专利名称：一种高产α-葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株的筛选方法
技术领域：
本发明属于微生物诱变筛选技术领域，具体涉及一种高产α “葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株的高通量筛选方法。
背景技术：
α -葡萄糖苷酶(α -glucosidase E C 3. 2. 1. 20)是水解酶类，属于键专一性酶， 它可专一性地切开糖类底物分子中非还原端的α-1，4糖苷键，个别种类的α-葡萄糖苷酶可以作用于蔗糖的α-1，2糖苷键，释放出葡萄糖。因此，一般来说，α-葡萄糖苷酶对底物要求不甚严格，具有广泛的底物专一性。在低聚异麦芽糖的生产中，利用α-葡萄糖苷酶的水解作用和α-葡萄糖苷转移酶的转苷作用是生产低聚异麦芽糖的关键。将α-葡萄糖苷酶和葡萄糖氧化酶共固定化后制成生物传感器可快速高效检测麦芽糖，从而应用于食品成分分析，医学诊断和环境分析等方面。因此α-葡萄糖苷酶倍受国内外食品工业界的重视。α-葡萄糖苷酶大多属于微生物酶，生物细胞产生各种酶的总量很多，但每一种酶的含量很低。目前，国外生产的α-葡萄糖苷酶大部分为纯酶，国内研究主要以粗酶液为主，而且国内所用菌株产酶能力也较弱，因此选育高产菌株非常必要。诱变筛选过程中由于正突变的几率很低，要在筛选过程中避免错筛和漏筛，就需要建立快速高效准确的筛选方法。而原有方法存在灵敏度差，底物价格昂贵，反应时间较长等因素，制约了其在大规模筛选高产α-葡萄糖苷酶黑曲霉菌株方面的应用。而本发明在 α -D-葡萄糖还原端设计结合上邻甲氧基苯基基团合成邻甲氧基苯基_ α -D-葡萄糖苷，并以该化合物作为诱变筛选时酶分解的底物，达到了准确快速高通量筛选的目的。
发明内容
本发明提供了一种高产α-葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株的筛选方法，其特征在于， 依次包括以下步骤(1)挑出400-600株经紫外诱变的黑曲霉单菌落；(2)初筛；(3)复筛； (4)摇瓶验证实验；其中，使用邻甲氧基苯基_α-D-葡萄糖苷作为初筛、复筛中诱变筛选时酶分解反应的底物，所述的邻甲氧基苯基-a-D-葡萄糖苷如结构式⑴所示
权利要求
1.一种高产α-葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株的筛选方法，其特征在于，依次包括以下步骤(1)挑选400-600株经紫外诱变的黑曲霉单菌落；(2)初筛；(3)复筛；(4)摇瓶验证实验；其中，以邻甲基苯基-a-D-葡萄糖苷作为所述初筛、复筛中诱变筛选时酶分解反应的底物，所述邻甲基苯基-a-D-葡萄糖苷如结构式(I)所示
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述底物邻甲氧基苯基_α-D-葡萄糖苷的合成路线为二环己基碳二亚胺在吡啶催化下与羧酸作用产生酰化活性中间体，α-D-葡萄糖经该中间体乙酰化，与邻甲氧基苯酚缩合，然后以甲醇钠水解制得底物。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)依次包括以下步骤a)对步骤(1)挑出的单菌落采用96孔板30-32°C培养55_72h，装液量为200-270μ L， 同时以未经诱变的菌株做对照；b)向96孔板中移入10-20μ L发酵液；加入0. 1-0. 25 %的底物邻甲氧基苯基-α -D-葡萄糖苷 40-60 μ L，30-32°C温浴 10_15min 后，加入 80-100 μ L 2. 5-3. OmoL/L 的 NaOH 溶液终止反应；向对照组中移入10-20 μ L发酵液，并加入80-100 μ L同浓度NaOH溶液，温浴 10-15min后再加入所述底物；c)取100-120μ L重氮盐溶液加入酶反应体系中，混勻，室温显色2-5min后，于450nm 处酶标仪测定，同时以蒸馏水为空白对照，测定发酵后各发酵液600nm处的吸光值。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤a)中96孔板培养的培养基包括麦芽浸粉 2. 5-3. 5g/L，玉米浆 3. 2-4. 5g/L，K2HPO4O. 15-0. 25g/L，KH2PO4O. 3-0. 45g/L， MgSO4 · 7Η200· 010-0. 025g/L, NH4NO3O. 3-0. 6g/L,培养基 pH 5. 0-6. 0。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤b)中发酵液的成分中含有α-葡萄糖苷酶。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤c)中重氮盐溶液制备过程为取 0. 2-0. 35g/L NaN0280-110mL，然后加入 3moL/L 的 HCL 4. 5-6. 5mL，30_32°C温浴 4_6min，加入 50g/I 的苯胺 8-12mL，30-32°C反应 5_8min。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)是对初筛得到的高产菌株进行试管复筛；所述复筛是以未经诱变的菌株为对照。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)是对复筛得到的高产菌株进行摇瓶发酵验证实验；所述摇瓶发酵验证实验是以未经诱变的菌株为对照。
全文摘要
本发明公开一种高产α-葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株的筛选方法，其特征在于，依次包括以下步骤(1)挑出黑曲霉菌株经紫外诱变的单菌落；(2)初筛；(3)复筛；(4)摇瓶验证实验；其中，使用邻甲氧基苯基-α-D-葡萄糖苷作为初筛、复筛中诱变筛选时酶分解反应的底物。本发明具有快速准确且高通量筛选α-葡萄糖苷酶黑曲霉菌株的优点。
文档编号C12N1/14GK102168023SQ20111002511
公开日2011年8月31日 申请日期2011年1月24日 优先权日2011年1月24日
发明者常忠义, 步国建, 牛延宁, 陈艳娟, 韦妮, 高红亮 申请人:上海东圣食品有限公司, 华东师范大学