葡萄糖苷转移酶生产菌株的酶联免疫筛选、发酵制备及应用的制作方法

专利名称：葡萄糖苷转移酶生产菌株的酶联免疫筛选、发酵制备及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及发酵领域，更具体地涉及葡萄糖苷转移酶(Alpha-GTase)生产菌株的 酶联免疫筛选、发酵制备及其在高效催化合成异麦芽低聚糖中的应用。
背景技术：
葡萄糖苷转移酶(Transglucosidase，EC2. 4. 1. 24，alpha-GTase)是一种 a -D 葡 萄糖苷酶，能水解麦芽糖生成葡萄糖，也可专一地进行葡萄糖苷键的转移反应，是生产异麦 芽低聚糖的必需酶制剂之一，由麦芽糖生成带有a _1，6键的异麦芽糖、潘糖等非发酵性低 聚糖。近年来发现异麦芽糖、潘糖等低分子量低聚糖是一种很好的双岐因子，摄人后不 被人体消化吸收，也不易被大肠中的多数腐败细菌所利用，却能作为双歧杆菌的碳源而被 利用。因此作为一种功能性食品原料，异麦芽低聚糖已被广泛用在各种食品的制造，居各种 功能性低聚糖之首。目前已经有以淀粉或麦芽糖为原料，通过酶法生产异麦芽低聚糖的工艺。然而，目 前的生产工艺存在转化率较低，一般在30% -45%。为了提高转化率，需要获得高纯度的 转化活性较高的异麦芽低聚糖，也需要筛选获得相应的高活性的葡萄糖苷转移酶的生产菌 株。从工业化来看，虽然我国异麦芽糖产量很高，葡萄糖苷转移酶的用量很大，但是没 有工业化，目前该酶完全依赖进口。虽然有为数不少的菌株都有产生葡萄糖苷转移酶的能 力，然而人们并不清楚何种菌所产生的葡萄糖苷转移酶的活性较高。目前，国内外常见的产酶菌株的筛选方法大多根据酶活的多少，而葡萄糖苷转移 酶活力的测定多数是依据生成葡萄糖的量而非转低聚糖的量作为酶活高低的依据，而研究 表明以麦芽糖为底物的水解能力，并不能正确反映转苷能力，用这种方法筛选得到的菌株 往往酶活高，但低聚糖的转化率反而低。另一种筛选方法是采用HPLC方法，根据生成的异麦芽糖、潘糖等低聚糖的量来判 定酶活高低，则更加科学和准确，但是样品量多，花费时间多。换言之，测定较为繁锁且耗 时，不适合大规模或高通量的筛选。综上所述，本领域迫切需要开发高通量筛选葡萄糖苷转移酶的生产菌株的方法。

发明内容
本发明的目的就是提供一种高通量筛选葡萄糖苷转移酶的生产菌株的方法。本发明的另一目的在于提供从所述的生产菌株制备葡萄糖苷转移酶的方法，以及 所述葡萄糖苷转移酶在生产异麦芽低聚糖中的应用。在本发明的第一方面，提供了一种筛选生产葡萄糖苷转移酶的生产菌株的方法， 包括步骤
(a)用抗葡萄糖苷转移酶的特异性抗体，测定各候选菌株的蛋白样品中作为抗原 的葡萄糖苷转移酶的效价；和(b)根据测定的效价值，选择高效价的候选菌株作为生产葡萄糖苷转移酶的生产 菌株。在另一优选例中，步骤(a)中的测定效价的方法是酶联免疫测定法。在另一优选例中，所述方法还包括步骤(c)对于选定的生产菌株，测定其葡萄糖 苷转移酶催化麦芽糖生产异麦芽低聚糖的能力。在另一优选例中，在步骤(a)中测定的候选菌株选自下组黑曲霉(Aspergillus niger)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、碳黑曲霉(Aspergi 1 luscarbonarious)、肉 桂色曲霉(Aspergillus cinmomeus)、宇佐美曲霉(Aspergi 1 lususamii)、构巢曲霉 (Aspergillus nidulan)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、青霉菌(P. chrysogenum)、禾口出芽 短梗霉(Aureobasidium pullulans)。