包括简化的基因工程生物指示剂的灭菌指示器的制造方法
【专利说明】包括简化的基因工程生物指示剂的灭菌指示器
【背景技术】
[0001] 本申请发明人以前公开一种基因工程生物指示剂，所述基因工程生物指示剂包含 用于产生指示酶的至少一种测试生物体和至少一种报告基因，所述报告基因被测试生物体 摄取（takenup)，所述测试生物体包含细菌芽孢；至少一种阻遏基因，其抑制报告基因的表 达，直至报告基因暴露于至少一种诱导物；其中基因工程生物指示剂是自含式生物指示器 的一个组分，所述自含式生物指示器例如两隔室系统如瓶（vial)和封盖的组合，该两隔室 系统还包含基因工程生物指示剂的生长培养基。参见例如U.S.专利号8, 372, 624。
[0002] 在US 8372624公开的基因工程生物指示剂系统和方法中，阻遏基因抑制报告基 因的表达，直至该系统暴露于诱导物。在应用这种系统和方法时，遇到了各种问题，包括指 示剂的变色，这是由于诱导物和/或与如报告基因一样必须被测试生物体摄取的阻遏基因 有关的组织的降解造成的。例如，当系统在灭菌处理期间或者在生产基因工程生物指示剂 系统的加工过程中被加热时，已观测到变色反应。认为通过加热或其他灭菌处理（例如，通 过氧化灭菌处理，如气态过氧化氢、环氧乙烷等），使诱导物例如木糖降解并变成褐色或者 其他变色。这种变褐或变色对检测与显示灭菌失败的结果相关的任何变化造成干扰。可以 理解，这是不期望的，因为这导致试验灵敏度降低。以前需要诱导物来克服阻遏基因的影 响。通过省略阻遏基因，就不再需要使用诱导物，并因此可以避免由诱导物引起的变褐或变 色问题。另外，将认识到在用于诱导测试生物体摄取报告基因的载体中必须包括阻遏基因 只会增加用于生产基因工程生物指示剂系统的总体过程的复杂性。这些问题仍需要解决。
[0003] 发明概述
[0004] 因此，在利用这种系统时出现了问题，本申请发明人通过开发本发明解决了这个 问题。本申请发明人已经开发了一种新的基因工程生物指示剂，如同先前的系统，其包括： 用于产生指示酶的至少一种测试生物体和至少一种报告基因，报告基因被测试生物体摄 取，测试生物体包含细菌芽孢；其中基因工程生物指示剂是自含式生物指示器的一个组分。 然而，本发明不需要阻遏基因和诱导物，并且在事实上不包括阻遏基因和诱导物，而阻遏基 因和诱导物是在US 8372624中公开的基因工程生物指示剂系统和方法所需的。
[0005] 因此，根据本发明的一个实施方案，提供了一种灭菌指示器，其包括：
[0006] 第一隔室，其含有基因工程生物指示剂，该第一隔室被调整适于允许生物指示剂 在灭菌过程中与灭菌介质接触；和
[0007] 第二隔室，其含有至少一种酶底物，该第二隔室被调整适于使酶底物在灭菌过程 中保持与生物指示剂分开，并且该第二隔室被调整适于在生物指示剂已暴露于灭菌介质后 允许酶底物接触生物指示剂；
[0008] 其中，基因工程生物指示剂包含适合产生指示酶的至少一种测试生物体和至少一 种报告基因，所述报告基因被测试生物体摄取；
[0009] 其中，灭菌指示器中的测试生物体不含任何活性的或者可激活的阻遏基因，该阻 遏基因如果存在于测试生物体或灭菌指示器中将抑制报告基因的表达，并且
[0010] 其中，选择指示酶和酶底物以使指示酶对酶底物的酶促作用产生可检测的信号。
[0011] 在一个实施方案中，使用至少一种质粒和/或至少一种病毒，使报告基因被测试 生物体摄取。
