酸相似。可利用PAUP*4. OblO软件 (D. L. Swofford, Sinauer Associates, Massachusetts)计算〃相似性百分率〃。计算共有 序列与进化树中所有序列相比的平均相似性。
[0029] 本文所用的〃互补物〃或〃互补的〃是指可以在核酸分子的核苷酸或核苷酸类似 物之间进行Watson-Crick(例如，A-T/U和C-G)或Hoogsteen碱基配对的核酸。
[0030] 本文所用术语〃可表达形式〃是指含有必需的调控元件的核酸构建体，所述调控 元件与编码蛋白的编码序列可操纵连接，因此当存在于个体的细胞中时，编码序列将被表 达。
[0031] 术语〃恒定电流〃在本文中用于定义在递送至组织的电脉冲持续时间里，所述组 织或限定所述组织的细胞所接受或经历的电流。电脉冲由本文所述的电穿孔设备递送。由 于本文提供的电穿孔设备具有反馈元件，所述反馈元件优选具有即时反馈，因此所述电流 在电脉冲的持续时间里在所述组织中保持恒定安培值。反馈元件在脉冲持续时间里可测定 组织（或细胞）的电阻，并使电穿孔设备改变其电能输出（例如，增加电压），从而使同一 组织中的电流在整个电脉冲（微秒的级别）中和不同脉冲之间保持恒定。在一些实施方式 中，反馈元件包含控制器。
[0032] 术语〃反馈〃或〃电流反馈〃可以互换使用，并且表示所提供电穿孔设备的积极响 应，这包括测定电极间组织中的电流，并相应改变EP设备所递送的能量输出，从而保持恒 定水平的电流。这种恒定水平在开始脉冲顺序或电治疗之前由使用者预设定。优选的是， 反馈由电穿孔设备的电穿孔部件（例如控制器）完成，这是由于其中的电路能够连续监测 电极间组织中的电流，并将所监测到的电流（或组织中的电流）与预设定电流比较，和连续 进行能量输出调节从而使所监测到的电流保持预设定水平。在一些实施方式中，反馈回路 由于是模拟闭合回路反馈，因而是即时的。
[0033] 术语〃电穿孔〃、〃电通透化〃或〃电动增强〃 (〃EP〃）在本文可互换使用，是指使 用跨膜电场脉冲来引起生物膜中的显微通路（孔）；这些通路的存在可以使诸如质粒、寡核 苷酸、SiRNA、药物、离子和水等生物分子由细胞膜的一侧到达另一侧。
[0034] 术语"分散电流"在本文中用于限定由本文所述电穿孔设备的各针状电极阵列递 送的电流模式，其中该模式使接受电穿孔的组织的任何区域上与热压力相关的电穿孔的发 生最小化，或优选将其消除。
[0035] 本文所用术语〃反馈机制〃是指由软件或硬件（或固件）进行的过程，该过程接 受所需组织的阻抗（递送能量脉冲之前、过程中和/或之后），并将其与预设定值（优选电 流）进行比较，并调整递送的能量脉冲，从而取得预设定值。术语"阻抗"在本文中讨论反 馈机制时使用，可以根据欧姆定律将其转换为电流值，从而能够与预设定电流进行比较。在 优选实施方式中，"反馈机制"由模拟闭合回路电路进行。
[0036] 术语〃免疫应答〃在本文中用于表示宿主免疫系统的激活，例如响应于经由所提 供的DNA质粒疫苗而引入的黄病毒共有抗原的哺乳动物免疫系统的激活。免疫应答可以为 细胞应答形式和/或体液应答形式。
[0037] 术语〃共有的〃或〃共有序列〃在本文中用于表示合成核酸序列，或相应的多肽 序列，所述序列基于对黄病毒抗原多种亚型的比对分析而构建。共有黄病毒抗原包括西尼 罗河病毒（WNV)和日本脑炎病毒（JEV)的E蛋白的DIII域或组合了 2种序列的元件的嵌 合序列。
[0038] 本文所用术语〃片段〃表示编码多肽的核酸或其一部分，所述多肽能够引起哺乳 动物中的基本与共有DIII抗原中的至少一种的非片段相似的免疫应答。所述片段可以是 选自本发明的各种编码核苷酸序列中的至少一种的DNA片段，包括SEQ ID NO: 12、13和14。 DNA片段的长度可以为30个或更多个核苷酸、45个或更多个、60个或更多个、75个或更多 个、90个或更多个、120个或更多个、150个或更多个、180个或更多个、210个或更多个、240 个或更多个、270个或更多个、300个或更多个、360个或更多个或者400个或更多个核苷酸。 DNA片段可包含诸如IgE或IgG序列等免疫球蛋白前导序列的编码序列。
[0039] DNA片段可以小于10个核苷酸、小于20、小于30、小于40、小于50、小于60、小于 75、小于90、小于120、小于150、小于180、小于210、小于240、小于270、小于300、小于360 或小于400个核苷酸。