在另一优选例中，在步骤(a)中测定的候选菌株的数量为5-200种，更佳地为 10-100 种。在另一优选例中，所述的抗体是单克隆抗体、多克隆抗体或抗血清。在本发明的第二方面，提供了一种用本发明第一方面中所述方法筛选出的葡萄糖 苷转移酶生产菌株。在另一优选例中，所述的生产菌株是黑曲霉或宇佐美曲霉。在本发明的第三方面，提供了一种葡萄糖苷转移酶，所述的葡萄糖苷转移酶是用 本发明第二方面中所述的生产菌株所生产的。在另一优选例中，所述的葡萄糖苷转移酶是黑曲霉或宇佐美曲霉所产生的。在本发明的第四方面，提供了一种生产异麦芽低聚糖的方法，所述方法包括步骤 使用本发明第三方面所述的葡萄糖苷转移酶催化葡萄糖苷键的转移反应，从而形成异麦芽 低聚糖。在另一优选例中，所述的异麦芽低聚糖包括异麦芽糖、麦芽三糖、异麦芽三糖、麦 芽四糖、或潘糖。在另一优选例中，转移反应所用的原料为麦芽糖。在另一优选例中，所述的转移反应的条件为30-60 °C，较佳地53-57 °C，时间为 24-72小时。在另一优选例中，以麦芽糖或淀粉为原料时，用所述的葡萄糖苷转移酶催化葡萄 糖苷键的转移反应形成异麦芽低聚糖的转化率为55-65%，较佳地为56-63%，更佳地为 60-62%。在另一优选例中，所述的催化反应包括按麦芽糖重量计，加入0. 05 0. 5衬％的 葡萄糖苷转移酶，并在温度30°C 60°C保温24 72小时，从而获得异麦芽低聚糖含量为 50 65wt%的异麦芽低聚糖浆。应理解，在本发明范围内，本发明的上述以及下述的各技术特征可以互相组合，形 成构成新的或优选的技术方案。


图1显示了不同菌株葡萄糖苷转移酶的Elisa检测显色图。其中，横向1、2、3、4、5、6、7、8、9、10代表不同的倍半稀释次数(效价)；纵向1、2、3、4、5、6 分另丨」对应菌株编号 10Z307GTasel、10Z307GTase2、 10Z307GTase5、10Z307GTase6、10Z307GTase8。图2显示了葡萄糖苷转移酶发酵动力学曲线。图3显示了玉米淀粉为底物异麦芽低聚糖的HPLC分析图。图4麦芽糖为底物异麦芽低聚糖的HPLC分析。
具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现，可以通过抗原-抗体的特异性反 应来高通量和大规模地筛选葡萄糖苷转移酶的生产菌株，其中所用的抗体为特异性抗葡萄 糖苷转移酶的抗体(尤其是抗血清)。通过抗原-抗体的特异性反应，不仅可以筛选到产生 葡萄糖苷转移酶的菌株，而且出乎意料的是，所生产出的葡萄糖苷转移酶的催化形成低聚 糖活性与测定效价高低存在正相关性。在此基础上，本发明人完成了本发明。如本文所用，术语“低聚异麦芽糖”和“异麦芽低聚糖”可互换使用，都指选自下组 的一种或多种糖异麦芽糖、麦芽三糖、异麦芽三糖、麦芽四糖、或潘糖。此外，应理解，所述 的术语还包括上述糖的混合物。筛选方法在本发明的筛选方法中，其核心是利用了抗葡萄糖苷转移酶的抗体来筛选相应的 抗原，即葡萄糖苷转移酶。由于本发明筛选方法基于抗原抗体的专一反应，因此准确性高。在本发明中，对于用于测定是否发生抗原-抗体的特异性结合及其效价大小的方 法，没有特别限制。本领域常用的各种测定抗原-抗体特异性结合及测定结合效价的方法 都可使用。代表性的例子包括(但并不限于)酶联免疫吸附测定法(ELISA)、竞争性结合法等。在本发明中，适用的抗葡萄糖苷转移酶的特异性抗体没有特别限制。可以是市售的， 也可以是用常规方法制备的。所述的抗体可以是单抗，也可以是多克隆抗体，尤其是抗血清。在本发明的筛选方法中，先用抗葡萄糖苷转移酶的特异性抗体，测定各候选菌株 的蛋白样品中作为抗原的葡萄糖苷转移酶的效价；然后根据测定的效价值，选择高效价的 候选菌株作为生产葡萄糖苷转移酶的生产菌株。