dBioengineering,IBB) 的Cabral小组馈赠，葡萄牙里斯本AvenidaRoviscoPais)的MSC生长规程对XF细 胞培养规程进行了内部调整。MSC细胞生长在预先包被有无异种蛋白成分的附着因子 CELLStart?(Invitrogen，cat.A1014201)的SoloHill125 微米塑料珠上（SoloHill EngineeringInc.，cat.P102-1521)。以25, 000细胞/ml接种细胞。细胞培养物起始于 10〇1111转瓶中（来自13611(3〇61388，111(3.的136丨丨(^ <转瓶，带有90。桨（通用桨）和磁 力搅拌棒）并且生长与传统细胞培养基（DMEM+10%FBS)进行比较。每2-3天补充50% 完全介质。图1A、1B、1C和1D描述了这些超过14天的分析的结果，生长在微载体上的骨 髓来源MSC至少和生长在二维培养中的细胞是不相上下的。使用无动物源性的分离试剂 TrypLEdnvitrogen，cat. 12604039)从微载体收获细胞。使用台盼蓝排除法并使用ViCell 计数器确定细胞数目和活力。和小规模转瓶系统中的DMEM+FBS对照介质相比，XF配方中 的细胞扩增约是15倍（图1E)。
[0045] 在500毫升DasGIP搅拌罐生物反应器（400毫升工作体积）中，使用相同的 预先包被有无异种蛋白成分的附着因子CELLStart?的SoloHill塑料微载体珠以及 StemPr〇KMSCSFM无异种蛋白成分介质验证上述小规模实验。过程参数控制如下： pH-7. 2、主动栗送的二氧化碳在5 %、温度-37°C、以40rpm搅拌、受控的溶解氧（大气或 20% )。每2-3天给培养物补充50%的新鲜介质。如图2A-D所示，无异种蛋白成分介质使 得细胞扩增能够从37, 500细胞/ml的初始接种密度到达约262, 000细胞/ml。这表示，对 于生物反应器运行而言，总共~105百万个细胞。该数据显示，在生物反应器中使用XF介 质和微载体系统，使用无血清微载体扩增MSC的可行性。还核实了更进一步的大规模体积。
[0046] 实施例2 :扩增后MSC细胞的功能分析（细胞染色方法来自Chase等人，StemCell Research&Therapy2010,1:8)
[0047] 进一步分析了MSC细胞的细胞生长动力学、细胞表型、葡萄糖消耗的介质消耗分 析以及乳酸生产（分别为图3A和3B)，以及生物反应器中培养后功能性。第5-11天之间 葡萄糖被迅速消耗。介质更换或葡萄糖补充是必要的。通过其沿着特定分化通路（例如成 骨、成软骨（chondrogenic)或成脂谱系）进行分化的能力测量所获得的MSC的这些特征。
[0048] 为了评价这一点，使用无动物源性分离试剂TrypLE(Invitrogen，cat. 12604039) 从微载体收获细胞。将MSC设置于对于成骨、成软骨和成脂分化而言标准的培养条件下。 根据制造商的规程将细胞接种于12孔板中，并使用商业可获得的试剂盒（Invitrogen，人 间充质干细胞（hMSC)分化试剂盒：骨生成试剂盒cat.A10072-01 ;脂肪生成试剂盒cat. A10070-01)进行诱导而沿着脂肪生成和骨生成通路进行分化。分化过程中，每3-4天进行 完全介质的更换。14天之后，通过使用谱系特异性生物染料监测培养物的分化（图4，A-F)。 染色后，用0.INHC1洗涤培养物并观察。为了监测成脂分化，用油红O(Sigma) (60%异丙醇 中的0.5%油红0溶液）染培养物，用蒸馏水洗涤，并观察（图4,A-C)。对于成软骨分化， 用4%甲醛固定微团（micromass)颗粒培养物，并用1 %阿尔辛蓝（AlcianBlue) (Sigma) 染色（未显示）。对于骨生成，21天分化条件之后，用茜素红染料染细胞（图4，D-F)。从生 物反应器收获的MSC分化为成骨、成软骨和成脂谱系，并在微载体上稳定了 14天（2周）。
[0049] 实施例3 :采用流式细胞术的来自二维和微载体培养的MSC的部分特征（规程来 自Chase等人，StemCellResearch&Therapy2010, 1:8)
[0050] 使用TrypLE?Express(Invitrogen)收获微载体培养或组织培养板（二维）上 的、在含血清介质（SCM)或无血清介质（SFM)中扩增的MSC，用补充有5%FBS的DPBS(无 Ca2+/Mg2+)进行洗涤，并用以下抗体染色：CDllb(非缀合的，克隆V頂12)、CD34-APC(克隆 581)、CD45-AF405 (克隆HI30)、CD44-PE(克隆MEM-85)、CD105-APC(克隆SN6)(均来自 Invitrogen) ;CD90(克隆5E10)-阳性MSC细胞表面标志物（图6中所示）、CD73-PE(克 隆AD2)(二者都来自BDBiosciences);并且其中使用未缀合的第一抗体的，使用 AlexaFluor? 488抗-小鼠抗体（Invitrogen)。为了设置背景荧光水平，使用未染色的和 /或匹配的同种型对照。
