制备蛋白质酯和蛋白质亚基酯的方法

专利名称：制备蛋白质酯和蛋白质亚基酯的方法
技术领域：
本发明涉及通过利用脂质酰基转移酶对脂质进行生物转化以制备碳水化合物酯 和/或蛋白质酯和/或蛋白质亚基酯和/或羟基酸酯(hydroxy acidester)的方法。本发明还涉及脂质酰基转移酶在对脂质进行生物转化使其成为以下一或多种物 质中的用途碳水化合物酯和/或蛋白质和/或蛋白质亚基酯和/或羟基酸酯。本发明还涉及本文固定化的脂质酰基转移酶的用途，该固定化的脂质酰基转移 酶可用于在高水分环境中对脂质进行生物转化以制备一或多种碳水化合物酯和/或蛋白 质酯和/或蛋白质亚基酯和/或羟基酸酯。本发明还涉及固定化的脂质酰基转移酶.
背景技术：
脂酶已经广泛用于脂质的生物转化以制备高价值产品，例如糖酯，以便用 于广泛的工业中，包括食品和/或饲料工业，化妆品和/或皮肤护理工业，油化学 (oleochemical)工业和制药工业。当生物转化过程需要脂质底物水解时，脂解酶可用于高水分环境中。然而，当 生物转化过程需要酯交换反应或酯基转移反应诸如通过醇解，由于不需要的水解反应利 用酯酶高水分环境可以是有害的，所述不需要的水解反应可导致不需要的生物产物和/ 或使得生物转化产物的产量较低。通常，需要酯交换作用和/或酯基转移作用的生物转化过程利用非-水环境中的 酯酶，所述非-水环境诸如油系统和/或有机溶剂系统诸如丁醇，甲醇或己烷。这样的 系统提供这样的环境，其中极性受体分子和脂质供体分子可以至少部分溶解，且所述酯 酶具有足够的酶活性。尽管少量水是任何酶活性所需的，水的量严格保持在较低水平以 避免该酶的水解活性。通常，糖酯，蛋白质酯，羟基酸酯已经通过化学合成利用无机催化物产生。常 规生物转化法制备糖酯或羟基酸酯利用有机溶剂环境或仅存在少量水的超临界液体中的酯酶。Lecointe et al Biotechnology Letters, Vol 18., No.8 (August)，pp869-874 公开了 对多种脂酶的研究，以及它们在含水介质中的活性，所述研究根据分别来自甲醇和丁醇 的甲基酯或丁基酯。Lecointe et al教导来自近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)的酯酶/
酰基转移酶，其随甲醇或丁醇浓度增加显示降低的水解活性以及增强的产生甲基酯和丁 基酯的能力。来自近平滑念珠菌的酯酶/酰基转移酶在制备脂肪羟氨基(hydroxamic)酸 中的用途在 Vaysseetal J.of Biotechnology 53 (1997) 41-46 中教导。脂酶胆固醇酰基转移酶(cholesterol acyltransferase)已经是已知的(参见例如 Buckley-Biochemistry伯克利生物化学1983，22，5490-5493)。具体地，已经发现甘油磷 脂胆固醇酰基转移酶(GCAT)，它很象植物和/或哺乳动物卵磷脂胆固醇酰基转移酶 (LCAT)，可以催化脂肪酸在卵磷脂与胆固醇之间的转移。厄普顿(Upton)和伯克利(Buckley)(TIBS 20，May 1995p 178-179)及布鲁米尔 科(Brumlik)和伯克利(Buckley) (J.of Bacteriology Apr. 1996 p2060-2064)教导了源自嗜水 气单胞菌(Aeromonahydrophila)的脂酶/酰基转移酶能够在水介质中将酰基转移到乙醇 受体上。

发明内容
本发明第一方面提供了制备一或多种碳水化合物酯，蛋白质酯，蛋白质亚 基酯或羟基酸酯的方法，所述方法包括将酰基供体，酰基受体与水混合以产生包含 5-98%水的高水分环境，其中所述酰基供体是脂质底物，其选自由磷脂，溶血磷脂 (Iysophospholipid),甘油三酯，甘油二酯，糖脂或溶血糖脂(Iysoglycolipid)组成的组中 的一或多种，且所述酰基受体是选自由碳水化合物，蛋白质，蛋白质亚基，或羟基酸组 成的组中的一或多种物质；以及将所述混合物与脂质酰基转移酶接触，使得所述脂质酰 基转移酶催化以下反应中的一或所有两种醇解或酯基转移作用。本发明另一方面提供脂质酰基转移酶在制备一或多种碳水化合物酯，蛋白质 酯，蛋白质亚基酯或羟基酸酯中的用途，其可通过在酰基供体，酰基受体与水的混合物 中催化醇解和/或酯基转移作用进行，所述混合物包含5-98%水，其中所述酰基供体是 脂质底物，其选自由磷脂，溶血磷脂，甘油三酯，甘油二酯，糖脂或溶血糖脂组成的组 中的一或多种，且所述酰基受体是选自由碳水化合物，蛋白质，蛋白质亚基，或羟基酸 组成的组中的一或多种物质。根据本发明另一方面，提供了通过本发明的方法制备的碳水化合物酯，蛋白质 酯，蛋白质亚基酯或羟基酸酯。根据本发明另一方面，提供了通过本发明的方法制备的药物，化妆品，食品， 颜料(paint)，包含碳水化合物酯，蛋白质酯，蛋白质亚基酯或羟基酸酯。根据本发明另一方面，提供了本发明所述的固定化的脂质酰基转移酶。本发明所涉及内容的小结1.制备一或多种碳水化合物酯，蛋白质酯，蛋白质亚基酯或羟基酸酯的方法， 所述方法包括将酰基供体，酰基受体与水混合以产生含5-98%水的高水分环境，其中所 述酰基供体是脂质底物，其选自由磷脂，溶血磷脂，甘油三酯，甘油二酯，糖脂或溶血糖脂组成的组中的一或多种，且所述酰基受体是选自由碳水化合物，蛋白质，蛋白质亚 基，或羟基酸组成的组中的一或多种物质；以及将所述混合物与脂质酰基转移酶接触， 使得所述脂质酰基转移酶催化以下反应中的一或所有两种醇解或酯基转移作用。2.如1的方法，其中所述脂质酰基转移酶是固定化的。3.如1或2的方法，其中所述方法包括纯化所述碳水化合物酯，蛋白质酯，蛋白
质亚基酯，羟基酸酯。4.如1-3中任一项的方法，其中所述脂质酰基转移酶的特征是，其为具有酰基转 移酶活性并包含氨基酸基序GDSX的酶，其中X是以下氨基酸残基中的一或多种L， A, V，I，F, Y, H, Q, Τ, N, M 或 S。5.如前述任意一项所述的方法，其中所述脂质酰基转移酶包含H-309，或包含组 氨酸残基，该组氨酸位于与SEQ ID No.2或SEQ ID No.32所示嗜水气单胞菌脂解酶的氨 基酸序列中的His-309相对应的位置。6.如前述所述的方法，其中所述的脂质酰基转移酶可以从一或多种下列属的生 物体获得气单胞菌、链霉菌、酵母菌、乳球菌、分枝杆菌、链球菌、乳杆菌、脱亚硫 酸菌、芽胞杆菌、弯曲杆菌、弧菌科、木杆菌、硫化叶菌、曲霉、裂殖酵母、李司忒氏 菌、奈瑟氏球菌、Mesorhizobium、雷尔氏菌、黄单胞菌和念珠菌。7.