用 血球计计数（用台盼蓝染色确定细胞活力）。
[0116] 实施例7记忆性B细胞ELISpot测试
[0117] 用 100 μ 1(2 μ g/ml)的纯化蛋白包被 ELISpot 96 孔板（Millipore)，并在 4°C温 育过夜。各包被抗原使用不同平板。第二天，洗涤平板，并用1% BSA封闭2小时。每孔加 入经免疫小鼠的25万个脾细胞，并在RPMI 1640 (阴性对照）存在下在37°C在5% C02中刺 激5-6小时。温育后，洗涤细胞，并用生物素化抗小鼠抗体（R&D Systems)在4°C温育过夜。 洗涤平板，并在各孔中加入链亲和素-碱性磷酸酶（R&D Systems)，室温温育2小时。再次 洗涤平板，并在各孔中加入5-溴-4-氯-3' -吲哚基磷酸对甲苯胺盐和氯化硝基四氮唑蓝 (色原颜色试剂；R&D Systems)。然后以蒸馏水漂洗平板，并室温干燥。由自动ELISP0T读 板器（Cellular Technology Limited)对点进行计数。结果表示为分泌抗原特异性抗体的 细胞（ASC)数量。
[0118] IL 15增强对抗JEV和WNV抗原的记忆性B-细胞激活
[0119] 以适当抗原进行刺激之后诱导B记忆性细胞体外分化为分泌抗体的浆细胞，从而 可以用B细胞ELISP0T技术定量抗原特异性记忆性B细胞。为了进一步评估由IL 15佐剂 诱导的免疫应答的质量，评估了小鼠的B记忆性应答。如"方法"中所述，制备小鼠脾脏，以 测定能够产生抗DIII蛋白的抗体的B细胞的频率。令人感兴趣的是，ELISpot测试结果与 上述DIII抗体ELISA数据一致。与单独接受Dili DNA疫苗的组相比，以IL 15共刺激的 小鼠中观察到更高频率的DIII特异性的小鼠抗体分泌细胞（图6)。该测试还提示，IL 15 明显增强了抗PWNV DIII疫苗的抗体分泌细胞应答，证据是该组显示出最高水平的抗体分 泌细胞。最重要的是，由WNV DIII+IL 15组动物血清的ELISA数据观察到，WNV DIII+IL 15组的B细胞能够结合所有3种抗原。紧接着该组，JEV DIII+IL 15显示了比仅接受JEV DIII的小鼠更强水平的B-细胞应答。与嵌合JE/WNV DIII接种的小鼠的ELISA结果一致， 该组小鼠的B细胞不仅不能结合JEV或WNV DIII-接种的小鼠，并且还不能结合接受嵌合 抗原本身的组。总之，ELISpot结果提示，对应于ELISA研究测定的DIII特异性抗体的滴 度的高亲和性抗原特异性B细胞的激活。
[0120] 我们研究的结果表明了 DIII蛋白样品可能不是更好的候选疫苗。一个可能的解 释是，正确折叠的可溶蛋白的百分数可能较低，而且不同研究者进行的纯化程序也可影响 rDIII的免疫原性。没有IL 15支持，使用单体DIII表达构建体，我们不能发现令人满意的 抗体应答。该研究中，我们利用每只动物仅20yg DNA就显示了增强水平的B-细胞增殖以 及抗体产生。因此，对于对抗JEV和WNV的免疫，与IL 15质粒组合的DNA疫苗能够代表更 好的成本有效的替代方案。
[0121] 总体而言，本研究所获结果表明，与可使用的良好佐剂组合的情况下，DIII是用于 诱导对抗WNV和JEV保护性免疫的有前景的充分明确的候选疫苗。抗体生成细胞的水平由 于IL 15的共刺激而增加4-5倍，直接表明了 IL 15可通过增强对抗WNV以及JEV的抗体 生成记忆性B细胞而诱导中和抗体的产生。与我们对制造嵌合DIII蛋白而提出的原理相 反，由失败的抗体应答和最少数量的抗体生成记忆性B细胞可知，所得到的嵌合蛋白不能 充当更好的抗原。一个可能的原因是将WNV DIII的表位引入JEV DIII中可能影响了构象 状态，而所述构象状态是引发免疫应答的适当递呈所需要的。这就是为什么该嵌合蛋白与 其前体分子（如天然JEV和WNV Dili)相比不能诱导免疫应答的原因。在迄今为止的任何 人类研究中还未系统性使用过IL-15。还应该注意，最近表明IL-15是滑膜炎、类风湿性关 节炎、自体免疫性甲状腺炎和自体免疫性糖尿病的介体。McInnes等人以及其他实验室已报 道了类风湿性关节炎的关节的滑膜液中高浓度的IL-15,并表明IL-15由滑膜衬的细胞表 达。目前，尚未有将IL-15与引发自身免疫性疾病的因果关系直接关联的人类研究。我们 已经确定，注射pIL-15-Opt可导致小鼠血清中不可检测水平的抗-人IL-15Ab，并且我们不 能检测接种小鼠血清中的人IL-15 (未公开的观察结果），表明以pIL-15-Opt接种后产生的 IL-15水平极低，但在局部足以增强本研究中观察到的DIII特异性免疫应答。
[0122] 本报告证明了这样一种方法：通过该方法，优化细胞因子质粒递送的IL-15可增 强对黄病毒DIII (已知黄病毒DIII在诱导中和抗体应答中起作用）特异的记忆性B细胞。
[0123] 参考文献
[0124] [1]Solomon T. Exotic and emerging viral encephalitides. Curr Opin Neural 2003 ；16(3) :411-8.