发酵制备本发明还提供了从所述筛选出的生产菌株制备葡萄糖苷转移酶的工艺。本发明方法筛选出的生产菌株，可用于制备葡萄糖苷转移酶。生产葡萄糖苷转移 酶时，可以采用本领域常规的制备酶制剂的工艺。通常，该方法包括培养所述的生产菌株； 以及从所述的发酵产物中分离获得葡萄糖苷转移酶。在发酵中，可采用的发酵条件如下碳源没有特别限制，可选取葡萄糖、玉米粉、玉米淀粉、蔗糖、果糖、木糖、麦芽糖、 乳糖以及水解糖。浓度没有特别限制，通常浓度在之间。
氮源没有特别限制，可选取麸皮、酵母粉、蛋白胨、花生蛋白、豆饼粉、玉米浆、豆饼 水解液、尿素、硫酸铵。浓度没有特别限制，通常浓度在0. 1% -4%之间。营养盐，可以按生产菌株的种类常规选择，通常包含K3P04，MgS04 7H20, FeCl3，硫 酸锌，硼酸，氯化钙，各种成分浓度一般在ppm级到毫克级。表面活性剂吐温80在0. 1 1 %之间。发酵温度在25_35°C的范围内，发酵时间3_6天。搅拌转速在120_300rpm之间，通风量在0. 5 1. Ov/v/m。发酵过程中pH控制在5-6之间。发酵时，可以采用或不采用发酵中期流加培养基的策略。如果采用流加培养基，则 代表性的流加培养组成可以为碳源30%，氮源10%，营养盐10 20%。流加时间12小 时-24小时，视发酵活力的情形而定。流加速度根据PH和溶氧的控制要求而自动调整。发酵后，可根据葡萄糖苷转移酶和生产菌株的特性，选自合适的分离方法。一种优选的分离方法包括发酵液经高速冷冻离心(如7500rpm，4°C，20分钟)， 取上清。采用中空纤维超滤器，超滤膜截流分子量大于10万道尔顿，进口压力0. l-o. 3MPa, 出口压力为0.40 0.5MPa，滤液与回流量比为1-2 2_1(优选约1 1)，操作温度 10°C -30°C，浓缩倍数为2-10倍(如5倍)，截流液即为液体葡萄糖苷转移酶制剂，酶活8 万 15万U/ml。另一种优选的分离方法包括发酵液经高速冷冻离心(如7500rpm，4°C，20分 钟)，取上清，用60 %饱和硫酸铵沉淀，沉淀溶于纯水，采用中空纤维超滤器，超滤膜截流分 子量大于10万道尔顿，进口压力0. 1-0. 3MPa，出口压力为0. 40 0. 5MPa，滤液与回流量比 为1-2 2-1 (优选约1 1)，操作温度10°C-30°C，浓缩倍数5倍，截流液添加干燥保护剂 (包括1 % 7 %的甘露醇，5 % 10 %的海藻糖或乳糖)后进行真空喷雾干燥，干燥温度低 于45°C。干粉酶活20 40万U/g。催化合成异麦芽低聚糖本发明还提供了用高活性的葡萄糖苷转移酶催化合成异麦芽低聚糖的方法。对于制备的葡萄糖苷转移酶，可以直接用于催化生产异麦芽低聚糖。在本发明中， 使用葡萄糖苷转移酶生产异麦芽低聚糖的条件没有特别限制，可以采用本领域常规的工艺 条件。例如，在生产工艺中，既可以使用淀粉为原料，也可以使用麦芽糖作为原料。一种优选的生产工艺包括以淀粉为原料(浓度10% 40%)，经高温a-淀粉 酶(0. 05% 0. 5% )在90°C 115°C液化到DE10 20，煮沸5分钟 15分钟灭酶，冷却 到60 °C，调pH到4 7，加普鲁兰酶(0. 05 % 0. 5 % )、a -真菌淀粉酶(0. 05 % 0. 5 % ) 和Maltogenase(0. 05% 0. 5% )，然后本发明的葡萄糖苷转移酶(0.05% 0.5% )进行 保温转化(温度30°C 60°C;时间24 72小时)，从而获得较高含量异麦芽低聚糖浆(含 量 50% 60% )。另一种优选的工艺包括以麦芽糖(浓度10% 40%)为底物，加本发明的葡萄 糖苷转移酶(0. 05% 0.5% )，然后进行保温转化(温度30°C 60°C ；时间24 72小 时)，获得较高含量异麦芽低聚糖浆(含量50 % 60 % )。本发明的主要优点在于(a)本发明的抗体筛选方法，基于抗原抗体的专一反应，因此准确性高。
