专利名称：一种常压蒸汽灭菌生物指示剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种常压蒸汽灭菌指示剂和该指示剂的制备方法。
技术背景
在对食用菌栽培料常压蒸汽灭菌效果监测的物理、化学和生物三种方法中，生物 监测方法是效果最为可靠的方法。生物监测的原理是依靠某种抗常压蒸汽灭菌且具有灭菌 效果指示能力的菌类，将其芽孢(孢子)经灭菌后培养，通过芽孢存活与否来判定栽培料中 杂菌被杀灭的效果。生物监测技术的应用，确实收到了提高灭菌效果、减少污染发生、改善 食用菌菌丝生长的显著效果。
常压蒸汽灭菌生物指示剂是由指示菌干芽孢麸皮菌剂、灭菌粉状培养基(干培养 基)、增色剂混合组成的，分装在透明耐高温的瓶内，使用时往指示剂瓶内加入水后，再伴随 食用菌栽培料进行灭菌。灭菌工作完成后，对指示剂瓶内的指示菌进行培养，观察其指示瓶 内有无指示菌菌落长出，如有菌落长出，则说明食用菌栽培料灭菌质量不达标，反之即为达 标。由于常压蒸汽灭菌指示剂所应用的指示菌，是在某一种类的食用菌栽培料营养水平上 和食用菌菌丝正常生长所需温度范围内(20 36°C)能够生长的菌类。其在指示剂中被 干培养基所包围时，因缺少芽孢萌发生长所需水分而处于休眠状态，在使用时加水后，就具 备了芽孢萌发生长所需的营养、水分条件。加之，食用菌栽培时的温度一般高于20°C，从而 又具备了芽孢快速萌发生长所需的温度条件，因此孢子将很快打破休眠状态进入营养生长 阶段。然而芽孢休眠状态的打破，会减弱指示菌对常压蒸汽灭菌的抗力，故可降低或失去指 示灭菌效果的能力。因此，指示剂一旦加水后，应马上或尽快进入灭菌程序。然而在实际使 用过程中，指示剂加水后并不可能马上进入灭菌程序。这是因为每个常压蒸汽灭菌锅(或 灭菌室、灭菌池)的装量是很大的，小的可装1000个菌袋，大的可装6000多个菌袋，一般是 边装料袋边入锅，装满后才苫严灭菌池或将灭菌锅、室封口，而后通汽、升温灭菌，整个装袋 装锅过程约需要5 7小时。这样，在不同时间、不同位置所放置的指示剂的遇水时间就有 1 7个小时的差别。由此可见，提前遇到水的指示菌干芽孢就会吸水膨胀转向生长状态而 降低对常压蒸汽的抗力，晚遇到水的芽孢仍保持强的抗力，由于指示菌芽孢生理状态的不 同，从而造成在同一灭菌锅的指示剂指示灭菌的能力有很大差异，这一方面增加了灭菌效 果判定的难度，另一方面降低了判定结果的准确度。发明内容
本发明的目的就是要提供一种不受遇水时间长短影响的常压蒸汽灭菌生物指示 剂，同时提供一种该指示剂的制备方法。
本发明的目的是这样实现的
本发明所提供的常压蒸汽灭菌生物指示剂，包括有干培养基、指示菌片，其特征在 于所述的指示菌片为指示菌的芽孢附着在染菌载体片上，在该染菌载体片表面涂布有石 蜡、石蜡乳液或脂肪酸。
本发明中的干培养基是指加水后即可适于指示菌生长的培养基。即用于培养指示 菌的培养基标准配方中除水之外的、由其他固体成分组成的培养基。
注用于培养指示菌的培养基标准配方是指按照此配方制成的培养基可直按用于 培养指示菌的配方。
本发明指示剂在使用时，需向干培养基中加入标准培养基配方规定比例的水后方 可使用。故在以下表述中，1个指示剂中干培养基的量等于一定体积标准培养基中除水以外 各种固体成分用量之和。用其实际使用时加水后所形成的培养基在液态时的体积表示(单 位mL)。或简单表述为相当于培养基标准配方多少毫升。
本发明中的指示菌除选用棉籽壳抗热菌01号外，还可选用从其他种类的食用菌 栽培料中(如甘蔗渣、玉米芯、锯末等)筛选培养出的，能够在该栽培料营养水平上和食用 菌菌丝正常生长所需温度范围内(20 36°C)生长，且对该栽培料的常压灭菌具有指示能 力的耐热菌。选用的棉籽壳抗热菌01号为一种枯草芽孢杆菌，在中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心保藏，保藏名称为棉籽壳抗热菌01号，保藏编号为CGMCC No. 4153, 保藏日期2010年9月8日。
本发明所述的脂肪酸为软脂酸或硬脂酸中的任意一种；所说的石蜡为熔点在 50 70°C的石蜡；所说的石蜡乳液为熔点在50 70°C的石蜡乳化剂。