如前述任意一项所述的方法，其中所述脂质酰基转移酶包含一种或多种以下 氨基酸序列(i) SEQ ID No.2所示氨基酸序列；(ii)SEQ IDNo.3所示氨基酸序列；(iii) SEQ ID No.4所示氨基酸序列；(iv) SEQ ID No.5所示氨基酸序列；(v) SEQ ID Νο.6所示 氨基酸序列；(vi) SEQ ID No. 12所示氨基酸序列；(vii) SEQ ID No.20所示氨基酸序列； (viii) SEQ ID No.22所示氨基酸序列；(ix) SEQ ID No.24所示氨基酸序列；(x) SEQ ID Νο.26所示氨基酸序列；(xi) SEQ ID Νο.28所示氨基酸序列；(xii) SEQ ID No.30所示氨基 酸序列；(xiii) SEQ ID No.32所示氨基酸序列；(xiv) SEQ ID No.34所示氨基酸序列，或 者与 SEQIDNo.2，SEQ ID No.3, SEQ ID No.4, SEQ ID No.5, SEQ ID No.6, SEQ ID No.12，SEQ ID No.20, SEQ ID No.22, SEQ ID No.24, SEQ ID No.26, SEQ ID No.28, SEQ ID No.30, SEQ ID No.32,或SEQ ID No.34所示的任意一种序列有75%或者75%以 上同一性的氨基酸序列。8.脂质酰基转移酶在制备一或多种碳水化合物酯，蛋白质酯，蛋白质亚基酯或 羟基酸酯中的用途，所述制备通过对酰基供体，酰基受体与水的混合物的醇解和/或酯 基转移作用来实施，所述混合物包含5-98%水，其中所述酰基供体是脂质底物，其选自 由磷脂，溶血磷脂，甘油三酯，甘油二酯，糖脂或溶血糖脂组成的组中的一或多种，所 述酰基受体是选自由碳水化合物，蛋白质，蛋白质亚基，或羟基酸组成的组中的一或多 种物质。9.如8所述的用途，其中所述脂质酰基转移酶是固定化的。10.如8所述的用途，其中所述碳水化合物酯，蛋白质酯，蛋白质亚基酯或羟基 酸酯是经纯化的。11.如8-10中任一项所述的用途，其中所述脂质酰基转移酶的特征在于其为这样 一种酶，它具有酰基转移酶活性，并包含氨基酸基序GDSX，其中X是以下氨基酸残基 中的一种或多种残基L，A，V，I，F，Y，H, Q, T，N，M或S。
12.如8-10中任一项所述的用途，其中所述脂质酰基转移酶包含H-309，或包含 组氨酸残基，该组氨酸位于与SEQ ID No.2或SEQ ID No.32所示嗜水气单胞菌脂解酶的 氨基酸序列中的His-309相对应的位置。13.如8-12中任一项所述的用途，其中所述的脂质酰基转移酶可以从一或多种 下列属的生物体获得气单胞菌、链霉菌、酵母菌、乳球菌、分枝杆菌、链球菌、乳 杆菌、脱亚硫酸菌、芽胞杆菌、弯曲杆菌、弧菌科、木杆菌、硫化叶菌、曲霉、裂殖酵 母、李司忒氏菌、奈瑟氏球菌、Mesorhizobium、雷尔氏菌、黄单胞菌和念珠菌。14.如8-13中任一项所述的用途，其中所述脂质酰基转移酶包含一种或多种以下 氨基酸序列(i) SEQ ID No.2所示氨基酸序列；(ii)SEQ IDNo.3所示氨基酸序列；(iii) SEQ ID No.4所示氨基酸序列；(iv) SEQ ID No.5所示氨基酸序列；(v) SEQ ID Νο.6所示 氨基酸序列；(vi) SEQ ID Νο.12所示氨基酸序列；(vii) SEQ ID No.20所示氨基酸序列； (viii) SEQ ID No.22所示氨基酸序列；(ix) SEQ ID No.24所示氨基酸序列；(x) SEQ ID Νο.26所示氨基酸序列；(xi) SEQ ID Νο.28所示氨基酸序列；(xii) SEQ ID No.30所示氨基 酸序列；(xiii) SEQ ID No.32所示氨基酸序列；(xiv) SEQ ID No.34所示氨基酸序列，或 者与 SEQIDNo.2，SEQ ID No.3, SEQ ID No.4, SEQ ID No.5, SEQ ID No.6, SEQ ID No.12，SEQ ID No.20, SEQ ID No.22, SEQ ID No.24, SEQ ID No.26, SEQ ID No.28, SEQ ID No.30, SEQ ID No.32,或SEQ ID No.34所示的任意一种序列有75%或者75%以 上同一性的氨基酸序列。15.碳水化合物酯，其通过前述1-7任一项所述的方法产生。16.蛋白质酯，其通过前述1-7任一项所述的方法产生。17.蛋白质亚基酯，其通过前述1-7任一项所述的方法产生。18.羟基酸酯，其通过前述1-7任一项所述的方法产生。19.固定化的脂质酰基转移酶。20.如19所述的固定化的脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶的特征在于 其为这样一种酶，它具有酰基转移酶活性，并包含氨基酸基序GDSX，其中X是以下氨 基酸残基中的一种或多种残基L，A，V，I，F，Y，H, Q, T，N，M或S。21.如19或20的固定化的脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移酶包含 H-309,或包含组氨酸残基，该组氨酸位于与SEQ ID No.2或SEQ IDNo.32所示嗜水气单 胞菌脂解酶的氨基酸序列中的His-309相对应的位置。22.如19-21中任一项所述的固定化的脂质酰基转移酶，其中所述的脂质酰基转 移酶可以从一或多种下列属的生物体获得气单胞菌、链霉菌、酵母菌、乳球菌、分枝 杆菌、链球菌、乳杆菌、脱亚硫酸菌、芽胞杆菌、弯曲杆菌、弧菌科、木杆菌、硫化叶 菌、曲霉、裂殖酵母、李司忒氏菌、奈瑟氏球菌、Mesorhizobium、雷尔氏菌、黄单胞菌 和念珠菌。23.如19-22中任一项所述的固定化的脂质酰基转移酶，其中所述脂质酰基转移 酶包含一种或多种以下氨基酸序列(i) SEQ ID No.2所示氨基酸序列；(ii) SEQ ID No.3 所示氨基酸序列；(iii) SEQ ID No.4所示氨基酸序列；(iv)SEQ ID No.5所示氨基酸序 列；(ν) SEQ ID No.6所示氨基酸序列；(vi) SEQ ID No.12所示氨基酸序列；(vii) SEQ ID No.20所示氨基酸序列；(viii) SEQ ID No.22所示氨基酸序列；(ix) SEQ ID No.24所示氨基酸序列；(x) SEQID No.26所示氨基酸序列；(xi) SEQ ID No.28所示氨基酸序列；(xii) SEQ IDNo.30 所示氨基酸序列；(xiii) SEQ ID No.32 所示氨基酸序列；(xiv) SEQ IDNo.34 所示氨基酸序列，或者与 SEQIDNo.2，SEQ ID No.3, SEQ ID No.4, SEQ ID No.5, SEQ IDNo.6，SEQ ID No. 12, SEQ ID No.20, SEQ ID No.22, SEQ ID No.24, SEQ ID No.26, SEQ ID No.28, SEQ ID No.30, SEQ ID No.32,或 SEQ ID No.34 所示的任意一种序列有 75 %或者75 %以上同一性的氨基酸序列。