专利名称：指示菌法平板快速筛选糖化酶产生菌新方法
技术领域：
本发明属于利用指示菌平板快速筛选糖化酶产生菌的新方法。
在发酵工业中，大量耗用糖化酶，筛选糖化酶产生菌工作相当繁杂，因而，妨碍了糖化酶的生产。传统筛选糖化酶产生菌的方法是利用次亚碘酸盐法，该方法是化学测定法。它除要求发酵滤液作样品外，也无法排除α-淀粉酶和葡糖苷转移酶的影响，更无法应用于能筛选大量菌株的单菌落琼脂柱育种。1977年，J.Meyrath创造一种能去除葡糖苷转移酶影响的筛选方法，其本质也是化学检测法。流程是菌块柱(置于平板上) (注入麦芽糖液保温2小时)/() 反应混合液→移到薄板色层分析器 (干燥)/() 显色→染色→挑出不产葡糖苷转移酶的菌落。这方法虽可排除葡糖苷转移酶的干扰，但难以区分每个菌落间糖化酶含量的差别，且流程、工序繁杂。
本发明的目的是提供一种指示菌法快速筛选糖化酶产生菌的新方法。它既能排除α-淀粉酶和葡糖苷转移酶的影响，又能在平板上区分大量单菌落琼脂柱产酶量差别;同时，设备简单，筛选过程简易快捷。
本发明的原理是琼脂柱的体积是相等的，所含营养成份也是相同的。当生长在它上面的不同菌株的生产性能不同时，分泌在琼脂柱里的糖化酶量也不一样。因而，检测的结果也不一样。根据对糖化酶敏感的指示菌形成的生长圈大小与菌落直径的比值，筛选出较优菌株。
本发明的工艺过程是单菌落琼脂柱或菌块柱 (加入指示菌液)/() 平板检测→挑选出最优菌落。
具体步骤分述如下一、指示菌的培养指示菌种为产肮假丝酵母(candidautilis)，热带假丝酵母(candidatrapicalis)，解脂假丝酵母(candidalipolytica)，乳酒假丝酵母(candidakefyr)，克鲁斯假丝酵母(candidakrusei)，郎必克假丝酵母(candidaIambica)。上述菌种的共同特征可在中国科学院微生物研究所“常见与常用真菌编写组”编写的《常见与常用真菌》一书P146找到。菌种可向中国科学院微生物研究所菌种室购买。
指示菌培养基成份马铃薯200克，葡萄糖20克，CaCO30.5克，K2HPO40.05克、MgSO40.05克，蒸馏水1000ml。马铃薯去皮煮沸20～30分钟，加入葡萄糖、无机盐和20克琼脂，溶化后调pH为6.5。每支12×180mm试管装8ml。1.1公斤压力灭菌30分钟后摆斜面，备用。
菌种培养在28℃培养24小时，菌苔半透明至乳白色。
菌液制备把消毒蒸馏水注入每支试管，每管5～10ml，用接种环刮洗液倒入消毒过的三角瓶里，置4℃冰箱保存备用。该菌液用72型分光光度计(510mm)测定OD值为0.25～0.26。
二、单菌落琼脂柱及菌块柱的制备和检测琼脂柱培养基玉米粉1～5%，黄豆饼粉0.5～2%，麸皮0.1～0.5%，K2HPO40.02～0.1%，琼脂1.5～2.0%。
单菌落琼脂柱制备把上述培养基溶化，每个9cm平皿倒入25ml。把待筛选菌株按常规法分离，每皿约出现30个菌落，适温培养至初见菌落时，用打孔器打出单菌落琼脂柱，在95%湿度下适温培养1～2天，长出孢子后，即可进行检测。
菌块柱制备把上述培养基按每平皿25ml倒好冷却后，即可用打孔器打出琼脂柱，然后，在每个柱面上接种各个待选菌株，置95%湿度下适温培养2～4天。
检测培养基及检测平板制备(NH4)2SO40.1～0.5%，KH2PO40.02～0.1%，MgSO40.01～0.05%，酵母膏0.005～0.02%，天门冬素0.005～0.015%麦芽糖1～3%，洗过琼脂2.5～3.0%。将上述药物(除麦芽糖和琼脂外)以蒸馏水配制后，每250ml三角瓶盛100ml，灭菌备用。倒平板前才加麦芽糖和琼脂溶化，冷至50℃时加入指示菌液5～10ml，混匀后，立即倒入消毒过的平板里，100ml/个，冷凝。
