养基：Peptone 10g，Yeast extract 5g，NaCl 10g，加蒸馈水至 1000ml，pH自然(约为7)。固体培养基在此基础上加2.0% (w/v)琼脂。
[0059] 说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验 指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书 进行。
[0060] 实施例1滇金丝猴粪便微生物宏基因组DNA的提取
[0061 ] 采用QIAamp DNA Stool Mini Kit(QIAGEN)试剂盒提取粪便微生物宏基因组DNA， 提取方法参看试剂盒说明书并做了改动，具体操作如下：
[0062] 1)取出粪便样品，采用灭菌水清洗2次，称取0.2g粪便，置于5mL灭菌的离心管中。
[0063] 2)加 ASL buffer 1.4mL，震荡涡旋至充分混匀，70°C孵育5min后震荡15s。
[0064] 3)12 OOOrpm离心lmin，转移上清液到干净的离心管中。
[0065] 4)加入1片Inhibit EX Tablet，充分混匀后室温静止2min，确保Inhibit EX基质 吸附完抑制剂，12 000r pm离心5m i η。
[0066] 5)转移上清至新的离心管，12 OOOrpm离心5min。
[0067] 6)转移上清至新的离心管，加入15μ1蛋白酶K，和200μ1的buffer AL，混匀后70°C 孵育lOmin。
[0068] 7)加200μ1的无水乙醇，混匀后将液体转移到QIAamp吸附柱，12000g离心2min。
[0069] 8)用500μ1 的AW1 buffer清洗柱子，12 OOOrpm离心2min。
[0070] 9)加入500μ1的AW2 buffer，12 OOOrpm离心2min后，转移柱子到新的离心管。
[0071 ] 10)加30μ1 buffer AE，室温放置5min，12 OOOrpm离心2min。
[0072]获得的微生物宏基因组DNA置于-20 °C保存备用。
[0073] 实施例2木聚糖降解酶基因 XynRBM的克隆
[0074]用超声打断仪Biorupter将5yg实施例1获得的微生物宏基因组DNA打断为400~ 600bp的片段，用Genomic DNA Clean&Concentration试剂盒对打断的DNA片段进行纯化，纯 化后用TureseqTM DNA Sample Preparation Kit进行DNA片段的末端补平、3'端加 A碱基和 加接头、及DNA片段的PCR扩增（操作按试剂盒说明书进行）。用Hiseq基因组测序仪 (Illumima公司）对上述制备好的文库进行基因组测序。
[0075] 基因组测序得到的数据经功能注释和本地BLAST比对，得到木聚糖降解酶基因 XynRBM，该基因序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0076]实施例3:重组多功能木聚糖降解酶XynRBM的制备
[0077]以SEQ ID N0.3所示的上游引物和SEQ ID N0.4所示的下游引物为引物对，实施例 1获得的微生物宏基因组DNA为模板，进行PCR扩增，其中，上游引物的序列为：5' ATGAACGGAAGAACTTTAAAAAC3 ' ；下游引物的序列为：5 ' AATTATAAITTCAAGCAGITTATC3 '。PCR反 应参数为:94°C预变性5min;94°C变性30S，65°C退火30S，72°C延伸lmin30S，共15个循环;94 。(:变性30S，50°C退火30S，72°C延伸lmin30S，共25个循环；72°C扩增后延伸7min;其中从65 °(：到50°(：每个循环温度下降HPCR结果得到目的基因 XynRBM，并在该基因3'端引入突出 的A碱基。
[0078] 将基因 XynRBM和表达载体pEasy_E2通过T-A方式相连接，获得含有XynRBM的重组 表达质粒pEasy-E2-XynRBM，将pEasy-E2-XynRBM转化大肠杆菌BL21 (DE3)，获得重组大肠杆 菌菌株 BL21 (DE3) /XynRBM。