(b)利用酶联免疫，一次处理的样品量大，可以使菌种的筛选更加快速准确。(c)用本发明方法可高效地催化合成异麦芽低聚糖，异麦芽低聚糖的转化率高达 55-65wt%。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如 Sambrook 等人，分子克隆实验室手册(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。在本发明中，百分比和份数为 重量百分比和重量份数，除非特别说明。实施例1抗血清实验1.1抗血清(一抗)的获得1.1.1抗原的制备将市售的商品化葡萄糖苷转移酶先作SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色后割下目 的蛋白条带。1.1.2乳化抗原将割下目的蛋白条带用组织研浆器磨碎，加入等量弗氏不完全免疫佐剂，将其吸 入两支注射器中，用约5cm长的乳胶管连接这两支注射器，来回交替推动针管，直至形成乳 白色乳化液。检查乳化情况，将其滴一滴于冷水表面，如果在水面上不扩散，即为乳化完全。2. 1. 3免疫方案本实验采用日本大耳兔，使用混合免疫法，免疫程序如下表表1免疫方案 末次免疫后一周，可以从家兔耳缘静脉中少量采血，用相应抗原检测，如果不满 意，可以继续注射以加强免疫，直至达到满意的效果。在末次免疫后的第7天，采用静动脉放血法得到血清。1. 1. 4血清的分离和保存将血液置于37°C下lh使血液彻底凝集后，用灭菌的lmL大枪头沿瓶壁将血块与瓶 壁分离，再放入4°C过夜，使血清充分析出。然后用枪头将血清吸出，如混有红细胞，则离心 除去。将免疫血清(一抗)无菌分装后，放于_8(TC保存。
实施例2酶联检测方法2. 1粗抗原(葡萄糖苷转移酶)制备取1ml发酵液，lOOOOrpm离心，取上清，加2倍体积冰乙醇提取，lOOOOrpm离心，取
沉淀。沉淀用新鲜配制的PH9. 6的碳酸钠缓冲液稀释稀释至蛋白质含量为1 10 y g/ml, 铺板。2. 2 铺板将稀释好的抗原铺板，用碳酸钠缓冲液稀释在第一孔内加入50ul抗原液，50ul 碳酸钠缓冲液，混勻，取50ul移至第二孔，加50ul碳酸钠缓冲液，混勻，放37°C—小时。2. 2 阻断倒出残液，拍干，加入新配PBS-BSA阻断，每孔加入100ul，放37°C二小时。*PBS 磷酸缓冲盐溶液(PH7. 4)*BSA:牛血清蛋白*PBS-BSA :100ml内含lg BSA，每次用根据所需量配制。2. 3 加一抗倒出残液，加入一抗，每孔50ul。放37°C二小时。* 一抗用PBS稀释100倍，根据所需量配制。2. 4 洗板倒出掺液，用PBS+TWeen20，洗涤两遍，用PBS洗涤两遍。轻轻拍干。*PBS+Tween20 :100mlPBS 内加入 200ulTween20。2. 5 加二抗每孔二抗50ul，放37°C半小时。* 二抗羊抗兔(HRP)，用PBS稀释2500倍，根据所需量配制。2. 6 洗板倒出掺液，用SDS洗涤两遍，用PBS洗涤两遍，轻轻拍干。2. 7加底物显色A液(0. 1M醋酸盐缓冲液pH5. 0+0. 05% 0. 1 % H202)+B液(0. 盐酸溶液 (PH ^ 3. 0) +TMB 0. 4mg/ml+0. 5mM EDTA)，根据需要，可以用 PBS 稀释一半，每孔 50ul。显色。2. 8 读数根据酶标仪在450nm处读数的高低，判断酶活的多少。实施例3葡萄糖苷转移酶高产菌株筛选3. 