发明详述本文应用的术语“脂质酰基转移酶”是指一种也具有脂酶活性的酶(根据 国际生物化学分子生物学联合会命名委员会的酶命名法推荐(EnzymeNomenclature Recommendations) (1992)通常分类为E.C.3.U.X)，该酶也具有酰基转移酶活性(通常分 类为E.C.2.3.1.X)，该酶能够将酰基从一种脂质转移到一种或多种受体底物，例如以下物 质的一种或多种碳水化合物、蛋白质或其亚单位或羟基酸。优选，本发明的“酰基受体”不是水。一方面，优选所述酶能够将酰基从脂质底物转移到碳水化合物。碳水化合物酰基受体可以为以下物质中的一种或多种单糖、二糖、寡 糖或多糖。优选的碳水化合物是以下物质中的一种或多种葡萄糖、果糖、脱 水果糖(anhydrofractose)、麦芽糖、乳糖、蔗糖、半乳糖、木糖(xylose)、木寡糖 (xylooligosacharide)、阿拉伯糖、麦芽寡糖(maltooligosaccharide)、塔格糖(tagatose)、 microthecin、ascopyrone P> ascopyrone T 或 cortalcerone。碳水化合物酯可作为有价值的乳化剂在例如食品中起作用。一方面，优选所述酶能够将酰基从脂质底物转移到蛋白质和/或蛋白质亚基。优选所述蛋白质亚基是以下物质中的一种或多种氨基酸，蛋白质水解产物， 肽，二肽，寡肽，多肽。适宜的蛋白质可以是食品中例如在乳制品和/或肉制品中的一种或多种蛋白 质。仅作为实例，适宜的蛋白质可能是乳凝块或乳清中的蛋白质，如乳球蛋白。其 它适宜的蛋白质包括卵清蛋白(来自蛋类)、麸蛋白(gliadin)、麦谷蛋白(glutenin)、 puroindoline>来自谷物的脂质转移蛋白和肉中的肌球蛋白，或以下乳蛋白酪蛋白，乳 白蛋白(lactalbulin)和乳铁传递蛋白(lactoferrin)。适宜地，在所述蛋白质或蛋白质亚基中，所述酰基受体可以是以下蛋白质或蛋 白质亚基组分中的一种或多种丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，或半胱氨酸。当所述蛋白质亚基是氨基酸时，适宜地所述氨基酸可以是任何氨基酸，优选所 述氨基酸是例如丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸或半胱氨酸中的一或多种。一方面，优选所述酶能将酰基从脂质底物转移到羟基酸。适宜地，所述羟基酸是以下酸中的一种或多种柠檬酸，酒石酸，乳酸，抗 坏血酸，羟基乙酸，苹果酸，a -羟基醋酸(alpha-hydroxylethjffloic acid)，a -羟基 辛酸(alpha-hydroxyoctanoic acid)， a -轻基辛酸(alpha-hydroxycaprylicacid)，轻基辛 酸(hydroxycaprylic acid),葡糖酸，乳糖酸(lactobionic acid)或麦芽糖酸(maltobionic acid) o适宜地，所述羟基酸可以是水果酸(frait acid)，例如苹果酸，乳酸，酒石酸，柠
9檬酸或羟基乙酸中的一种或多种。一个实施方案中，优选所述羟基酸是柠檬酸，乳酸，酒石酸或苹果酸中的一种 或多种。本文术语“羟基酸”指其中烷基的一或多个氢原子被羟基取代的羧酸。一方面，所述脂质酰基转移酶可将酰基从脂质底物转移到碳水化合物，蛋白质 亚基或羟基酸中的一种或多种，所述脂质酰基转移酶还可将酰基从脂质转移到固醇和/ 或stanol,具体是phytosterol禾口 /或hytostanol中的一种或多种。适宜地，当所述脂质底物是磷脂，其可为卵磷脂，例如磷脂酰胆碱。本文术语 卵磷脂包括磷脂酰胆碱，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰肌醇，磷脂酰丝氨酸和磷脂酰甘油.适宜地，当脂质底物是溶血磷脂，其可为溶血卵磷脂，例如溶血磷脂酰胆碱。 本文术语溶血磷脂酰胆碱与术语溶血卵磷脂同义，这些术语可互换使用。适宜地，当脂质底物是糖脂，其可为例如双半乳糖甘油二酯(DGDG)。所述脂质底物可称为“脂质酰基供体”或“酰基供体”。这些术语可互换使 用。一些方面，优选脂质酰基转移酶针对其起作用的脂质底物是磷脂，诸如卵磷 脂，例如磷脂酰胆碱.一些方面，优选所述脂质底物是糖脂，诸如DGDG。一些方面，所述脂质底物可以是食品脂质，即食品的脂质组分。在一些方面，优选地，本发明的脂质酰基转移酶不能或基本不能作用于甘油三 酯和/或1-甘油单酯和/或2-甘油单酯。脂质底物或脂质酰基供体宜为一种或多种脂质，其存在于一种或多种下列底 物中脂肪，包括猪油(lard)、牛羊油(tallow)、乳脂(butter fat)；油，包括从棕榈油 (palm oil)、葵花子油(sunflower oil)、大豆油(soya bean oil)、红花油(safflower oil)、棉 籽油(cotton seed oil)、花生油(ground nut oil)、玉米油(corn oil)、橄榄油(olive oil)、花 生油(peanut oil)、椰子油(coconut oil)和油菜籽油(rape seed oil)中提取或由它们衍生的 油。来自大豆、油菜籽、或蛋黄的卵磷脂也是适宜的脂质底物。脂质底物也可以是燕麦 脂质或其它包含半乳糖脂的基于植物的物质。在本发明的一些方面，脂质可选自脂肪酸链长为8-22碳的脂质。本发明的一些方面，脂质可选自脂肪酸链长为16-22碳的脂质，更优选为16-20 碳的脂质。本发明的一些方面，脂质可选自脂肪酸链长不多于14碳的脂质，适宜地选自脂 肪酸链长4-14碳的脂质，适宜地为4-10碳的脂质，适宜地为4-8碳的脂质。优选所述酰基供体不是游离脂肪酸。优选，所述酰基供体不是碳水化合物(糖)酯。适宜地，本发明中的脂质酰基转移酶可显示出一种或多种下列脂酶的活性糖 脂酶活性(E.C.3丄1.26)，甘油三酯酶活性(E.C.3.1丄3)，磷脂酶A2活性(E.C.3.U.4)， 磷脂酶A1活性(E.C.3.1丄32)。这里应用的术语“糖脂酶活性”包括“半乳糖脂酶活 性，，。适宜地，本发明中的脂质酰基转移酶具有至少一种或多种下列活性糖脂酶活性(E.C.3.1.1.26)和 / 或磷脂酶 A1 活性(E.C.3.1.1.32)和 / 或磷脂酶 A2 活性(E.C.3.1.1.4)。对于本发明一些方面，脂质酰基转移酶至少具有糖脂酶活性(E.C.3.1丄26)。适宜地，对于一些方面，本发明的脂质酰基转移酶可将酰基从糖脂和/或磷脂 上转移到以下一种或多种受体底物碳水化合物，蛋白质，甘油羟基酸。—些方面，优选本发明的脂质酰基转移酶可将酰基从糖脂和/或磷脂转移到碳 水化合物，形成至少碳水化合物酯。一些方面，优选本发明的脂质酰基转移酶可将酰基从糖脂或磷脂转移到蛋白质 或蛋白质亚基，形成至少蛋白质酯(或蛋白质脂肪酸缩合物)或蛋白质亚基酯。本文术语“蛋白质亚基酯”酯从任何蛋白质亚基形成的酯，诸如二肽酯，，寡 肽酯，多肽酯或蛋白质水解产物酯。一些方面，优选本发明脂质酰基转移酶不表现甘油三酯酶活性(E.C.3.1丄3)。