本发明中所说染菌载体片可以是纸片，也可以是滤纸。由于采用滤纸更易于干燥， 故优选滤纸。
本发明所提供的常压蒸汽灭菌生物指示剂的制备方法包括以下步骤
a、将指示菌接种至适合其生长的生芽孢细菌培养基斜面上，在34 36°C下培养， 芽孢生成后，用无菌水冲洗菌苔制成指示菌悬液，85 90°C下灭活20 25分钟，使指示菌 悬液中指示菌营养体灭活，震荡后静置或低速离心处理，取上清液，上清液即为指示菌芽孢 悬液母液，测定指示菌芽孢悬液母液的活孢子浓度，再用无菌水稀释指示菌芽孢悬液母液 为所需浓度的指示菌芽孢悬液；
b、吸取a步所制的所需浓度的指示菌芽孢悬液，滴加在染菌载体片上，使每一载 体片上附着有规定剂量(即1个指示剂应含的全部芽孢量)的指示菌芽孢，随后在36°C以 下干燥，即制成染菌载体片；
C、将染菌载体片放置在融化的石蜡或脂肪酸液体或石蜡乳液中浸渍，然后在36°C 以下干燥，即制成防水指示菌片；
d、将防水指示菌片与干培养基组合成一体。
本发明所提供的常压蒸汽灭菌生物指示剂，在常温下，指示菌片中的指示菌芽孢 在疏水物质石蜡或脂肪酸的保护下，可与水隔离。因而，在灭菌前，无论何时往指示瓶内加 入水，只要温度低于石蜡或脂肪酸的熔点时，石蜡或脂肪酸所形成的防水膜即可阻止指示 菌芽孢与水直接接触，因而即使指示菌片处于水中，指示菌片中的芽孢也无法吸收水分，而 依旧处于休眠状态。当温度高于其熔点时，石蜡或脂肪酸所形成的防水膜即被破坏，此时指 示菌片中的芽孢一边分散到培养基中，一边吸水分继而膨胀转为生长状态。由此可见本发 明指示菌片，其指示菌芽孢与水直接接触的时间，可通过温度来控制。由于在同一锅灭菌 时，起始温度基本是一致的，因此在采用本发明指示剂进行常压蒸汽灭菌效果测定时，不论 指示剂瓶内加水时间早晚，都能够保证指示菌芽孢实际接触水的时间是基本一致，从而有4效避免了同一灭菌锅的指示剂由于加水时间前后不一，而导致通过指示剂指示灭菌能力不 一的问题。
图1是本发明实施例1所采用的棉籽壳抗热菌01号菌株的脂肪酸组成气相色谱 图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但其并不对本发明的保护范围做 不利的限定。
以下实施例中所要制备的指示剂，均用100毫升输液瓶封装，指示剂芽孢浓度均 为4X IO6个/毫升，1个指示剂中的干培养基的量均为40毫升培养基标准配方中所含的干 物质的量，染菌载体片均为1X1. 5厘米大小的滤纸片。
实施例1以棉籽壳抗热菌01号为指示菌，制备本发明指示剂。
该指示剂由棉籽壳抗热菌01号防水指示菌片及其干培养基(加水后用于棉籽壳 抗热菌01号指示菌的恢复生长，为无菌状态)组成。石蜡、硬脂酸、软脂酸、石蜡乳液中的 任一种均可用作制防水指示菌片的防水材料。
(一 )制备防水指示菌片
(1)制取指示菌芽孢悬液
将棉籽壳抗热菌01号指示菌划线接种在生芽孢细菌培养基试管斜面上，34 36°C下培养48小时，20°C下培养72小时；用10毫升无菌水洗脱掉菌苔，洗脱液倒入15毫 升无菌离心管中；振荡器振荡菌苔悬液15分钟；在烘箱内热处理装菌苔悬液的离心管，当 菌苔悬液温度达90°C后持续20分钟，以杀死菌苔悬液中的指示菌营养体；离心10分钟 (500r· rniiT1)，弃去管底沉淀物，将上清液倒入另一个无菌离心管内即为指示菌芽孢悬液 母液，采用平板计数法测定指示菌芽孢悬液母液中活孢子浓度。
上述的生芽孢细菌培养基，其1000毫升配方为胰蛋白胨10克，葡萄糖5克，氯化 钠8克，硫酸锰0. 3克，琼脂20克，水定容至1000毫升。分装在18 X 180毫米试管内，每管 分装10毫升，121°C下灭菌30分钟，出锅摆放成斜面。
用于平板计数的培养基，其1000毫升配方为胰蛋白胨10克，葡萄糖5克，氯化钠 8克，琼脂20克，水定容至1000毫升。121°C下灭菌30分钟，出锅后无菌条件下用9厘米平 皿制成平板。
(2)配制制备染菌载体片所需浓度的指示菌芽孢悬液