1 菌株选取100余株工业上生产糖化酶、酸性蛋白酶、柠檬酸、果胶酶以及葡萄糖酸等 菌株，这些菌株分属于黑曲霉(Aspergillus niger)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)， 碳黑曲霉(Aspergillus carbonarious)，肉桂色曲霉(Aspergilluscinmomeus)，宇佐美 曲霉(Aspergillus usamii)，构巢曲霉(Aspergillus nidulan)，米曲霉(Aspergillus oryzae)，青霉菌(P. chrysogenum)，出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)等。
3. 2培养基麦芽糖2%，酵母粉 0. 5%, K3P040. 1 %，MgS04 7H20 0. 05%, FeCl30. 03%3. 3发酵条件500ml三角瓶装液100ml，起始pH5. 5，30°C，250rpm，旋转培养72小时。3. 4酶联免疫检测结果粗抗原(葡萄糖苷转移酶)按照实施例2中2. 1的方法，检测过程按照实施例2 所述的方法，代表性结果如表2和图1所示。表2不同菌株葡萄糖苷转移酶的效价(反应酶活高低) 1吸光度比值(0D45Qnm/对照0D45QJ彡2表示阳性⑴，说明菌株产葡萄糖苷转移 酶；样品0D45(tam/对照0D45(tam < 2表示阴性(_)，说明菌株基本不产葡萄糖苷转移酶。2甲基葡萄糖检测法，见实施例4中的4. 5。3TLC法。_、+、++、+++、++++分别表示异麦芽低聚糖生成量由低到高。薄层层析 板Silica Gel 60 (Merck，德国)；展开剂2_ 丙醇(2-propanol) 丁醇(1-butanol) 水(water) = 12 3 4(体积比)；显色剂及条件乙酸内含1 %对甲氧基苯甲醛 (p-Anisaldehyde)及2%的硫酸，110°C加热10分钟显色。上述结果表明，甲基葡萄糖酶活高，其效价和异麦芽低聚糖生成量不见得高。例如 10Z307GTase4菌株，其甲基葡萄糖酶活高，但异麦芽低聚糖生成量却很低(仅为+)。与之相反，效价高时，葡萄糖苷转移酶催化的异麦芽低聚糖生成量就高，呈现出正 相关性。例如，效价为28的菌株，异麦芽低聚糖生成量最高(为++++)，而效价为27的菌株， 异麦芽低聚糖生成量也很高(为+++)。这表明，本发明的筛选方法特别适合高通量地筛选葡萄糖苷转移酶生产菌株。实施例4葡萄糖苷转移酶发酵工艺及制备4. 1 菌株选取实施例3中所筛选出的10Z307GTasel(黑曲霉)为发酵菌株。4. 2培养基碳源分别选取葡萄糖、玉米粉、玉米淀粉、蔗糖、果糖、木糖、麦芽糖、乳糖以及水解 糖，浓度在之间。氮源分别选取麸皮、酵母粉、蛋白胨、花生蛋白、豆饼粉、玉米浆、 豆饼水解液、尿素、硫酸铵，浓度在0. 1% -4%之间。营养盐，主要包含K3P04，MgS04 7H20， FeCl3,硫酸锌，硼酸，氯化钙，各种成分浓度在ppm级到毫克级。表面活性剂吐温80在0. 1 之间。4. 3发酵工艺条件4.3. 1发酵温度及时间在25_35°C的范围内，发酵时间3-6天。4. 3. 2通风与搅拌由于葡萄糖苷转移酶是好氧发酵，因此通风与搅拌必然影响到底物与氧在发酵液 中的混合与传递，从而影响菌体的生长及酶的产量。黑曲霉发酵过程中菌体以菌球的形 态存在的，由于影响基质的吸收传递，以及葡萄糖苷转移酶的分泌，因此，在发酵过程中控 制适宜的搅拌转速和通气量是非常重要的，通常搅拌转速在120-300rpm之间，通风量在 0. 5 1. Ov/v/m。4. 3. 3pH黑曲霉菌丝体生长的pH范围是3 8，在pH> 7时生长受阻。