优选地，本发明所述的脂质酰基转移酶可以用下列标准来表征⑴该酶具有酰基转移活性(可定义为酯转移活性)，由此将脂质酰基供体的原 始酯键上的酰基部分转移到一或多种碳水化合物，蛋白质，蛋白质亚基或羟基酸酰基受 体形成新酯，即碳水化合物酯，蛋白质酯，蛋白质亚基酯或羟基酸酯；和(ii)该酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是下列氨基酸残基L，A，V，I， F，Y，H, Q, T，N，M或S中的一种或多种。优选地，GDSX基序中的X是L，这样，本发明所述的酶优选包含氨基酸基序 GSDL。GDSX基序是由四种保守氨基酸构成。优选地，所述基序中的丝氨酸是脂质酰 基转移酶的催化性丝氨酸。适宜地，GDSX基序中的丝氨酸可以在与嗜水气单胞菌脂 解酶中与 Ser-16 相应的位置，如 Bramlik 和 Buckley (Journal of Bacteriology Apr. 1996, Vol.1, No.7，p 2060-2064)的教导。为确定一种蛋白质是否含有本发明所述GDSX基序，优选将该序列与Pfam数据 库中的隐藏markov模型图谱(model profile) (HMM图谱)进行比较。Pfam是蛋白质结构域家族的数据库。Pfam包括用于每个家族的辅助(curated)多 重序列比对以及用于鉴定新序列中的这些结构域的隐藏Markov模型图谱(HMM图谱)。 对 Pfam 的介绍见于 Bateman A 等.(2002) NucleicAcids Res.30 ； 276-280。隐藏 Markov 模 型被应用于许多旨在对蛋白质进行分类的数据库中，综述见Bateman A和Haft DH (2002) Brief Bioinform3 ； 236-245。http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi ？ cmd = Retrieve&db = PubMed&list uids = 12230032&dopt = Abstracthttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi ？ cmd = Retrieve&db = PubMed&list uids = 11752314&dopt = Abstract对隐藏Markov模型的详细解释和这些模型如何在Pfam数据库中应用参见Durb 中 R， EddyS，禾口 Krogh A (1998) Biological sequence 分析；probabilistic models of proteins and nucleic acids.Cambridge University Press, ISBN 0-521-62041-4 (Durb 中 R，Eddy S，和KroghA(1998)生物序列分析，蛋白质和核苷酸概率模型，剑桥大学出版，ISBN 0-521-62041-4。Hammer程序包可以从华盛顿大学，St Louis，USA获得。
可选择地，GDSX基序可以通过应用Hammer软件包识别，说明由Durb中 R, Eddy S，禾口 Krogh A (1998) Biological sequence 分析；probabilisticmodels of proteins and nucleic acids.Cambridge University Press, ISBN0—521-62041-4 (Durb 中 R, Eddy S, 和KroghA(1998)生物序列分析，蛋白质和核苷酸概率模型，剑桥大学出版，ISBN 0-521-62041-4)及其中的参考文献提供，以及本说明书中关于HMMER2的资料。PFAM数据库可以通过，例如，目前位于如下网址的几个服务器进行访问http: / / www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/index.shtmlhttp://pfam.wustl.edu/http: / / pfam.jouy.inra.fr/http://pfam.cgb.ki.se/数据库提供了检索工具，在此可以输入蛋白质序列。应用数据库的默认参数， 对蛋白质序列中Pfam结构域的存在进行分析。GDSX结构域是在数据库中已建立的区 域，因此任何查询序列中存在的该结构域可以得到识别。数据库将返回Pfam00657共有 序列与查询序列的比对。多重比对，包括杀鲑气单胞菌或嗜水气单胞菌可以通过下列方法获得a)手工方法通过上述程序，可获得目的蛋白与Pfam00657保守序列的比对并获得P10480序 列与Pfam00657保守序列的比对；或b)通过数据库在鉴定Pfam00657共有序列之后，数据库提供选项显示查询序列与Pfam00657 保守序列的种子比对(seed alignment)，P10480是该种子比对的一部分，且表示为GCAT AERHY。查询序列和P10480都将在同一窗口显示。嗜水气单胞菌参比序列嗜水气单胞菌GDSX脂酶的残基在NCBI文件P10480中进行编号，所述文本中 的编号是指由该文件给出的编号，在本发明中它用来确定具体的氨基酸残基，所述具体 的氨基酸残基在优选具体实施方案中，存在于本发明的脂质酰基转移酶中。实施Pfam比对(图33和34)下列保守的残基可被识别，并且在优选的实施方案中存在于本发明的组合物和 方法所应用的酶中。1 区-GDSX 区hid hid hid hid Gly Asp Ser hid28 29 30 31 32 33 34 352 区-GANDY 区hid Gly hid Asn Asp hid130 131 132 133 134 1353 区-HPT 区His309其中'hid'是指选自Met，lie, Leu, Val, Ala, Gly, Cys, His, Lys, Trp,Tyr或Phe的一个疏水残基。优选地，应用于本发明的组合物/方法中的脂质酰基转移酶可用Pfam00657共有 序列进行比对。优选地，与pfam00657结构域家族的隐藏markov模型图谱(HMM图谱)的阳性
匹配表明本发明中的GDSL或GDSX结构域的存在。优选地，当与Pfam00657共有序列比对时，应用于本发明的组合物/方法中 的脂质酰基转移酶含有至少一个，优选一个以上，优选两个以上下列区域，GDSx区、 GANDY区、HPT区。适宜地，脂质酰基转移酶含有GDSx区和GANDY区。可选择 地，所述酶含有GDSx区和HPT区。优选地，所述酶含有至少一个GDSx区。优选地，当与Pfam00657共有序列比对时，应用于本发明的组合物/方法中的 酶与参比嗜水气单胞菌多肽序列即SEQ ID No.32比较时含有至少一个，优选一个以上， 优选两个以上，优选三个以上，优选四个以上，优选五个以上，优选六个以上，优选七 个以上，优选八个以上，优选九个以上，优选十个以上，优选十一个以上，优选十二以 上，优选十三以上，优选十四个以上下列氨基酸残基28hid，29hid，30hid, 31hid， 32gly, 33Asp, 34Ser, 35hid, 130hid, 131Gly, 132hid, 133Asn, 134Asp, 135hid, 309Hisopfam00657GDSX结构域是将具有该区域蛋白与其它酶区分的独特标识。Pfam00657共有序列，表示为