染菌载体片所需浓度的指示菌芽孢悬液可根据制作指示剂时的规格要求及染菌 载体所承载的适宜菌液量来确定。
1张染菌载体片应含的指示菌芽孢总数=1个指示剂所含指示菌芽孢总数=指示 剂芽孢浓度(个/毫升)X1个指示剂实际使用时的培养基量(毫升)
指示剂芽孢浓度为1个指示剂中的干培养基在实际使用时每毫升中含芽孢的个数。
根据指示剂芽孢浓度GXlO6个/毫升)，可计算出指示剂中1张染菌载体片应含指示菌芽孢总数为4X IO6X 40 = 1.6 X IO8个。
染菌载体片所需指示菌芽孢悬液浓度=1张染菌载体片应含的指示剂芽孢总 数+染菌载体染菌量(毫升)。
预备试验得知，1X1.5厘米大小滤纸片承载的适宜菌液量为20微升，如此，染菌 载体片所需指示菌芽孢悬液浓度即为1. 6X IO8个+20微升=8X IO9个/毫升。
根据上述(1)步中指示菌芽孢悬液母液的浓度，可配制出染菌载体片所需浓度 的指示菌芽孢悬液，若(1)步中所配制的指示菌芽孢悬液母液的浓度高于IO9个/毫升， 则用无菌水将其稀释到8X IO9个/毫升浓度；若其浓度低于IO9数量级，则离心15分钟 (8000r · rnirT1)后取沉淀物，再用无菌水稀释至所需浓度。
(3)制备染菌载体片
将滤纸裁成1X1.5厘米大小的纸片，装入塑料袋内，121°C下灭菌30分钟，将纸片 排在无菌土壤筛的筛底上，用微量加液器吸取上一步已配制至所需浓度的指示菌芽孢悬液 20微升，滴加在纸片的中央位置，纸片吸收水分后，放置在30°C鼓风培养箱内快速干燥。
(4)给染菌载体片做防水涂层(可采用以下①-④中的任意一种方式)
①用熔点在58 60°C的石蜡做防水涂层在无菌室内，将装有熔点为58 60°C 的石蜡(该石蜡由天津福晨化学试剂厂生产)放在烧杯内，置于66 68°C烘箱内融化，用 镊子夹住滤纸片的一角，在熔化的石蜡内浸渍后，36°C下摊凉在无菌土壤筛底上，凝固后， 即制成以石蜡作防水涂层的防水指示菌片。
②用软脂酸做防水涂层将染菌载体片放置在融化的软脂酸液体中浸渍，然后在 36 °C以下干燥，即制成以软脂酸作防水涂层的防水指示菌片。
③用硬脂酸做防水涂层将染菌载体片放置在融化的硬脂酸液体中浸渍，然后在 36°C以下干燥，即制成以硬脂酸作防水涂层的防水指示菌片。
④用石蜡乳液做石蜡防水涂层将染菌载体片放置在石蜡乳液中浸渍，然后在 36°C以下干燥，纸片水分蒸发后留下石蜡，同样成为石蜡作防水涂层的防水指示菌片。本例 所用石蜡乳液以56°C 58°C半精炼石蜡为主要原料生产，含固量40%，pH 6 7，生产单 位藁城市西城工业区宽力乳液厂。
制好的防水指示菌片装入复合塑料袋内，封口后4 6°C下存放。
( 二)将防水指示菌片与干培养基组合成一体。
本实施例中指示剂干培养基所依据的培养基标准配方为胰蛋白胨1克，葡萄糖 0.5克，氯化钠0.8克，琼脂粉2.0克，水100毫升。配制一个(瓶)指示剂用干培养基的 量(等于按培养基标准配方配制40毫升时所需除水以外各种材料的量)是无菌胰蛋白胨 0. 4克、葡萄糖0. 2克、氯化钠0. 32克、琼脂粉0. 8克，各种材料总重1. 72克。
往1个100毫升无菌输液瓶内放1张防水指示菌片、无菌胰蛋白胨0. 4克、葡萄糖 0. 2克、氯化钠0. 32克、琼脂粉0. 8克，丁基胶塞、铝盖封口，即制成1个用棉籽壳抗热菌01 号作指示菌的本发明指示剂。
(三)棉籽壳抗热菌01号的来源。
绵籽壳抗热菌01号为从棉籽壳栽培料中筛选出的具有指示棉籽壳栽培料常压灭 菌效果的指示菌，鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，在北京市朝阳区北辰西路1 号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏名称为棉籽壳抗热菌01号，保藏编号CGMCC No. 4153，保藏日期2010年9月8日。
(1)形态学特征为革兰氏阳性、菌体杆状，单个排列，好氧，芽孢椭圆形。
