一种壳聚糖酶突变体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因遗传改造技术领域，具体涉及一种壳聚糖酶突变体。
【背景技术】
[0002] 壳寡糖是甲壳质在脱乙酰后形成的壳聚糖的基础上进一步水解而得到的一种天 然生物高分子，是生物界中大量存在的唯一的一种碱性多糖。壳寡糖其独特的功能性质使 其在废水处理、食品工业、纺织、化工、日用化学品、农业、生物工程和医药等领域具有广泛 的用途。我国年产甲壳质及衍生物3-4万吨，产值几十亿元。但是我国甲壳质生物技术产业 以粗加工以及原料中间体销售为主，在产业中处于弱势的甲壳质资源主要是作为壳聚糖原 料低价出口或作为低附加值中间体进行开发出口。目前限制甲壳质资源开发利用的关键因 素是主要集中在以下两个方面:一是传统的甲壳质原料的化学法加工工艺技术粗放，对环 境的二次或三次污染严重，导致甲壳质生产技术一直不能形成工业化生产。二是现代的生 物酶法制备壳寡糖已经成为国际大趋势，但是目前商品化的特异性水解壳聚糖的酶仍被丹 麦的诺维信以及日本的杰能科公司所垄断，昂贵的价格成本以及酶自身性质的不稳定限制 了甲壳质以及壳聚糖的开发。
[0003] 能够专一性水解壳聚糖的酶主要存在于细菌和真菌细胞中，主要包括壳聚糖酶和 溶菌酶。壳聚糖酶EAGl(GenBank登录号AB008788)是来自芽孢杆菌Bacillus ehimensis的 一种多糖水解酶。它不仅能将壳聚糖分子中的糖苷键切断，将其水解成不同分子量的壳寡 糖，而且在有机溶剂与金属离子中依然保留着良好的催化活性，是一种极具应用前景的工 业用酶。然而，EAG1的热稳定性较差，50°C时其活性急剧下降。因此，有必要提高壳聚糖酶 EAG1的稳定性，提高其在高温条件下的催化效率。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于克服上述现有技术中存在的不足，对壳聚糖酶EAGl(GenBank登 录号AB008788)进行改造，获得了一种新的壳聚糖酶突变体。
[0005] 本发明提供的壳聚糖酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO: 1;
[0006] 编码上述壳聚糖酶突变体的基因，其一种核苷酸序列为SEQ ID N0:2;
[0007] 本发明另一个方面还保护携带有上述编码基因的重组表达载体；
[0008] 本发明再一个方面保护转化/转染有上述重组表达载体的宿主菌
[0009] 作为优选，所述的宿主菌为毕赤酵母。
[0010] 本发明的该突变体与壳聚糖酶EAG1相比，具有更优良的热稳定性与更高的催化效 率，从而具有更广泛的应用前景。
【附图说明】
[0011 ]图1:壳聚糖酶EAG1与EAG1突变体的氨基酸序列比对结果图；
[0012] 图2:壳聚糖酶EAG1突变体的SDS-PAGE电泳图；
[0013] 图3:壳聚糖酶EAG1突变体的热稳定性影响图；
[0014] 图4:壳聚糖酶EAG1突变体的热灭活实验图。
【具体实施方式】
[0015] 下面结合实施例对本发明进行详细的描述
[0016] 实施例1:壳聚糖酶EAG1突变体基因的获得
[0017] 对壳聚糖酶EAGl(GenBank登录号AB008788)进行突变，具体步骤如下：
[0018]①人工合成一段编码7个氨基酸的且富含甘氨酸的核酸片段：
[0019] 5'-ggaggaggatccggaggagga-3';该片段编码的氨基酸为-GGGSGGG-
[0020]②采用PCR扩增的方法将上述序列引入EAG1基因；其中正向引物为 [0021 ] 57 -ggaggaggatccggaggaggaatgcatatgtccaatgcgaaaccat-37 入片段），反向引物为5' -cttcatttcccagttcgtgacttgag-3'，模板为EAG1 基因。
[0022]将上述扩增后的含有插入片段的EAG1基因 16°C下用T4DNA连接酶连接12小时。反 应体系如下： EAG1突变基因 2 |iL T4 DNA ligase 1 uL
[0023] 1〇χΤ4 DNA ligase buffer 1 pL. 双蒸水
[0024] ③将上述连接成环的EAG1突变基因进行酶切开环。所用酶为Dnasel，为保证整个 基因环只产生一个切口，所用Dnasel的量为每30yg加入1U Dnasel。
[0025] 反应体系如下： _EAG1突变环状基因 2 μL UOpig) Dnasel 1 liL (1U)
[0026] 1〇χΤ4 DNA ligase buffer 1 μL 双蒸水 6 pL
[0027] 将开环后的EAG1突变基因通过l%(w/v)琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收900-1000 之间的DNA片段。
[0028] ④设计二次扩增引物，其中正向引物为5' -atccggtacagcgtcgaacaagcgc-3'，反向 引物为5' -atacacgttatagaaggtttcccaca-3'。以上述琼脂糖凝胶电泳回收的DNA片段为模 板，采用PCR的方法扩增获得EAG1突变基因。
[0029] 反应体系（50μ1)如下： !〇χ buffer 5.0 μL dN'TPs (2.5 mM) 4.0'uL 正向引物（50 mM) 1,0 μL
[0030] 反向引物（50 mM) 1.0 μΕ Taq DNA polymerase 0.5 μL? 模板 1.0 μL^ Η20 37.5 μL