图1的SEQIDNo.l。 这是从第6版数据库 Pfam00657家族的鉴定衍生出来的，本文也称其为pfam00657.6。保守序列可通过新版Pfam数据库来更新。例如，图33和34显示第11版数据库中00657家族的pfam比对，本文也称其为 pfam00657.ll。发现两个版本的数据库中Pfam00657家族中都存在GDSx区、GANDY区和HPT 区。其它版本的(release)pfam数据库可用来鉴定pfam00657家族。优选地，本发明所述的脂质酰基转移酶可以用下列标准来表征⑴该酶具有转移酰基的活性(可定义为酯基转移活性)，由此将脂质酰基供体 的原始酯键上的酰基部分转移到酰基受体上形成新酯；(ii)该酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是一种或多种下列氨基酸残基 L，A，V，I，F，Y，H, Q，T，N，M 或 S;(iii)该酶包含His-309或包含对应于嗜水气单胞菌脂解酶的His-309位的组氨酸 残基，所述嗜水气单胞菌脂解酶如图2所示(SEQ ID No.2或SEQID No.32)。优选地，
GDSX基序的氨基酸残基是L。在SEQIDNo.2或SEQIDNo.32中，前18个氨基酸残基形成信号序列。全长 序列(包含信号序列的蛋白质)的His-309，等同于该蛋白质成熟部分(即不含有信号序 列的序列)中的His-291。优选地，本发明所述的脂质酰基转移酶包括下列催化三联体Ser-34，Asp-134 和His-309或者包含位置分别对应于图2 (SEQ ID No.2)或图28 (SEQ ID No.32)所示的嗜 水气单胞菌脂解酶中Ser-34，Asp-134和His-309的丝氨酸残基、天冬氨酸残基和组氨酸 残基。如上所述，在SEQ ID No.2或SEQIDNo.32所示序列中，前18个氨基酸残基形成信号序列。全长序列(包含信号序列的蛋白质)的Ser-34，Asp-134和His_309，等同 于蛋白质成熟部分(即不含有信号序列的序列)的Ser-16，Asp-116和His_291。在图 1(SEQ IDNo.l)所示的Pfam00657共有序列中，活性位点残基对应于Ser_7，Asp_157和 His-348。优选地，本发明所述的脂质酰基转移酶可以用下列标准来表征⑴该酶具有酰基转移活性(可定义为酯转移活性)，由此将脂质酰基供体的原 始酯键上的酰基部分转移到一或多种碳水化合物，蛋白质，蛋白质亚基或羟基酸酰基受 体形成新酯，即碳水化合物酯，蛋白质酯，蛋白质亚基酯或羟基酸酯；并且(ii)该酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是一种或多种下列氨基酸残基 L，A，V，I，F，Y，H, Q，T，N，M 或 S;(iii)该酶包含His-309或包含对应于嗜水气单胞菌脂解酶的His-309位的组氨酸 残基，所述嗜水气单胞菌脂解酶如图2所示(SEQ ID No.2或SEQID No.32)。优选地，GDSX基序的氨基酸残基是L。在SEQIDNo.2或SEQIDNo.32中，前18个氨基酸残基形成信号序列。全长 序列(包含信号序列的蛋白质)的His-309，等同于该蛋白质成熟部分(即不含有信号序 列的序列)中的His-291。优选地，本发明所述的脂质酰基转移酶包括下列催化三联体Ser-34，Asp-134 和His-309或者包含位置分别对应于图2 (SEQ ID No.2)或图28 (SEQ ID No.32)所示的嗜 水气单胞菌脂解酶中Ser-34，Asp-134和His-309的丝氨酸残基、天冬氨酸残基和组氨酸 残基。如上所述，在SEQ ID No.2或SEQ ID No.32所示序列中，前18个氨基酸残基形 成信号序列。全长序列(包含信号序列的蛋白质)的Ser-34，Asp-134和His_309，等同 于蛋白质成熟部分(即不含有信号序列的序列)的Ser-16，Asp-116和His_291。在图 1 (SEQ IDNo.l)所示的Pfam00657共有序列中，活性位点残基对应于Ser_7，Asp_157和 His-348。优选地，本发明所述的脂质酰基转移酶可以用下列标准来表征⑴该酶具有酰基转移活性(可定义为酯转移活性)，由此将脂质酰基供体的原 始酯键上的酰基部分转移到一或多种碳水化合物，蛋白质，蛋白质亚基或羟基酸酰基受 体形成新酯，即碳水化合物酯，蛋白质酯，蛋白质亚基酯或羟基酸酯；并且(ii)该酶包含至少 Gly_32，Asp-33, Ser-34, Asp-IM 和 His_309 或者包含位 置分别对应于图2 (SEQ ID No.2)或图28 (SEQ ID No.32)所示的嗜水气单胞菌脂解酶中 Gly-32, Asp-33, Ser-34, Asp-IM和His_309的甘氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、天冬氨酸 和组氨酸。适宜地，本发明所述的脂质酰基转移酶可以并优选从下列来自一个或多个 属的生物体中获得气单胞菌属(Aeromonas)、链霉菌属(Streptomyces)、酵母菌属 (Saccharomyces)、乳球菌属(Lactococcus)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、链球菌属 属(Streptococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、脱亚硫酸菌属(Desulfitobacterium)、 芽胞杆菌属(Bacillus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、弧菌属(Vibrionaceae)、 木杆菌属(Xylella)、硫叶菌属(Sulfolobus)、曲霉属(Aspergillus)、裂殖酵母 属(Schizosaccharomyces)、李司戎氏菌属(Listeria)、奈瑟氏球菌(Neisseria)、