由于pH影响菌丝 体的通透性、对微量元素的吸收及酶的活性，因此选择适宜的发酵PH是相当重要的。因此 发酵过程中pH控制在5-6之间。4. 3. 4补料控制发酵为更大限度地提高酶活水平，采用发酵中期流加培养基的策略。流加培养基的组 成为碳源30%，氮源10%，营养盐10 20%。流加时间12小时-24小时，视发酵活力的 情形而定。流加速度根据PH和溶氧的控制要求而自动调整。发酵过程中葡萄糖苷转移酶生成的酶学动力学曲线如图2。4. 4葡萄糖苷转移酶提取及精制液体剂型发酵液经高速冷冻离心(7500rpm，4°C，20分钟)，取上清。采用中空纤维超滤器， 超滤膜截流分子量大于10万道尔顿，进口压力o. l-o. 3MPa，出口压力为0. 40 0. 5MPa，滤 液与回流量比为1 1，操作温度10°C-30°C，浓缩倍数5倍，截流液即为液体葡萄糖苷转移 酶制剂，酶活8万 15万U/ml，稀释4倍后酶活效价可达到29。固体粉状剂型发酵液经高速冷冻离心(7500rpm，4°C，20分钟)，取上清，用60%饱和硫酸铵沉 淀，沉淀溶于纯水，采用中空纤维超滤器，超滤膜截流分子量大于10万道尔顿，进口压力 0. 1-0. 3MPa，出口压力为0. 40 0. 5MPa，滤液与回流量比为1 1，操作温度10°C _30°C，
10浓缩倍数5倍，截流液添加干燥保护剂(包括1 % 7 %的甘露醇，5 % 10 %的海藻糖或乳 糖)后进行真空喷雾干燥，干燥温度低于45°C。干粉酶活20 40万U/g，稀释4倍后酶活 效价达到21(1。4. 5酶活测定按照国际上通用的Alpha-甲基葡萄糖法。取2%的甲基葡萄糖溶液，0.02M醋酸 缓冲液各lml，40°C预热5min，加适当稀释酶液0. 5ml，40°C反应60min后，100°C沸水浴中加 热5min灭活，冷却后取反应液0. 5ml加葡萄糖氧化酶试剂3ml，40°C反应20min，冷却后测 定500nm的吸收值(A1)。另取缓冲液1ml，酶液0. 5ml，先在100°C沸水浴中加热5min灭活， 再加底物lml (同上)保温60min后，取出反应液0. 5ml (同上)测定500nm之吸收值(A2)。酶活定义是在上述条件下60min中底物生成1 y g葡萄糖所需酶量为一个单位。酶活力(U/g)= (A1-A2) XKX50XNK=每度A值所相当之葡萄糖量(Pg)，N=酶液稀释倍数。实施例5葡萄糖苷转移酶催化合成异麦芽低聚糖5.1工艺流程及条件评价异麦芽低聚糖生产工艺水平高低的主要技术指标是终产品中异麦芽低聚糖 的含量的高低，也就是转苷水平的高低，目前的工艺转化水平大多在30% -45%之间，这一 指标得高低主要取决于葡萄糖苷转移酶催化效率的高低，但是与异麦芽低聚糖生产相关的 酶有四种包括a-淀粉酶、普鲁兰酶、麦芽糖生成酶和葡萄糖苷转移酶。其中麦芽糖生成 酶包括淀粉酶、真菌a-淀粉酶和放线菌的麦芽糖生成酶(Maltogenase)。不同类型 的麦芽糖生成酶水解淀粉的机制不同，其中间产物也不同，即使同一种同一种酶在不同的 作用时间，不同的用量下，其水解产物的聚合度也不同。同时不同的原料，其转化率也不同。 可见影响转化效率的因素是多种的，综合考虑这些因素，对转化体系进行优化，就会提高转 化率。优选的工艺流程和条件如下所示A.以淀粉为原料淀粉(10% 40% )溶液j加入高温a-淀粉酶(0.05% 0.5% ) =>90°C 115°C液化到DE10 20 煮沸5分钟 15分钟灭酶冷却到601=>调pH到4 7 二加 普鲁兰酶(0. 05% 0. 5% )=>加麦芽糖生成酶(Maltogenase) (0. 05% 0. 5% )=>加葡 萄糖苷转移酶(0. 05% 0. 