制不同 藻类的生长速度，试验结果表明该方法在促进无毒藻类生长的同时，可以较好地抑制有毒 蓝藻的生长，同时实现对水体进一步净化。
[0007] 本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
[0008] -种可以抑制铜绿微囊藻生长的混养式微藻培养方法，以城市污水厂二级出水作 为培养基，将无毒微藻与有毒蓝藻在城市污水厂二级出水中共同培养，控制初始无毒微藻 与有毒蓝藻的密度比例为2:1~10:1。
[0009] 进一步地，在培养过程中，以硝酸钠和磷酸二氢钾分别作为氮、磷的补充源，控制 培养基的浓度为总氮(TN) = 14.0-16.0mg · L-S总磷(TP)=0.28-0.40mg · L-S氮磷比例控 制在40~50:1。
[0010]进一步地，根据培养基中氮、磷的消耗速率，定期排出培养基并补充新鲜的培养 基，并根据消耗的氮、磷量补充相应的氮、磷营养，以此保证培养基中的T N与T P浓度与培养 基的总体积基本保持不变。在培养过程中，当培养基中的氮磷浓度降低为初始浓度的60%-80%时，进行氮磷营养补充。
[0011]进一步地，所述的城市污水厂二级出水的水质主要指标范围为：C(TN)< 20mg · L _1,c(TP) < 1.5mg · L_1,C0Dcr<60mg · L_1,pH=6-9〇
[0012] 进一步地，在培养过程中，在光照充足、空气流通的自然条件下敞开培养。
[0013] 进一步地，本发明中选择氮磷吸收能力较强并具有生态资源化利用价值的无毒微 藻，所述的无毒微藻选自蛋白核小球藻、椭圆小球藻或斜生栅藻中的一种或几种的组合。
[0014] 进一步地，所述的蛋白核小球藻选自蛋白核小球藻FACHB-1222，所述的椭圆小球 藻选自椭圆小球藻FACHB-40，所述的斜生栅藻选自斜生栅藻FACHB-417。
[0015] 进一步地，所述的有毒蓝藻选自铜绿微囊藻。
[0016] 进一步地，无毒微藻与有毒蓝藻的混合培养周期为10-20天。
[0017] 本发明的技术方案是通过以下步骤确定的：
[0018] 步骤1、藻种扩大培养:选择氮磷吸收能力较强并具有生态资源化利用价值的无毒 微藻，以BG11为基础培养基，置于恒温培养箱中（温度25 ± 5 °C，光照强度2000 ± 500LUX，光 照时长10~16h)培养5-10天。镜检藻种数目达到107~lOVl/1左右时进行转接以扩大培养， 转接两次之后，选择生长繁殖和氮磷吸收能力较强的藻种。
[0019] 步骤2、目标藻种筛选：以BG11为基础培养基，以城市二级出水氮磷浓度为参比，以 硝酸钠和磷酸二氢钾分别作为氮、磷的补充源，培养基的浓度为总氮(TN) = 14.0-16.Omg · L一1，总磷(TP) = 0.28-0.40mg · L-1，氮磷比例控制在40~50:1，筛选出氮磷浓度要求相近的 小球藻属（蛋白核小球藻FACHB-1222、椭圆小球藻FACHB-40)和栅藻属(斜生栅藻FACHB-417)作为混养的目标藻种。
[0020] 步骤3、无毒微藻与有毒蓝藻的混养：
[0021] (1)藻种处理:取40-60mLBGl 1培养基中处于对数期的藻种入100mL离心管，在冷冻 离心机中5000r · mirT1下离心5min;弃上清液，用无菌水重复洗涤离心藻体3次后，用无菌去 离子水稀释待接种。
[0022] (2)混养培养基要求:接种于利于无毒微藻生长氮磷浓度的培养基中，以城市污水 厂二级出水作为培养基，并以硝酸钠和磷酸二氢钾分别作为氮、磷补充源，通过稀释或添加 调配水中的氮磷浓度，使培养基的浓度为总氮(TN) = 14.0-16. Omg · I/1，总磷(TP)= 0 ΙΟ.40mg · Γ1，氮磷比例控制在 40 ~ 50:1。其中城市污水厂二级出水的水质主要指标范围为 ： c(TN) <20mg · L_1,c(TP) < 1.5mg · L_1,C0Dcr < 60mg · L_1,pH=6-9〇
[0023] (3)天然水体中，一般认为蓝藻数超过lO5!!!!/1，即认为蓝藻水华爆发，表明此时蓝 藻生长状态极好。另一方面，常见水体中微藻与蓝藻一般比例为2:1，而当比例超过10:1时， 因两者数目相差较大，无法显现两者竞争抑制关系。由此，培养基无菌化处理后，模拟自然 水体中微藻的比例，以接种比例为无毒微藻密度:有毒蓝藻密度=5 X loir1:2.5 X ΙΟ5!!!!/1 (2:1)或5 X 1) :0.5 X ΙΟ5!!!!/1分别将微藻接入用于混养的培养基中，进行敞开式 培养，培养环境为光照充足、空气流通的自然培养条件，当培养基中的氮磷浓度降低为初始 浓度的60 %-80 %时，取出一定体积（占总体积的十分之一）的藻液，并根据消耗的氮磷含量 补充相应的氮磷营养，由此保证培养基中的TN与TP浓度与培养基的总体积基本保持不变， 以证明该方法对铜绿微囊藻的抑制作用。