14Mesorhizobium、雷尔氏菌属(Ralstonia)、黄杆菌属(Xanthomonas)和假丝酵母属 (Candida)。适宜地，本发明所述的脂质酰基转移酶可以并优选从下列一种或多种生物体 中获得嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、杀鲑气单胞菌(杀鲑气单胞菌)、天 蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、龟裂链霉菌(Streptomycesrimosus)、分枝杆菌 (Mycobacterium)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、 脱卤脱亚硫酸菌(Desulfitobacteriumdehalogenans)、芽孢杆菌(Bacillus sp)、空肠弯曲 杆菌(Campylobacter jejuni)、弧菌(Vibrionaceae)、昔养木杆菌(Xylella fastidiosa)、 硫磺矿硫叶菌(Sulfolobussolfataricus)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、土 曲 霉(Aspergillusterreus)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、无害李司戎氏 菌(Listeria innocua)、单核细胞增多性李司忒氏菌(Listeria monocytogenes)、脑膜炎 奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、 Mesorhizobium loti、青才古雷尔氏菌(Ralstonia solanacearam)、里予油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、地毪草黄单胞菌 (Xanthomonas axonopodis)、近平滑假丝酵母(近平滑念珠菌)。在一方面，优选地，本发明中的脂质酰基转移酶可以并优选从一种或多种嗜水 气单胞菌或杀鲑气单胞菌中获得。适宜地，本发明所述的脂质酰基转移酶包含一种或多种下列氨基酸序列。(i) SEQ ID No.2所示的的氨基酸序列(见图2)(ii) SEQ ID No.3所示的氨基酸序列(见图3)(iii) SEQ ID No.4所示的氨基酸序列(见图4)(iv) SEQ ID No.5所示的氨基酸序列(见图5)(v) SEQ ID No.6所示的氨基酸序列(见图6)(vi) SEQ ID No. 12所示的氨基酸序列(见图14)(vii) SEQ ID No.20所示的氨基酸序列(见图16)(viii) SEQ ID No.22所示的氨基酸序列(见图18)(ix) SEQ ID No.24所示的氨基酸序列(见图20)(xi) SEQ ID No.26所示的氨基酸序列(见图22)(xii) SEQ ID No.28所示的氨基酸序列(见图24)(xiii) SEQ ID No.30所示的氨基酸序列(见图26)(ixi) SEQ ID No.32所示的氨基酸序列(见图28)(xiv) SEQ ID No.34所示的氨基酸序列(见图30)或者与SEQIDNo.2，SEQ ID No.3, SEQ ID No.4, SEQ ID No.5, SEQID No.6, SEQ ID No. 12, SEQ ID No.20, SEQ ID No.22, SEQ ID No.24, SEQID No.26, SEQ ID No.28, SEQ ID No.30, SEQ ID No.32,或 SEQ ID No.34 所示的任意一种序列有 75%或者
更高同一性的氨基酸序列。适宜地，本发明所述的脂质酰基转移酶或者包含SEQID No.2或SEQID No.3或 SEQ ID No.32或SEQ ID No.34所示的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID No.2或SEQ ID No.3或SEQ ID No.32或SEQ ID No.34所示的氨基酸序列有75%或75%以上，优选80%
15或80%以上，优选85%或85%以上，优选90%或90%以上，优选95%或95%以上同一
性的氨基酸序列。为了达到本发明的目的，同一性的程度取决于相同序列元素的数目。依照本发 明，同一性程度可通过本领域已知电脑程序适宜地测定，所述程序诸如GCG程序包提供 的 GAP (Program Manual for the Wiscons 中 Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, US53711) (Needleman & Wunsch(1970), J.of Molecular Biology48, 443-45)，利用下列设置进行多肽序列比较 GAP生成罚分3.0和GAP延伸罚分0.1。适宜地，本发明所述的脂质酰基转移酶包含一段氨基酸序列，该序列与SEQID No.2，SEQ ID No.3, SEQ ID No.4, SEQ ID No.5, SEQ ID No.6, SEQ ID No. 12, SEQ ID No.20, SEQ ID No.22, SEQ ID No.24, SEQ IDNo.26, SEQ ID No.28, SEQ ID No.30, SEQ ID No.32或SEQ ID No.34所示的任何一段序列具有80%或80%以上，优选85%或 85%以上，更优选90%或90%以上，还更优选95%或95%以上的同一性。适宜地，本发明所述的脂质酰基转移酶包含下列氨基酸序列中的一或多种(a)如SEQ ID No.2或SEQ ID No.32的1-100氨基酸残基所示的氨基酸序列；(b)如SEQ ID No.2或SEQ ID No.32的101-200氨基酸残基所示的氨基酸序列；(c)如SEQ ID No.2或SEQ ID No.32的201-300氨基酸残基所示的氨基酸序列； 或(d)与上述(a)-(c)定义的任意氨基酸序列有75%或75%以上，优选85%或 85%以上，更优选90%或90%以上，还更优选95%或95%以上同一性的氨基酸序列。适宜地，本发明所述的脂质酰基转移酶包含下列氨基酸序列中的一或多种(a)如SEQ ID No.2或SEQ ID No.32的氨基酸残基28-39所示的氨基酸序列；(b)如SEQ ID No.2或SEQ ID No.32的氨基酸残基77-88所示的氨基酸序列；(c)如SEQ ID No.2或SEQ ID No.32的氨基酸残基126-136所示的氨基酸序列；(d)如SEQ ID No.2或SEQ ID No.32的氨基酸残基163-175所示的氨基酸序列；(e)如SEQ ID No.2或SEQ ID No.32的氨基酸残基304-311所示的氨基酸序列； 或(f)与上述(a)-(e)定义的任意氨基酸序列有75%或75%以上，优选85%或85% 以上，更优选90%或90%以上，还更优选95%或95%以上同一性的氨基酸序列。适宜地，本发明所述的脂质酰基转移酶可以包含下列核苷酸序列中的一个或多 个序列表达而产生的氨基酸序列。(a)如SEQ ID No.7所示的核苷酸序列(见图9)；(b)如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列(见图10)；(c)如SEQ IDNo.9所示的核苷酸序列(见图11)；(d)如SEQ ID No. 10所示的核苷酸序列(见图12)；(e)如SEQ ID No. 11所示的核苷酸序列(见图13)；(f)如SEQ ID No. 13所示的核苷酸序列(见图15)；(g)如SEQ ID No.21所示的核苷酸序列(见图17)；(h)如SEQ ID No.23所示的核苷酸序列(见图19)；