5% )=>保温转化(温度30°C 60°C ；时间24 72小时)j 异麦芽低聚糖浆(含量50% 60% )B.以麦芽糖为原料麦芽糖(10% 40% )溶液=>加葡萄糖苷转移酶(0. 05% 0. 5% )=>保温转化 (温度30°C 60°C ；时间24 72小时)=>异麦芽低聚糖浆(含量50% 60%)5. 2异麦芽低聚糖浆的HPLC分析仪器Waters1525 ；分析柱 Carbohydrate HP ；型号规格Part No. WAT044355, 4iim，4. 6X250mm ；检测器:ffaters 2420ELS Detector样品处理取转化后的异麦芽低聚糖浆1ml，经0. 22 ym的一次性过滤除菌即可。检测条件进样量10 ill 流动相乙腈75 %，纯水25 %，检测温度30 V，流速 0. 8ml/min。
实施例65L发酵制备葡萄糖苷转移酶及其应用6. 15L NBS发酵罐葡萄糖苷转移酶发酵工艺及制备6. 1. 1 菌株选取实施例3中筛选出的10Z307GTasel为发酵菌株。6. 1.2 培养基种子培养基麦芽糖2 %，酵母粉 0. 5 %，K3P040. 1 %，MgS04 7H20 0. 05 %, FeCl30 . 03%发酵培养基玉米粉6 %，高温淀粉酶0.05%，酵母粉2 %，营养盐10ml，吐温 800. 5%。补料液流加培养基的组成为麦芽糖30%，酵母粉10%，营养盐10%。6. 1.3发酵工艺条件6.1.3.1 种子培养3个500ml三角瓶，每个装液100ml，起始pH5. 5，30°C，250rpm,旋转培养48小时。6. 1.3. 2发酵罐发酵5L发酵罐，装培养基液2.5L，接种量300ml，起始pH6，发酵温度32°C，pH控制在 5. 5，溶氧量大于5 %，搅拌转速在120-300rpm之间，通风量在0. 5 1. Ov/v/m,补料在第70 小时开始，到第92小时结束，共补料700ml。6. 1. 4液体剂型葡萄糖苷转移酶提取及精制发酵液经高速冷冻离心(7500rpm，4°C，20分钟)，上清液2500ml，酶活22000U/ ml，效价达到28。采用中空纤维超滤器，超滤膜截流分子量大于10万道尔顿，进口压力 0. 15MPa,出口压力为0. 45MPa，滤液与回流量比为1 1，操作温度25°C，浓缩到500ml，即 为液体葡萄糖苷转移酶制剂，酶活8. 8万U/ml，稀释4倍后酶活效价达到29。6. 2以玉米淀粉为底物葡萄糖苷转移酶催化合成异麦芽低聚糖的转化流程及条件 如下玉米淀粉(25% )高温a -淀粉酶(0. 1 % ) => 115°C液化到DE15 =>煮沸5分钟 灭酶=>冷却到60°C々调pH到5. 加普鲁兰酶(0. 05% )=>加Maltogenase (0. 1% )。力口 葡萄糖苷转移酶(0. 3% ) ^保温转化(温度55°C ；时间48小时)=>异麦芽低聚糖浆(含 量 55. 85% )结果如图3所示，在产物中，葡萄糖含量为44. 15%，而包括异麦芽糖、麦芽三糖、 异麦芽三糖、麦芽四糖、和潘糖在内的异麦芽低聚糖的总含量为55. 85%。6. 3以麦芽糖为底物葡萄糖苷转移酶催化合成异麦芽低聚糖酶法转化流程及条件如下麦芽糖(30% )加葡萄糖苷转移酶(0. 05% 0. 5% )=>保温转化(温度30°C 60°C ；时间24 72小时)=>异麦芽低聚糖浆(含量62% )结果如图4所示，在产物中，葡萄糖含量为37. 96%，而包括异麦芽糖、麦芽三糖和 潘糖在内的异麦芽低聚糖的总含量约为61. 04%。实施例75L发酵制备葡萄糖苷转移酶及其应用