[0024] 步骤4、有毒蓝藻与无毒微藻的混合培养周期为10-20天。以微藻生长状况而定，待 微藻进入衰亡期时培养周期停止。
[0025] 与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
[0026] (1)通过调节氮磷浓度和比例，利用微藻间的竞争生长，促进无毒微藻生长的同 时，有效抑制铜绿微囊藻的生长。
[0027] (2)本发明方法所需环境条件简单，可操作性强，方便可行，可为控制水华微藻的 生长提供新的思路。
【附图说明】
[0028]图1为本发明方法实施流程图。
【具体实施方式】
[0029] 如图1所示，本发明的技术方案是通过以下步骤确定的：
[0030] 步骤1、藻种扩大培养:选择氮磷吸收能力较强并具有生态资源化利用价值的无毒 微藻，以BG11为基础培养基，置于恒温培养箱中（温度25 ± 5 °C，光照强度2000 ± 500LUX，光 照时长10~16h)培养5-10天。镜检藻种数目达到107~lOVl/1左右时进行转接以扩大培养， 转接两次之后，选择生长繁殖和氮磷吸收能力较强的藻种。
[0031] 步骤2、目标藻种筛选：以BG11为基础培养基，以城市二级出水氮磷浓度为参比，以 硝酸钠和磷酸二氢钾分别作为氮、磷的补充源，培养基的浓度为总氮(TN) = 14.0-16.Omg · L一1，总磷(TP) = 0.28-0.40mg · L-1，氮磷比例控制在40~50:1，筛选出氮磷浓度要求相近的 小球藻属（蛋白核小球藻FACHB-1222、椭圆小球藻FACHB-40)和栅藻属(斜生栅藻FACHB-417)作为混养的目标藻种。
[0032] 步骤3、无毒微藻与有毒蓝藻的混养：
[0033] (1)藻种处理:取40-60mLBGl 1培养基中处于对数期的藻种入100mL离心管，在冷冻 离心机中5000r · mirT1下离心5min;弃上清液，用无菌水重复洗涤离心藻体3次后，用无菌去 离子水稀释待接种。
[0034] (2)混养培养基要求:接种于利于无毒微藻生长氮磷浓度的培养基中，以城市污水 厂二级出水作为培养基，并以硝酸钠和磷酸二氢钾分别作为氮、磷补充源，通过稀释或添加 调配水中的氮磷浓度，使培养基的浓度为总氮(TN) = 14.0-16. Omg · I/1，总磷(TP)= 0 ΙΟ.40mg · Γ1，氮磷比例控制在 40 ~ 50:1。其中城市污水厂二级出水的水质主要指标范围为 ： c(TN) <20mg · L_1,c(TP) < 1.5mg · L_1,C0Dcr < 60mg · L_1,pH=6-9〇
[0035] (3)天然水体中，一般认为蓝藻数超过lO5!!!!/1，即认为蓝藻水华爆发，表明此时蓝 藻生长状态极好。另一方面，常见水体中微藻与蓝藻一般比例为2:1，而当比例超过10:1时， 因两者数目相差较大，无法显现两者竞争抑制关系。由此，培养基无菌化处理后，模拟自然 水体中微藻的比例，以接种比例为无毒微藻密度:有毒蓝藻密度=5 X loir1:2.5 X ΙΟ5!!!!/1 (2:1)或5 X 1) :0.5 X ΙΟ5!!!!/1分别将微藻接入用于混养的培养基中，进行敞开式 培养，培养环境为光照充足、空气流通的自然培养条件，当培养基中的氮磷浓度降低为初始 浓度的60 %-80 %时，取出一定体积（占总体积的十分之一）的藻液，并根据消耗的氮磷含量 补充相应的氮磷营养，由此保证培养基中的ΤΝ与ΤΡ浓度与培养基的总体积基本保持不变， 以证明该方法对铜绿微囊藻的抑制作用。
[0036] 步骤4、有毒蓝藻与无毒微藻的混合培养周期为10-20天。以微藻生长状况而定，待 微藻进入衰亡期时培养周期停止。
[0037] 下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
[0038] 实施例1-3
[0039] 三种无毒微藻(蛋白核小球藻FACHB-1222、椭圆小球藻FACHB-40斜生栅藻FACHB-417)与铜绿微囊藻混养。