(i)如SEQ ID No.25所示的核苷酸序列(见图21)；(j)如SEQ ID No.27所示的核苷酸序列(见图23)；(k)如SEQ ID No.29所示的核苷酸序列(见图25)；(1)如SEQ ID No.31所示的核苷酸序列(见图27)；(m)如SEQ ID No.33所示的核苷酸序列(见图29)；(n)如SEQ ID No.35所示的核苷酸序列(见图31)；(o)或与SEQIDNo.7，SEQ ID No.8, SEQ ID No.9, SEQ ID No. 10, SEQIDNo.ll， SEQ ID No. 13, SEQ ID No.21, SEQ ID No.23, SEQ ID No.25, SEQ ID No.27, SEQ ID No.29, SEQ ID No.31, SEQ ID No.33 或 SEQ IDNo.35 所示的任意一序列具有 75%或 75%
以上同一性的核苷酸序列。适宜地，核苷酸序列可以与SEQIDNo.7，SEQ ID No.8, SEQ ID No.9, SEQ ID No.10，SEQIDNo.ll，SEQ ID No. 13, SEQ ID No.21, SEQID No.23, SEQ ID No.25, SEQ ID No.27, SEQ ID No.29, SEQ ID No.31, SEQ ID No.33 或 SEQ ID No.35 所示的任
意一序列具有80%或80%以上，优选85%或85%以上，更优选90%或90%以上，还更 优选95%或95%以上的同一性。一方面，本发明所述的脂质酰基转移酶可以为卵磷脂胆固醇酰基转移酶 (LCAT)或其变体(例如分子进化产生的变体)。本领域所知的适宜的LCAT可从下列一种或多种生物体中得到，例如哺乳 动物、大鼠、小鼠、小鸡、黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)、植物，包括拟南芥 (Arabidopsis)和稻(Oryza sativa)、线虫(nematodes)、真菌和酵母。在一个具体实施方案中，本发明所述的脂质酰基转移酶可以是可以并优选从含 有 pPetl2aAhydro 和 pPetl2aASalmo 的大肠杆菌菌株 E.TOP 10 (E.coli strains TOP 10)中获 得的脂质酰基转移酶，该菌株由丹麦哥本哈根K，DK-1001，Langebrogade 1的丹尼斯科 公司(Danisco A/S of Langebrogade 1, DK-1001 Copenhagen K, Denmark),根据布达佩 斯条约关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏(the Budapest Treaty on the International Recognitionof the Deposit of Microorganisms for the purpose of Patent 方法)在 2003 年 12 月22日保藏于英国苏格兰阿伯丁圣马恰尔街23号国立工业和海洋微生物保藏有限公 司(NCIMB) (the National Collection of Industrial, Marine and FoodBacteria (NCIMB) 23 St.Machar Street, Aberdeen Scotland, GB)，保藏号分别为 NCIMB 41204 和 NCIMB 41205。这里使用的术语“转移酶”与术语“脂质酰基转移酶”可以互换。适宜地，本发明定义的脂质酰基转移酶催化下列一种或两种反应酯基转移作 用(transesterification)，酉享角军作用。根据本发明，可获得一或多种以下的优越性质从脂质到形成一或多种碳水化 合物酯，蛋白质酯，蛋白质亚基酯或羟基酸酯的生物转化可在高水分环境中发生，所述 环境不包含有机溶剂或包含于常规生物转化法相比而言较少量的有机溶剂。术语“生物转化”指修饰一种有机化合物以产生另一种有机化合物和/或通过 酶催化从其它有机化合物合成有机化合物。
本文术语“酯基转移作用”指的是酰基从脂质供体(除外游离脂肪酸)上经酶 催化转移到酰基受体(除外水)。为避免怀疑，本文所用术语“酯基转移作用”指的是 酰基在脂质供体与酰基受体(不是水)之间的酶催化转移，其中所述酰基受体包含适宜地 化学基团，其可以为例如-OH或-SH基团。本发明使用的术语“醇解作用”指的是通过与醇基团ROH的反应对酸衍生物的 共价键的酶裂解，使得一产物与醇基团的H结合而另一产物与醇基团的OR基团结合。本发明使用的术语“水解作用”指的是酰基从脂质到水分子OH基团的酶催化 转移作用。由水解作用引起的酰基转移作用需要水分子的分离。术语“酯交换作用”指的是酰基在脂质供体与酰基受体之间的酶催化转移，其 中的脂质供体不是游离的酰基。换言之“酯交换作用”指两个脂质分子之间的脂肪酸互 换。—方面，本发明定义的脂质酰基转移酶催化酯交换作用。适宜地，本发明的方法或用途可进一步包含一或多种以下步骤将酰基受体溶 于水；将脂质酰基供体加入溶解的酰基受体，形成双相系统或乳液；对反应混合物进行 搅拌或超声处理；加热反应混合物，例如，使得酶变性；通过标准分离技术将水相从脂 肪/乳液相分离，所述标准分离技术诸如溶剂提取或水蒸发；通过疏水反应层析使得脂 肪相分级，结晶或高真空蒸馏(high vacuum distillation)。适宜地，一或多种加热，分离 或分级步骤可在所述反应达到平衡以后实施。一个实施方案中，本发明方法所用的酯酶酰基转移酶是固定化的。当所述酶被 固定的情况下，所述混合物包含酰基供体，酰基受体和流经柱子的水，所述水例如包含 固定化的酶。通过将所述酶固定化，可能容易地再利用它。适宜地，所述固定的酶可用于流动反应器(flow reactor)中或批量反应器(batch