[0012] 在一个实施方案中，测试生物体包括嗜热脂肪地芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus)和 / 或萎缩芽抱杆菌（Bacillusatrophaeus)的芽抱。
[0013]在一个实施方案中，报告基因包括lacZ、bgaB、xylE、cat或者其中的两种或更多 种的混合物。
[0014]在一个实施方案中，指示酶包括P-D-半乳糖苷酶、P-D-葡糖苷酶、a-D-葡 糖苷酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、丁酸酯酶、辛酸酯酶脂肪酶、氯霉素乙酰转移酶、儿茶 酚-2, 3-二加氧酶、肉豆蔻酸酯脂肪酶、亮氨酸氨肽酶、缬氨酸氨肽酶、糜蛋白酶、磷酸水解 酶、a-D-半乳糖苷酶、a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、N-乙酰基-0-氨基葡糖苷酶、0-D-纤 维二糖糖苷酶、丙氨酸氨肽酶、脯氨酸氨肽酶、酪氨酸氨肽酶、苯丙氨酸氨肽酶、0 -D-葡糖 醛酸糖苷酶、脂肪酸酯酶，或者其中的两种或更多种的混合物。
[0015]在一个实施方案中，报告基因包括lacZ或bgaB，且指示酶包括P-D-半乳糖苷酶。[0016]在一个实施方案中，质粒包含报告基因且不含任何阻遏基因。
[0017]在一个实施方案中，病毒包含至少一种基因转运蛋白（transporter)，所述基因转 运蛋白包含被壳体包围的核酸，基因转运蛋白包含报告基因且不含任何阻遏基因。在一个 实施方案中，病毒包含至少一种菌体。在一个实施方案中，病毒包含X或M13B策菌体。
[0018]根据本发明的另一个实施方案，提供一种灭菌指示器，其包括：
[0019]第一隔室，其含有基因工程生物指示剂，该第一隔室被调整适于允许生物指示剂 在灭菌过程中与灭菌介质接触；和
[0020] 第二隔室，其含有至少一种酶底物，该第二隔室被调整适于使酶底物在灭菌过程 中与生物指示剂分开，并且该第二隔室被调整适于在生物指示剂已暴露于灭菌介质后允许 酶底物接触生物指示剂；
[0021] 其中，基因工程生物指示剂包含产生指示酶的嗜热脂肪地芽孢杆菌和/或萎缩芽 孢杆菌的芽孢和选自lacZ、bgaB、XylE和cat基因的至少一种报告基因，所述报告基因被嗜 热脂肪地芽孢杆菌和/或萎缩芽孢杆菌的芽孢摄取；
[0022] 其中，灭菌指示器中的嗜热脂肪地芽孢杆菌和/或萎缩芽孢杆菌的芽孢不含任何 活性的或可激活的阻遏基因，该阻遏基因如果存在于测试生物体或灭菌指示器中将会抑制 报告基因的表达，并且
[0023] 其中，选择指示酶和酶底物以使指示酶对酶底物的酶促作用产生可检测信号。
[0024]在一个实施方案中，指示酶包括0 -D-半乳糖苷酶、0 -D-葡糖苷酶、a -D-葡 糖苷酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、丁酸酯酶、辛酸酯酶脂肪酶、氯霉素乙酰转移酶、儿茶 酚-2, 3-二加氧酶、肉豆蔻酸酯脂肪酶、亮氨酸氨肽酶、缬氨酸氨肽酶、糜蛋白酶、磷酸水解 酶、a-D-半乳糖苷酶、a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、N-乙酰基-0-氨基葡糖苷酶、0-D-纤 维二糖糖苷酶、丙氨酸氨肽酶、脯氨酸氨肽酶、酪氨酸氨肽酶、苯丙氨酸氨肽酶、0 -D-葡糖 醛酸糖苷酶、脂肪酸酯酶，或者其中的两种或更多种的混合物。
[0025]根据本发明的另一个实施方案，提供一种灭菌方法，其包括：
[0026]使待要进行灭菌的物品和上述的灭菌指示器暴露于灭菌介质；