(2)生理生化特征为经Biolog Microplate GP检测(24小时培养)， 可利用95种碳源中的如下类型β -Methyl-D-Glucoside ( β -甲基_D_葡萄糖 苷)，α -Methyl-D-Glucoside (α -甲基-D-葡萄糖苷)，α -D-Glucose ( α -D-葡萄 糖)，Tween80 (吐 80)，Tween 40 (吐温 40)，Turanose (松二糖)，Sucrose (蔗糖)， N-Acetyl-D-Glucosamine (N-乙酰氨基葡萄糖)，Maltotriose (麦芽三糖)，Maltose (麦 芽糖)，L-Fucose (L-岩藻糖)，L-Arabinose (L-阿拉伯糖)，Glycerol (丙三醇)， Gentiobiose (龙胆二糖)，D-Xylose (D-木糖)，D-Trehalose (D-海澡糖)，D-Ribose (D-核 糖)，D-Psicose (D-阿洛酮糖)，D-Mannose (D-甘露糖)，D-Mannitol (D-甘露醇)， D-Fructose (D-果糖)，Dextrin (糊精)，D-Cellobiose (纤维二糖)，2，3-Butanediol (2， 3- 丁二醇)，其他为阴性，详见表2。
表2 =Biolog碳源利用测定结果
权利要求
1.一种常压蒸汽灭菌生物指示剂，包括有干培养基、指示菌片，其特征在于所述的指示 菌片为指示菌的芽孢附着在染菌载体片上，在该染菌载体片表面涂布有石蜡、石蜡乳液或 脂肪酸。
2.根据权利要求1所述的生物指示剂，其特征在于所说的指示菌是从食用菌栽培料中 筛选培养出的，对食用菌栽培料常压灭菌具有指示能力的耐热菌。
3.根据权利要求1所述的常压蒸汽灭菌生物指示剂，其特征在于所说的指示菌为棉籽 壳抗热菌01号，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏名称为棉籽 壳抗热菌01号，保藏编号为CGMCC No. 4153，保藏口期2010年9月8日。
4.根据权利要求1或2或3所述的常压蒸汽灭菌生物指示剂，其特征在于所说的脂肪 酸为软脂酸或硬脂酸中的任意一种。
5.根据权利要求1或2或3所述的常压蒸汽灭菌生物指示剂，其特征在于所说的石蜡 为熔点在50 70°C的石蜡。
6.根据权利要求1或2或3所述的常压蒸汽灭菌生物指示剂，其特征在于所说染菌载 体片为滤纸。
7.—种权利要求1所述的常压蒸汽灭菌生物指示剂的制备方法，其特征在于它包括以 下步骤a、将指示菌接种至生芽孢细菌培养基斜面上，在34 36°C下培养，芽孢生成后，用无 菌水冲洗菌苔制成指示菌悬液，85 90°C下灭活20 25分钟，震荡后静置或低速离心处 理，取上清液，测定上清液活孢子浓度，再用无菌水稀释为所需浓度的指示菌芽孢悬液；b、吸取a步所制的指示菌芽孢悬液，滴加在染菌载体片上，使每一载体片上附着有规 定剂量的指示菌芽孢，随后在36°C以下干燥，即制成染菌载体片；C、将染菌载体片放置在融化的石蜡、石蜡乳液或脂肪酸液体中浸渍，然后在36°C以下 干燥，即制成防水指示菌片；d、将防水指示菌片与干培养基组合成一体。
全文摘要
本发明公开了一种常压蒸汽灭菌生物指示剂及其制备方法，它包括有干培养基、指示菌片。所述的指示菌片为指示菌的芽孢附着在染菌载体片上，在该染菌载体片表面涂布有石蜡、石蜡乳液或脂肪酸。制备方法为将指示菌接种至生芽孢细菌培养基斜面上培养，芽孢生成后制成指示菌悬液；吸取指示菌芽孢悬液，滴加在染菌载体片上，即制成染菌载体片；将染菌载体片放置在融化的石蜡或脂肪酸液体或石蜡乳液中浸渍，然后干燥即制成防水指示菌片；将防水指示菌片与干培养基组合成一体。本发明指示剂进行常压蒸汽灭菌效果测定时，不论指示剂瓶内加水时间早晚，都能够保证指示菌芽孢实际接触水的时间是基本一致，从而有效避免了同一灭菌锅的指示剂由于加水时间前后不一，而导致通过指示剂指示灭菌能力不一的问题。
文档编号C12Q1/04GK102041292SQ20101053092
公开日2011年5月4日 申请日期2010年11月4日 优先权日2010年11月4日
发明者王世清, 王朝江, 董庆武, 袁永昌, 高春燕 申请人:河北省农林科学院遗传生理研究所