[0040] 〃片段〃还可以表示多肽片段，所述多肽片段能够引起哺乳动物中的基本与至少 一种DIII蛋白（或抗原）的非片段相似的免疫应答。片段可以是选自本发明的各种编码 多肽序列中的至少一种的多肽片段，包括SEQ ID N0:9、10和11。可以对多肽片段进行分析 从而将其与公用数据库提供的至少一种抗原性表位相联系。多肽DIII片段还可以包含诸 如IgE或IgG等免疫球蛋白前导序列的氨基酸序列。多肽片段的长度可以为30个或更多 个氨基酸、45个或更多个、60个或更多个、75个或更多个、90个或更多个、120个或更多个或 者130个或更多个氨基酸。
[0041] 多肽片段的长度可以小于10个氨基酸、小于20、小于30、小于40、小于50、小于 60、小于75、小于90、小于120或小于130个氨基酸。
[0042] 术语〃佐剂〃在本文中用于表示添加在本文所述DNA质粒疫苗中从而增强所需抗 原、优选为共有抗原的免疫原性的任何分子，所述抗原由DNA质粒编码并编码下述核酸序 列。
[0043] 术语〃亚型〃或〃血清型〃在本文中可互换使用，表示病毒或其中表位的遗传变 体，因此一个亚型以与不同亚型不同的方式被免疫系统识别，或者换而言之，一个亚型具有 与另一亚型不同的免疫原性特征。
[0044] 三种类型的DIII序列：共有JEV DIII、共有WNV DIII和嵌合序列JEV序列，该 嵌合序列中在相应位置引入的WNV DIII残基（表示为JW DIII或JEV/WN DIII或WN/JEV Dili) [16, 17]已显示是在抗WNV的中和抗体的诱导中的决定簇。所有这些序列在20个独 立株间是共有的。利用共有序列开发DNA疫苗是抗击传染病的最前沿技术之一 [22, 23]。 基于共有序列，制备合成的人密码子优化序列用于在该研究中进行免疫。
[0045] 编码核苷酸
[0046] 本发明的一个方面包括编码蛋白E的共有DIII域的分离核酸。这些核酸可以包括 核苷酸序列 ：（a)SEQIDN0:12、13或14;(b)编码氨基酸序列SEQIDN0 :9、10或ll的核苷 酸序列；或（c) (a)或（b)的互补物。在本发明的另一方面，提供了包含本文提供的分离核 酸的遗传构建体。在一些实施方式中，遗传构建体可包括Kozak序列GGT ACC GCC ACC(SEQ ID NO. 15)和/或选自IgG或IgE (优选IgE，更优选具有序列SEQ ID NO: 8的IgE)的一部 分的前导序列。
[0047] 共有DIII蛋白可以由共有DIII核酸、其变体或其片段编码。可以对共有DIII核 酸进行密码子优化和/或RNA优化。共有DIII核酸序列可含有前导序列。前导序列可以 在DIII编码序列的5'。由该序列编码的共有DIII蛋白可以含有N-末端前导部，和其后的 共有DIII蛋白。N-末端前导部可以为IgE或IgG。
[0048] 多肽/抗原
[0049] 本文提供了能够引起哺乳动物的免疫应答的抗原，所述免疫应答对抗一种或多种 黄病毒血清型、特别是西尼罗河病毒和日本脑炎病毒的各种血清型。所述抗原能够引起哺 乳动物的免疫应答，所述免疫应答对抗一种或多种黄病毒血清型，包括对抗一种或多种流 行株。所述抗原可以包含下述表位，所述表位使所述抗原作为可以诱导抗-黄病毒免疫应 答的免疫原特别有效。
[0050] 在本发明的一个方面，提供了包含作为共有DIII蛋白的氨基酸序列的多肽。所 述DIII蛋白可以含有：（a)SEQ ID N0:9、10或11 ;或（b) (a)的片段。共有DIII蛋白在其 N-末端还可以含有IgE或IgG前导氨基酸序列。IgE前导氨基酸序列可以如SEQ ID N0:7 所示。带有IgE前导序列的共有Dili蛋白可以具有氨基酸序列SEQ ID NO: 1、2或3,所述 序列还可以分别含有JEV Dili、WNV DIII或JW Dili。
[0051] 疫苗
[0052] 本发明的一些方面是能够在宿主中产生对抗多种WNV和JEV血清型的免疫应答的 DNA疫苗，所述疫苗包含：（a)包含启动子的遗传构建体，所述启动子与含有本文提供的分 离核酸的编码序列可操纵连接；和（b)药学上可接受的赋形剂；其中，所述遗传构建体能够 在宿主细胞中以有效引起免疫应答的数量表达蛋白E抗原的共有DIII域。
[0053] 在一些实施方式中，本发明的DNA疫苗包括具有为核酸分子基因表达所必需的调 控元件的遗传构建体。