[0079] 取含有重组质粒pEasy-E2-XynRBM的重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/XynRBM和只含 有pEasy-E2( + )空质粒的BL21(DE3)菌株，以0.1%的接种量接种于LB(含100yg mL-Imp)培 养液中，37 °C快速振荡16h。然后将此活化的菌液以1 %接种量接种到新鲜的LB (含100yg mL-Imp)培养液中，快速振荡培养约2~3h(0D600达到0.6~1.0)后，加入终浓度0.5mM的 IPTG进行诱导，于20°C继续振荡培养约20h<a2000rpm离心5min，收集菌体。用适量的 pH7. OMcI lvaine缓冲液悬浮菌体后，于低温水浴下超声波破碎菌体，破碎后经13，OOOrpm离 心10min，吸取上清进行SDS-PAGE分析，结果参见图1，图1为在大肠杆菌中表达的重组多功 能木聚糖降解酶XynRBM的SDS-PAGE分析，其中，Μ:蛋白质Marker，1:含有载体pEasy-E2 (+) 的大肠杆菌菌体破碎上清液;2:未纯化的重组多功能木聚糖降解酶XynRBM粗酶液;3:500mM 咪唑洗脱亲和于Nickel-NTA Agarose中的重组多功能木聚糖降解酶XynRBM;。结果表明，在 大约47KDa的位置，含有载体pEasy-E2( + )的大肠杆菌菌体破碎上清液无条带，而含有重组 载体的pEasy-E2-XynRBM大肠杆菌菌体破碎上清液有明显条带，经500mM的咪唑洗脱后，产 物为单一条带。同时，含有载体pEasy_E2( + )的大肠杆菌菌体破碎上清液无木聚糖酶酶活， 而含有重组载体pEasy-E2-XynRBM的大肠杆菌菌体破碎上清液有木聚糖酶酶活。以上结果 说明重组多功能木聚糖降解酶XynRBM在大肠杆菌中得到了表达。
[0080]实施例4:纯化的重组多功能木聚糖降解酶XynRBM的性质测定 [0081 ] 1、纯化的重组多功能木聚糖降解酶XynRBM的活性分析
[0082] 活性测定方法采用3,5 -二硝基水杨酸(DNS)法:将底物溶于0.1M缓冲液中，使其 终浓度为〇. 5 % (w/v);反应体系含20yL适量稀释的酶液，180yL底物;底物在反应温度下预 热5min后，加入酶液后再反应lOmin，然后加300yL DNS终止反应，沸水煮5min，冷却至室温 后在540nm波长下测定0D值。1个酶活单位(U)定义为在一定的条件下每分钟分解底物产生1 μπιο?还原糖（以木糖计)所需的酶量。对底物4-Nitrophenyl-0-D_xylopyranoside、
[0083] 4-Nitrophenyl-a-L-arabinofuranoside、4-Nitrophenyl-a-D-glucopyranoside、4_Nitrophenyl-a-D-galactopyranoside 的测定米用 pNP 法：将底物溶于 0.1M缓冲液中，使其终浓度为2mM;反应体系含50yL酶液，450yL的2mM底物;底物在反应温度 下预热5min后，加入酶液再反应lOmin，然后加2mLlM Na2C03终止反应，冷却至室温后在 405nm波长下测定释放出的pNP; 1个酶活单位(U)定义为每分钟分解底物产生Ιμπιο? pNP所 需的酶量。
[0084] 2、纯化的重组木聚糖降解酶XynRBM的pH活性和pH稳定性测定：
[0085] 酶的最适pH测定:将木聚糖降解酶XynRBM在37°C下和0· 1M pH3·0-12·0的缓冲液 中进行酶促反应。酶的pH稳定性测定:将酶液置于0.1M pH3.0-12.0的缓冲液中，在37°C下 处理lh，然后在pH6.5及37°C下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。缓冲液为：0.1M McIlvaine(pH3.0-8·0)，0·1M Tris/HCl(pH8.0-9.0)和0.1M glycine/Na0H(pH9·0-12·0)〇 以山毛榉木聚糖为底物，反应lOmin，测定纯化的XynRBM的酶学性质，结果参见图2和图3,图 2为纯化的重组多功能木聚糖降解酶XynRBM的pH活性;图3为纯化的重组多功能木聚糖降解 酶XynRBM的pH稳定性。结果表明：XynRBM的最适pH为6.5，在pH5.0-7.5之间可以保持82 %以 上的酶活性;在PH5.0~10.0的缓冲液处理lh，酶活力剩余74%以上。
[0086] 3、纯化的重组多功能木聚糖降解酶XynRBM的热活性及热稳定性测定：
[0087] 酶的最适温度测定:在pH6.5的缓冲液中，于0-70 °C下进行酶促反应。酶的热稳定 性测定:将同样酶量的酶液置于37°C、45°C、50°C、55°C和60°C中，处理Ο-lh后，在pH6.5及50 °C进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以山毛榉木聚糖为