[0040] 将蛋白核小球藻FACHB-1222、椭圆小球藻FACHB-40斜生栅藻FACHB-417和铜绿微 囊藻分别在BG11培养基中培养，并进行扩大培养。
[0041] 分别取生长状况良好的三种无毒微藻与铜绿微囊藻至100mL离心管，在冷冻离心 机中5000r · mirT1下离心5min;弃上清液，用无菌去离子水重复洗涤离心藻体3次后，用无菌 去尚子水稀释待接种。
[0042]三种无毒微藻与铜绿微囊藻按表1中所示的比例接种于TN=15mg · I/STPz 0.3mg · I/1的二级出水中，培养条件为自然环境下。
[0043] 当培养基中的氮磷浓度降低为初始浓度的60%_80%时，取出一定体积的藻液，并 根据消耗的氮磷含量补充相应的氮磷营养，由此保证培养基中的TN与TP浓度基本保持不 变。
[0044] 培养至第12~14天至微藻自然死亡，无毒微藻和铜绿微囊藻的生物量以及培养基 中的氮磷水平，如表1所示，由培养结束时各组无毒微藻与铜绿微囊藻的生物量可以看出， 铜绿微囊藻的生长均得到了有效的抑制。
[0045] 表1:实施例初始参数及运行效果
[0046]
[0047] 上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。 熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般 原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领 域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的 保护范围之内。
【主权项】
1. 一种可以抑制铜绿微囊藻生长的混养式微藻培养方法，其特征在于，以城市污水厂 二级出水作为培养基，将无毒微藻与有毒蓝藻在城市污水厂二级出水中共同培养，控制初 始无毒微藻与有毒蓝藻的密度比例为2:1~10:1。2. 根据权利要求1所述的一种可以抑制铜绿微囊藻生长的混养式微藻培养方法，其特 征在于，在培养过程中，以硝酸钠和磷酸二氢钾分别作为氮、磷的补充源，控制培养基的浓 度为总氮(TN) = 14.0_16.0mg · L-S总磷（TP) = 0.28_0.40mg · L-S氮磷比例控制在40~ 50:1〇3. 根据权利要求2所述的一种可以抑制铜绿微囊藻生长的混养式微藻培养方法，其特 征在于，在培养过程中，当培养基中的氮磷浓度降低为初始浓度的60%-80%时，进行氮磷 营养补充。4. 根据权利要求1所述的一种可以抑制铜绿微囊藻生长的混养式微藻培养方法，其特 征在于，所述的城市污水厂二级出水的水质主要指标范围为：c(TNH 20mg · I/SdTPH I · 5mg · L-1，CODcr < 60mg · L-1，pH=6-9 〇5. 根据权利要求1所述的一种可以抑制铜绿微囊藻生长的混养式微藻培养方法，其特 征在于，在培养过程中，在光照充足、空气流通的自然条件下敞开培养。6. 根据权利要求1所述的一种可以抑制铜绿微囊藻生长的混养式微藻培养方法，其特 征在于，所述的无毒微藻选自蛋白核小球藻、椭圆小球藻或斜生栅藻中的一种或几种的组 合。7. 根据权利要求6所述的一种可以抑制铜绿微囊藻生长的混养式微藻培养方法，其特 征在于，所述的蛋白核小球藻选自蛋白核小球藻FACHB-1222，所述的椭圆小球藻选自椭圆 小球藻FACHB-40，所述的斜生栅藻选自斜生栅藻FACHB-417。8. 根据权利要求1所述的一种可以抑制铜绿微囊藻生长的混养式微藻培养方法，其特 征在于，所述的有毒蓝藻选自铜绿微囊藻。9. 根据权利要求1所述的一种可以抑制铜绿微囊藻生长的混养式微藻培养方法，其特 征在于，无毒微藻与有毒蓝藻的混合培养周期为10-20天。10. 根据权利要求1所述的一种可以抑制铜绿微囊藻生长的混养式微藻培养方法，其特 征在于，无毒微藻与有毒蓝藻在城市污水厂二级出水中共同培养前，无毒微藻与有毒蓝藻 分别以BGl 1为基础培养基在温度25± 5°C，光照强度2000± 500LUX，光照时长10~16h条件 下培养5-10天，镜检藻种数目达到IO7~IOV/1左右时进行转接以扩大培养。
【文档编号】C12R1/89GK105886404SQ201610412233
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年6月14日
【发明人】陈秀荣, 王璐, 徐燕, 王晓晓, 张玉莹, 李佳慧, 于泽亚
【申请人】华东理工大学