[0054] 在本发明的一些实施方式中，DNA疫苗还可以含有佐剂。佐剂可选自：α -干扰素、 γ-干扰素、血小板来源的生长因子（PDGF)、TNFa、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子（EGF)、 皮肤T细胞俘获趋化因子（CTACK)、上皮胸腺表达趋化因子（TECK)、粘膜相关上皮趋化因子 (MEC)、IL-12、IL-15、MHC、⑶80、包含删除了信号序列并可选含有IgE信号肽的IL-15的 CD86、IL-12、IL-15、CTACK、TECK、血小板来源生长因子（PDGF)、TNFa、TNF β、GM-CSF、表皮 生长因子（EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、IL-28、MCP-l、MIP-la、 MIP-lp、IL-8、RANTES、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-I、MadCAM-I、 LFA-I、VLA-I、Mac-Ι、ρ150· 95、PECAM、ICAM-I、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、 IL-4、IL-18的突变体形式、⑶40、⑶40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经 生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF 受体、Fit、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、 AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶 ICE、Fos、c-jun、 Sp-I、Ap-I、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、失活 NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰 素响应基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK 配体、0x40、0x40 配体、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAPI、TAP2 和其功能性片段或其组合。还可以将疫苗与CTACK蛋白、TECK蛋白、MEC蛋白或其功能性片 段组合施用。
[0055] 在一些优选实施方式中，佐剂是IL-15以及一种或多种其他佐剂。
[0056] 遗传构建体
[0057] 本文提供了可包含编码DIII抗原的核酸的遗传构建体。该遗传构建体可存在于 细胞中，充当包含编码DIII抗原的核酸的染色体外分子，优选DNA质粒。该包含编码DIII 抗原的核酸的遗传构建体可以是含有着丝粒、端粒的线性小型染色体。该遗传构建体还可 以是重组病毒载体的基因组的一部分，所述重组病毒载体包括重组腺病毒、重组腺病毒相 关病毒和重组牛痘。遗传构建体可以是减毒活微生物中的遗传物质的一部分，或生活在细 胞中的重组微生物载体。遗传构建体可含有用于DIII核酸的基因表达的调控元件。调控 元件可以是启动子、增强子、起始密码子、终止密码子或聚腺苷酸化信号。编码目标蛋白或 免疫调节蛋白的序列的基因表达通常需要增强子。可以将这些元件可操纵地连接于编码所 需蛋白的序列，调控元件可以在所施用的个体中具有功能性。
[0058] 遗传构建体或载体还可以包含可操纵地连接于DIII编码序列的启动子。所述可 操纵地连接于DIII编码序列的启动子可以是来自猿病毒40(SV40)的启动子、小鼠乳腺肿 瘤病毒（MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒（HIV)启动子、例如牛免疫缺陷病毒（BIV)长末端 重复（LTR)启动子、莫洛尼病毒启动子、禽白血病病毒（ALV)启动子、巨细胞病毒（CMV)启 动子（例如CMV即早期启动子）、埃巴病毒（EBV)启动子或劳斯肉瘤病毒（RSV)启动子。 所述启动子还可以是诸如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌酸或人金属硫蛋白 (metalothionein)等人类基因的启动子。所述启动子还可以是组织特异性启动子，例如肌 肉或皮肤特异性启动子，所述启动子可以是天然的或合成的。这些启动子的实例在美国专 利申请公开号US20040175727中有所描述，将其内容整体并入本文。
[0059] 载体还可以包含聚腺苷酸化信号，所述聚腺苷酸化信号可以位于DIII编码序列 的下游。聚腺苷酸化信号可以是SV40聚腺苷酸化信号、LTR聚腺苷酸化信号、牛生长激素 (bGH)聚腺苷酸化信号、人生长激素（hGH)聚腺苷酸化信号或人β-球蛋白聚腺苷酸化信 号。SV40聚腺苷酸化信号可以是来自pCEP4载体（Invitrogen，San Dieg