重复实施例6，不同点在于(1)选取实施例3中筛选出的10Z307GTase7菌株(宇 佐美曲霉)替换10Z307GTasel (黑曲霉)，作为发酵菌株；⑵仅测定了以麦芽糖为底物时， 葡萄糖苷转移酶催化合成异麦芽低聚糖的转化率。结果表明，在产物中，葡萄糖含量约为40 %，而包括异麦芽糖、麦芽三糖和潘糖在 内的异麦芽低聚糖的总含量约为60%。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
一种筛选生产葡萄糖苷转移酶的生产菌株的方法，其特征在于，包括步骤(a)用抗葡萄糖苷转移酶的特异性抗体，测定各候选菌株的蛋白样品中作为抗原的葡萄糖苷转移酶的效价；和(b)根据测定的效价值，选择高效价的候选菌株作为生产葡萄糖苷转移酶的生产菌株。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括步骤(c)对于选定的生产菌株，测定 其葡萄糖苷转移酶催化麦芽糖生产异麦芽低聚糖的能力。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中测定的候选菌株选自下组 漂曲霉(Aspergillus niger)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、碳漂曲霉(Aspergillus carbonarious)、肉桂色曲霉(Aspergillus cinmomeus)、宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)、构巢曲霉(Aspergillus nidulan)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、青霉菌 (P. chrysogenum)、禾口出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中测定的候选菌株的数量为 5-200 种。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的抗体是单克隆抗体、多克隆抗体或抗血清。
6.一种用权利要求1所述方法筛选出的葡萄糖苷转移酶生产菌株。
7.—种葡萄糖苷转移酶，其特征在于，所述的葡萄糖苷转移酶是用权利要求6所述的 生产菌株所生产的。
8.如权利要求7所述的葡萄糖苷转移酶，其特征在于，所述的葡萄糖苷转移酶是黑曲 霉或宇佐美曲霉所产生的。
9.一种生产异麦芽低聚糖的方法，其特征在于，包括步骤使用权利要求7所述的葡萄 糖苷转移酶催化葡萄糖苷键的转移反应，从而形成异麦芽低聚糖。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的异麦芽低聚糖包括异麦芽糖、麦芽 三糖、异麦芽三糖、麦芽四糖、或潘糖。
全文摘要
本发明涉及葡萄糖苷转移酶生产菌株的酶联免疫筛选、发酵制备及应用。具体地，本发明公开了一种高通量地筛选生产葡萄糖苷转移酶(Alpha-GTase)的生产菌株的方法，包括步骤(a)用抗葡萄糖苷转移酶的特异性抗体，测定各候选菌株的蛋白样品中作为抗原的葡萄糖苷转移酶的效价；和(b)根据测定的效价值，选择高效价的候选菌株作为生产葡萄糖苷转移酶的生产菌株。本发明还提供了用所述方法筛选出的生产菌株生产葡萄糖苷转移酶的方法以及用所述葡萄糖苷转移酶高效生产异麦芽低聚糖的方法。本发明不仅可以实现高通量地筛选，而且还大幅度地提高了葡萄糖苷转移酶催化合成异麦芽低聚糖的效率。
文档编号C12R1/685GK101839912SQ20091004788
公开日2010年9月22日 申请日期2009年3月20日 优先权日2009年3月20日
发明者凌晨, 叶晴, 李平作, 江昊, 王莉, 章婷 申请人:中国科学院上海生命科学研究院湖州工业生物技术中心