[0051] 这些数据表明，使用微载体大规模培养MSC样细胞是可行的、成本有效的并可以 在封闭系统中进行，具有更高程度的过程控制和最小的空间占用。在无异种蛋白成分条件 下的微载体扩增是传统二维细胞培养方法的可行替代。无动物源性微载体系统（包括没有 人类蛋白质的情况）的进一步开发正在进行过程中。此外，特异性MSC生长因子和营养补 料浓缩物可以纳入生物反应器系统中来提供高效的流加式（fed-batch)生产模式。
【主权项】
1. 一种用于体外培养分离的干细胞的无血清且无异种蛋白成分的细胞培养系统，其包 括： i) 无血清的细胞培养基，其能够在悬浮培养中培养分离的干细胞；以及 ii) 预先包被有无异种蛋白成分的附着基质的微载体珠。2. 根据权利要求1所述的用于体外培养分离的干细胞的无血清且无异种蛋白成分的 细胞培养系统，其中所述干细胞是间充质干细胞。3. 根据权利要求2所述的用于体外培养分离的干细胞的无血清且无异种蛋白成分的 细胞培养系统，其中所述细胞附着基质是CELLStart?。4. 根据权利要求2所述的用于体外培养分离的干细胞的无血清且无异种蛋白成分的 细胞培养系统，其中受控条件是： pH 为大约 6. 5-7. 5、 大约3-10%主动栗送的C02、 温度为大约30-40 °C、 以大约30_45rpm搅拌、 溶解O2为大约3-20 %大气压力。5. 根据权利要求2所述的用于体外培养分离的干细胞的无血清且无异种蛋白成分的 细胞培养系统，其中所述间充质干细胞是脂肪细胞来源的干细胞。6. 根据权利要求2所述的用于体外培养分离的干细胞的无血清且无异种蛋白成分的 细胞培养系统，其中所述间充质干细胞源自自体或同种异体供体。7. 根据权利要求1所述的用于体外培养分离的干细胞的无血清且无异种蛋白成分的 细胞培养系统，其中所述干细胞是诱导性多能干细胞。8. -种组合物，其包括： i) 无血清的间充质细胞培养基； ii) 微载体珠； iii) 无异种蛋白成分的细胞附着基质；以及 iv) 间充质干细胞。9. 根据权利要求8所述的组合物，其中所述细胞附着基质是CELLStart ?。10. 根据权利要求8所述的组合物，其中所述间充质干细胞是脂肪细胞来源的干细胞。11. 根据权利要求8所述的组合物，其中所述间充质干细胞源自自体或同种异体供体。12. -种培养间充质干细胞的系统，其包括： i) 无血清的间充质细胞培养基； ii) 微载体珠； iii) 无异种蛋白成分的细胞附着基质；以及 iv) 间充质干细胞， 其中在以下受控条件下培养MSC : pH 为大约 6. 9-7. 5、 大约3-10%主动栗送的C02、 温度为大约30-40 °C、 以大约30_45rpm搅拌、 溶解O2为大约3-20 %大气压力。13. 根据权利要求12所述的培养间充质干细胞的系统，其中所述MSC获自骨髓、血液、 皮肤、脐带血、牙根或软骨膜。14. 根据权利要求12所述的培养间充质干细胞的系统，其中在第2天所述MSC的生长 和扩增至大于〇. I X IO5细胞/ml的密度。15. 根据权利要求12所述的培养间充质干细胞的系统，其中在第4天所述MSC的扩增 至大约4 X IO6细胞/ml的密度。16. 根据权利要求12所述的培养间充质干细胞的系统，其中在第7天所述MSC的扩增 至大约I X IO7细胞/ml的密度。17. 根据权利要求12所述的培养间充质干细胞的系统，其中在第14天所述MSC的扩增 至大约2. 4 X IO7细胞/ml的密度。18. 根据权利要求12所述的培养间充质干细胞的系统，其中所述MSC维持它的多向中 胚层分化潜能至第14天。
【专利摘要】本发明公开了用于细胞的生物反应器放大的细胞培养系统。具体地，本发明涉及在大规模的遵守GMP的条件下，使用满足GMP要求的介质和试剂来培养干细胞(例如MSC)同时保持干性以用于有效的下游治疗用途的方法，所述用途包括但不限于干细胞疗法、产品的生产，所述产品例如获自这种干细胞的有益因子、重组蛋白等。
【IPC分类】C12N5/0775
【公开号】CN105112361
【申请号】CN201510477527
【发明人】A·坎贝尔, L·蔡斯, M·维穆里
【申请人】生命技术公司
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2011年9月2日
【公告号】CN103153318A, CN103153318B, EP2611452A2, US20130164269, WO2012031263A2, WO2012031263A3