[0125] [2] Solomon T. Recent advances in Japanese encephalitis. J Neurovirol2003 ；9(2):274-83.
[0126] [3]Harrington T，Kuehnert MJ，Kamel H，Lanciotti RS，Hand S，Currier M 等 人，West Nile virus infection transmitted by blood transfusion. Transfusion 2003Aug ;43 (8):1018-22.
[0127] [4]Armstrong WS，Bashour CA, Smedira NG，Heupler FA, Hoeltge GA, Mawhorter SD等人，A case of fatal West Nile virus meningoencephalitis associated with receipt of blood transfusions after open heart surgery. The Annals of thoracic surgery 2003Aug ；76 (2):605-7.
[0128] [5] Shepherd JC，Subramanian A, Montgomery RA, Samaniego MD, Gong G，Bergmann A等人，West Nile virus encephalitis in a kidney transplant recipient. Am J Transplant 2004May ；4 (5):830-3.
[0129] [6] Pealer LN，Marfin AA，Petersen LR, Lanciotti RS，Page PL，Stramer SL 等 人，Transmission of West Nile virus through blood transfusion in the United States in 2002.The New England journal of medicine 2003Sep25 ；349 (13):1236-45.
[0130] [7]Kumar R，Tripathi P，Singh S，Bannerji G. Clinical features in children hospitalized during the 2005epidemic of Japanese encephalitis in Uttar Pradesh，India. Clin Infect Dis 2006Jul 15 ;43 (2):123-31.
[0131] [8]Murgod UAjMuthane UBjRavi VjRadhesh SjDesai A. Persistent movement disorders following Japanese encephalitis. Neurology 2001Dec26 ；57 (12):2313-5.
[0132] [9]Schioler KL，Samuel Mj Wai KL. Vaccines for preventing Japanese encephalitis. Cochrane database of systematic reviews (Online)2007 (3):CD004263.
[0133] [10] Appaiahgari MB, Saini M，Rauthan Mj Jyotij Vrati S. Immunization with recombinant adenovirus synthesizing the secretory form of Japanese encephalitis virus envelope protein protects adenovirus-exposed mice against lethal encephalitis. Microbes and infection/Institut Pasteur 2006Jan ；8(1):92-104.
[0134] [11]Bharati Kj Vrati S.Japanese encephalitis : development of new candidate vaccines.Expert review of anti-infective therapy 2006Apr ； 4(2) :313-24.
[0135] [12]Hoke CH，Nisalak A, Sangawhipa N，Jatanasen S，Laorakapongse T，Innis BL 等人，Protection against Japanese encephalitis by inactivated vaccines. The New England journal of medicine 1988Sep 8 ；319 (10):608-14.
[0136] [13] Takahashi H，Pool V，Tsai TF，Chen RT. Adverse events after Japanese encephalitis vaccination:review of post-marketing surveillance data from Japan and the United States. The VAERS Working Group. Vaccine 2000Jul I ； 18 (26):2963-9.
[0137] [14]Diagana M，Preux PM, Dumas M. Japanese encephalitis revisited. Journal of the neurological sciences 2007Nov 15 ；262 (1-2):165-70.
[0138] [15]Heinz FX，Mandl CW，Holzmann H，Kunz C，Harris BA, Rey F 等人，The flavivirus envelope protein E: isolation of a soluble form from tick-borne encephalitis virus and its crystallization. Journal of virology 19910ct ； 65(10) :5579-83.
[0139] [16]Nybakken GE，Oliphant T，Johnson S，Burke S，Diamond MS，Fremont DH. Structural basis of West Nile virus neutralization by a therapeutic antibody. Nature 2005Sep 29 ；437 (7059):764-9.
[0140] [17]Oliphant T，Engle M，Nybakken GE, Doane C，Johnson S，Huang L 等人， Development of a humanized monoclonal antibody with therapeutic potential against West Nile virus. Nature medicine 2005May ；1 I(5) :522-30.
[0141] [18]Martina BE, Koraka Pj van den Doel Pj Rimmelzwaan GF，Haagmans BLj Osterhaus AD. DC-SIGN enhances infection of cell with glycosylated West Nile virusin vitro and virus replication in human dendritic cell induces production of IFN-alpha and TNF-alpha. Virus research 2008Apr 9.
[0142] [19]Martina BE, Koraka Pj van den Doel Pj v