[0027]合并第一隔室和第二隔室的内容物；
[0028] 孵育第一隔室和第二隔室的合并内容物；并且
[0029] 通过在孵育后检测存在或不存在可检测的信号来确定灭菌处理的效力。
[0030] 在一个实施方案中，在该灭菌方法中，灭菌介质包括蒸汽、干热、辐射、等离子体、 一种或多种气体灭菌剂和/或一种或多种液体灭菌剂。
[0031] 在一个实施方案中，在该灭菌方法中，灭菌介质包括电子束辐射、电磁辐射、Y辐 射、0辐射、环氧乙烷、气体过氧化氢、液体过氧化氢、福尔马林、戊二醛和/或过乙酸。
[0032] 本发明可以提供优于US8372624系统的一些优点中的一个或多个。通过移除阻 遏基因或者以其他方式敲除其活性，也就移除了对诱导物的需要。"敲除"基因的活性可以 通过插入突变、缺失突变或通过用不含该基因的病毒或质粒再转化该野生型宿主生物体来 完成。由于在一些情况中诱导物（例如木糖）可非故意干扰US8372624系统的正常功能， 它的移除完全消除了这种可能性。通过移除阻遏基因，本发明还提供了如下益处：降低成本 和降低生产包括基因工程生物指示剂的灭菌指示器的复杂性，因为阻遏物和诱导物都不是 必需的组分。通过移除阻遏物，转染载体能在组成上表达其报告酶；意味着在不存在阻遏的 情况下，报告基因的产物将会达到高得多的水平，因而增加指示剂的灵敏度。因此，消除了 在生产这种灭菌指示器的过程中所涉及的步骤的数量和复杂性，以及对这些现在不必要的 组分的成本和操作。最后，当灭菌指示器已通过灭菌处理、已经过孵育并测定结果时，不存 在因降解的诱导物引起的吸光度进一步增加读数器的灵敏度和信号强度。
[0033] 附图简述
[0034] 本发明可与多种灭菌指示器设备一起使用。附图旨在提供对适合的灭菌装置的 示例性的、非限制性的描述，目的在于更好地理解本发明，而不是意图以任何形式限制本发 明。在附图中，类似的部件和特征具有类似的标号。
[0035] 图1是适合供本发明的实施方案使用的灭菌指示器的第一实施方案在激活前配 置下的示意性剖面图。
[0036] 图2是图1的灭菌指示器在激活配置下的示意性剖面图。
[0037]图3是类似于图1的适合供本发明实施方案使用的灭菌指示器的第二实施方案在 激活前配置下的示意性剖面图。
[0038] 图4显示无、一个和两个高压灭菌循环对不含有木糖的恢复培养基的影响。
[0039] 图5显示无、一个和两个高压灭菌循环对含有1%木糖的恢复培养基的影响。
[0040] 应该理解，为了简单和清楚地说明，图中所示的元件不一定是按比例绘制的。例 如，为了清楚，一些元件的尺寸相对于彼此可以被放大。而且，认为适当时，在各图之间可以 重复参考数字以指示相应的元件。
[0041] 此外，应该理解，以下描述的方法步骤和结构可以不形成完整的生产最终可用的 灭菌指示器的工艺流程。本发明可结合本领域中目前使用的装置和处理技术一起实施，并 且仅包括那些对于理解本发明是必要的常规实践的工艺步骤。
[0042] 发明详述
[0043] 术语"灭菌"是指使物质不能繁殖、代谢和/或生长。虽然该术语通常是指活生物 体完全不存在，但该术语在本文中是指物质在以前同意为可接受的程度上不含活生物体。 除非另有说明，术语灭菌在本文中还指不如灭菌严格的方法和程序，例如，消毒、卫生处理 等。本文中描述的基因工程生物指示剂以及方法和装置可以用于卫生保健领域、科学领域 等。这些可以用于需要灭菌、消毒、卫生处理、排污和清洁等的商业和工业应用中。所述商 业和工业应用可以包括诸如食品加工、巴氏杀