[0031] 最终获得的壳聚糖酶EAG1突变体的基因序列，该序列含有927个碱基(SEQ ID Ν0: 2)，编码309个氨基酸（SEQ ID NO: 1)，它与EAG1相比，不仅蛋白的一、二级结构排布顺序不 同，而且增添了 一段富含甘氨酸的柔性序列（图1)。
[0032] 实施例2壳聚糖酶EAG1突变体基因的表达与蛋白纯化
[0033] 将实施例1得到的壳聚糖酶EAG1突变体基因与表达载体pIC9K连接通过电转化的 方法转入毕赤酵母GS115中。电穿孔转化电击条件：电压：1500V;电阻:400 Ω ;电容:25yF;脉 冲时间：10mS;l-2次电击。
[0034] 将含有突变基因的转化子接入到BMGY液体培养基中，250-300rpm，28°C培养0D600 至12-16之间时；3000rpm，离心5分钟，弃上清，收集细胞转移到20mL BMMH液体培养基中， 20mLBMMY需使用100mL摇瓶配置，保证一定的通气量，28°C继续培养;每隔24小时在培养基 中加入100 %甲醇至终浓度为0.5 %。培养96小时，将发酵上清液离心，用lOKDa超滤膜浓缩， 经离子交换柱与分子筛进行纯化，得到了电泳纯的EAG1突变体样品。
[0035]实施例3:壳聚糖酶EAG1突变体的酶学性质 [0036]①壳聚糖酶EAG1突变体的分子量
[0037]将纯化后的EAG1突变体样品进行不连续十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE) 凝胶电泳，结果如图2所示。通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测为一条电泳带，根据已知分 子量的标准蛋白质SDS-PAGE电泳图谱进行比较，EAG1突变体的分子量约为34000道尔顿 (34kDa)，该酶为单体蛋白。
[0038]②纯化后EAG1突变体的热稳定性与50°C下半衰期
[0039]将纯化后的EAG1突变体分别置于40-60°C范围内孵育30分钟，随后转移至冰上冷 却5分钟，37°C条件下测定残余的壳聚糖酶活力，结果见图3AAG1突变体的热稳定性与EAG1 相比有了明显的提高。50°C下的酶活性保持在81%以上。
[0040] 将纯化后的EAG1突变体置于50°C孵育0-80分钟，随后转移至冰上冷却5分钟，37度 条件下测定残余的壳聚糖酶活力，结果见图4。50°(：下EAG1突变体的半衰期明显提高，EAG1 在50°C下保温10分钟，酶活力下降了50%，保温50分钟后酶活力下降了95%』AG1突变体50 °C下半衰期提高到70分钟，比EAG1提高了 7倍。
[0041]③壳聚糖酶的活力测定：
[0042]壳聚糖酶的活力测定采用二硝基水杨酸(DNS)方法。酶活单位定义：1U表示在上述 条件下每分钟释放lymol还原糖所需要的酶量。
[0043] 为测定壳聚糖酶EAG1突变体对壳聚糖的Km和Vmax，将0.5mL不同浓度的壳聚糖溶 液(5、7.5、10、15、20mg/mL)分别与Ο. lmL壳聚糖酶EAG1突变体(最终酶浓度5. OU/mL)混合。 37 °C反应lOmin，加入4 · OmL 10 % TCA溶液终止反应。根据双倒数作图法(Lineweaver-Burk) 以1 /[S]为横坐标1 /v为纵坐标作图，直线的的斜率为Km/Vmax，截距为1 /Vmax，计算出动力 学常数Km和最大反应速度Vmax(表1)。与EAG1相比，EAG1突变体的最大反应速度(Vmax)与催 化效率(Kcat/Km)分别提高了 142%与203%。
[0044] 表1 :EAG1与EAG1突变体的动力学参数表
[0045]
[0046] 结果表明壳聚糖酶EAG1突变体特异性强，可以以内切方式有效的打断壳聚糖中的 β_1，4糖苷键。每克壳聚糖添加1.0U单位的EAG1突变体，45°C下水解4个小时，可以将壳聚糖 完全分解成聚合度2-8糖的壳寡糖，水解率达到95%以上。
【主权项】
1. 一种壳聚糖酶突变体，其特征在于，所述的突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO: 1。2. -种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1所述的壳聚糖酶突变体。3. 如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQ ID N0:2。4. 一种重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体携带有权利要求2或3所述的 基因。5. -种重组菌，其特征在于，所述的重组菌为转化/转染有权利要求4所述的重组表达 载体的宿主菌。6. 如权利要求5所述的重组菌，其特征在于，所述的宿主菌为毕赤酵母。
【专利摘要】本发明提供了一种壳聚糖酶EAG1突变体，其氨基酸序列为SEQ？ID？NO:1。本发明的该突变体与壳聚糖酶EAG1相比，具有更优良的热稳定性与更高的催化效率，对壳聚糖具有快速分解能力。通过对含有突变体基因的酵母工程菌的高效异源表达，可实现壳聚糖酶EAG1突变体的规模化制备。
【IPC分类】C12N1/19, C12R1/84, C12N9/42, C12N15/81, C12N15/56
【公开号】CN105602921
【申请号】CN201610212888
【发明人】盛军, 沙珍霞, 郑媛, 纪晓峰, 王致鹏
【申请人】中国水产科学研究院黄海水产研究所
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2016年4月7日