琼脂柱检测筛选取已生长好的单菌落琼脂柱或菌块琼脂柱置平板上，28℃培养8～18小时，即可在琼脂柱四周看到不同直径的生长圈，以菌落直径和生长圈直径的比值挑选较优者进行重复筛选。复筛后，为了进一步观察菌株特征，可选择若干个较优菌株进行摇瓶发酵。
三、发酵培养基配方筛选法取不同来源的原料设计成不同培养基配方，一般可同时做50个组合，接入工厂常规生产菌种后摇培，取滤液用管碟法在平板上检测，一个平板每次可同时测50个以上样品，28～32℃，8～18小时，根据生长圈大小厚薄而知不同配方的效果，从中挑选出最优者付诸实用。
本发明不但能排除α-淀粉酶和葡糖苷转移酶的影响，而且方法简便快捷，在一般情况下两人操作，1小时能贴1000个以上单菌落琼脂柱，条件最适合时，6～8小时即可得到结果。
实施例
一、把一支产肮假丝酵母(candidautilis)试管斜面注入5～10ml无菌水，刮下菌苔后倒入冷至50℃以下的测试培养基中，倾至28×35cm消毒玻璃平板里，100ml/个，冷凝后，在它上面贴上50～100个糖化酶菌AS.3.4309(即UV-11，中国科学院微生物研究所选育的糖化酶产生菌)分离的单菌落琼脂柱，28～32℃经8～18小时后，即从生产圈大小知道单菌落间的产酶量差异。以有差异菌落进行摇培时，取滤液测定，其结果和单菌落琼脂柱筛选时的情况是一致的。
二、在加入指示菌测试培养基平板上，用常规同化碳源法点上糖化酶，α-淀粉酶，葡糖苷转移酶和蛋白酶粉剂，28°～32℃经8～18小时即见点上糖化酶处有生长圈出现，点上其他酶的地方都没有生长圈。
权利要求
1.一种快速筛选糖化酶产生菌的方法，在玻璃平板中贴上单菌落琼脂柱，其特征在于平板中先注入混有指示菌的测试培养基，然后检测挑选出最优糖化酶产生菌最优菌落。这些指示菌为产肮假丝酵母(candidautilis)，热带假丝酵母(candidatrapicalis)，解脂假丝酵母(candidaLipolytica)，乳酒假丝酵母(candidak-efyr)，克鲁斯假丝酵母(candidakrusei)，朗必克假丝酵母(c-andidaIambica)，这些菌种保藏在中国科学院微生物研究所。
2.按权利要求1所述的指示菌法筛选糖化酶菌的方法，其特征在于指示菌种的菌液浓度，在72型分光光度计测定时(510mm)，OD值为0.25～0.26。
3.按权利要求1所述的指示菌法筛选糖化酶产生菌的方法，其特征在于琼脂柱培养基的组成为玉米粉1～5%，黄豆饼粉0.5～2%，麸皮0.1～0.5%，K2HPO40.02～0.1%，琼脂1.5～2.0%;
4.按权利要求1所述的指示菌法筛选糖化酶菌的方法，其特征在于检测培养基的组成为(NH4)2SO40.1～0.5%，KH2PO40.02～0.1%，MgSO40.01～0.05%，酵母膏0.005～0.02%，天门冬素0.005～0.015%，麦芽糖1～3%，洗过琼脂2.5～3.0%。
全文摘要
本发明属于利用指示菌法平板快速筛选糖化酶产生菌的新方法。该方法采用产肮假丝酵母等为指示菌种，根据在等体积、相同养分含量的琼脂柱上生长的不同菌株生产性能不同，分泌在琼脂柱里的糖分酶量也不一样的原理，由对糖化酶敏感的指示菌所形成的生长圈大小与菌落直径的比值，筛选出优秀菌株。该方法能够在平板上区别大量单菌落琼脂柱和检测多个不同配方培养基发酵液的产酶量，又能排除α-淀粉酶和葡糖苷转移酶的影响，而且，设备和技术简单。
文档编号C12N1/16GK1039842SQ8810491
公开日1990年2月21日 申请日期1988年8月4日 优先权日1988年8月4日
发明者郭维烈, 郭庆华 申请人:广东省微生物研究所