reactor)中，所述反应器含有反应混合物，该混合物包含溶于水的酰基受体以及脂质酰基 供体作为双相系统或乳液。反应混合物可选被搅拌或经超声处理。一旦反应到达例如平 衡，所述反应混合物和固定化的酶可被分离。适宜地，所述反应产物可以例如通过疏水 反应层析，结晶或高真空蒸馏来分级。固定化的脂质酰基转移酶可以使用本领域熟知的固定化技术制备。本领 域有大量的对本领域技术人员而言清楚明白的制备固定化的酶的方法(例如以下文 献中所述的技术EP O 746 608 ；或 Balcao VM, Paiva AL, Malcata FX., Enzyme MicrobTechnol. 1996 May 1 ； 18(6) 392-416 ； 或 ReetzMT，Jaeger KE.Chem Phys Lipids.1998 Jun ； 93(1-2) 3-14 ； 或 BornscheuerUT，Bessler C, Srinivas R, Krishna SH.TrendsBiotechnol.2002 Oct ； 20(10) 433-7 ； Plou et al, J.Biotechnology 92 (2002)55-66 ； Warmuth et al.，1992.BioForum 9，282-283; Ferrer et al., 2000. J.Chem.Technol.Biotechnol.75, 1-8 ； 或 Christensen et al.，1998.Nachwachsende Rohstoff 10, 98-105 ； Petersen andChristenen, 2000, Applied Biocatalysis.Harwood Academic Publishers, Amsterdam。(将每篇都包含在本文中作为参照)。本文所用技术包括例如 与Eupergit C的共价偶联，吸附于聚丙烯和硅颗粒。本文术语“高水分环境(high water environment)”优选指低或缺乏有机溶剂的
环境，优选低或缺乏极性有机溶剂。本文术语有机溶剂作为脂质底物时优选不包括食品油，并有选不包括例如含高非极性脂质的食品油。适宜地，本发明高水分环境包含不超 过50%体积的有机溶剂，不超过30%体积的有机溶剂，更优选不超过15%体积的有机溶 剂，更优选不超5%，更优选不超过1%，更优选不超过0.5%体积的有机溶剂，更优选 0%体积的有机溶剂。当根据本发明产生碳水化合物酯时，优选所述碳水化合物酯是寡糖酯、单糖酯
或二糖酯。适宜地，当根据本发明产生碳水化合物酯时，碳水化合物酯可以是以下的 一种或多种葡萄糖酯、果糖酯、脱水果糖酯、麦芽糖酯、乳糖酯、半乳糖酯、木 糖酯、木寡糖酯(xylooligosaccharide ester)、阿拉伯糖酯(arabinose ester)、麦寡糖 酉旨(maltooligosaccharide ester)、塔格糖酉旨(tagatoseester)、蔴糖酉旨、microthecin 酯、 ascopyrone P 酉旨、ascopyrone T 酉旨、或 cortalcerone 酉旨。根据本发明优选产生的碳水化合物酯是以下一种或者多种碳水化合物单酯 (碳水化合物mono-ester)、糖单酯(sugar mono-ester)、寡糖单酯、三糖单酯、二糖单 酯、单糖单酯、葡萄糖单酯、果糖单酯、脱水果糖单酯、麦芽糖单酯、乳糖单酯、半乳 糖单酯、木糖单酯、木寡糖单酯、阿拉伯糖单酯、麦寡糖单酯、塔格糖单酯、蔗糖单 酉旨、microthecin 酉旨、ascopyrone P 酉旨、ascopyrone T 酉旨、或 cortalcerone 酉旨。在一个具体实施方案中，microthecin酉旨、ascopyrone P酉旨、ascopyrone T酉旨、和 /或cortalcerone酯可以作为抗微生物剂起作用。可选地或者进一步地，microthecin酯、 ascopyrone P酯、ascopyrone T酯、和/或cortalcerone酯可以作为抗氧化剂和/或乳化剂 的一个或两个来起作用。优选地，本发明碳水化合物酯的的形成(如果有的话)不依赖于UDP-葡萄糖。优选地，本发明的食品不包含UDP-葡萄糖或仅仅包含不显著量的UDP-葡萄糖。已发现本发明组合物和方法中应用的脂质酰基转移酶与脂解酶相比具有独特的 性质，它们明显优先地将酰基从脂质转移到水以外的受体上，即使在有大量水存在的条 件下也是如此。与现有技术中的酶相比发现，本发明中应用的脂质酰基转移酶在存在 6%, 54%, 73%, 89%和大约95%的水的条件下具有高的相对转移酶活性。被试脂解酶 在这些水浓度条件下事实上不具有明显的相对转移酶活性。%转移酶活性(即作为总酶活性百分比的转移酶活性)可通过以下方案测定酶促反应后，可用CHCl3 CH3OH 2 1提取已添加本发明的脂质酰基转移 酶的食品，分离包含脂质物质的有机相，并可根据在下文描述的详细步骤通过GLC和 HPLC分析。通过GLC和HPLC的分析，确定游离脂肪酸和一种或多种固醇/stand酯 类；碳水化合物酯；蛋白质酯；甘油二酯；或单甘油酯的量。不添加本发明的酶的对照 食品用同种方法分析。计算从GLC和HPLC分析的结果可以计算出游离脂肪酸和碳水化合物酯和/或蛋白
质酯和/或蛋白质亚基酯和/或羟基酸的增加量脂肪酸脂肪酸(酶脂肪酸(对照)；Mv脂肪酸=脂肪酸平均分子量A= Δ %蛋白质酯/Mv蛋白质酯(其中八％蛋白质酯=%蛋白质酯(酶
蛋白质酯(对照)，Mv蛋白质酯=蛋白质酯的平均分子量)，这适用于酰基受体是蛋白 质；B = Δ %碳水化合物酯/Mv碳水化合物酯(其中Δ %碳水化合物酯碳水化 合物酯(酶碳水化合物酯(对照)，Mv碳水化合物酯=碳水化合物酯平均分子量)， 这适用于酰基受体是碳水化合物。C= Δ %蛋白质亚基酯/Mv蛋白质亚基酯(其中Δ %蛋白质亚基酯蛋白质 亚基酯(酶)_ %蛋白质亚基酯(对照)，Mv蛋白质亚基酯=蛋白质亚基酯平均分子量)， 这适用于酰基受体是蛋白质亚基；和D =羟基酸酯/Mv羟基酸酯(其中Δ %羟基酸酯=%羟基酸酯(酶)-%羟基酸 酯(对照)，Mv羟基酸酯=羟基酸酯的平均分子量)，这适用于酰基受体是羟基酸。转移酶活性以占总酶活性的百分率计算
%转移酶活性=A*+B*+ C*+P* χ 100__
A*+B*+ C*+ *+Α % 脂肪酸/(Mv 脂肪酸)*指适当时删除。酶的酯酶和酰基转移酶活性可利用以下实验评估。由此，具有本发明所述酶特 征的脂质酰基转移酶可被获得/鉴定。经缓冲的底物中的转移酶测定法(参见实施例6)起脂质酰基转移酶作用以用于本发明组合物和方法中的酶可以用实施例12中教 导的测定法常规鉴定出来。此测定方法将在下文称为“经缓冲的底物中的转移酶测定 法”。在实施例6中对本发明源于杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶进行分析并与本发明未 涉及的一定范围的脂解酶进行比较。可以看出脂解酶中只有LIPOPAN F(N0V0ZymeS， 丹麦)具有转移酶活性，且仅具有较低的水平(1.3% )。适于本发明的组合物和方法中应用的酶可以利用在经缓冲的底物中的转移酶测 定法来常规确定。应用这种测定方法(其中含水量非常高-大约95%)，本发明应用的 脂质酰基转移酶是至少有2%酰基转移酶活性(相对转移酶活性)，优选至少5%相对转 移酶活性，优选至少10%相对转移酶活性，优选至少15%、20%, 25%, 26%, 28%, 30%, 40%, 50%, 60%或75%相对转移酶活性的酶。本发明适宜的脂质酰基转移酶可 以具有小于28%、小于30%、优选小于40%、50%, 60%, 70%, 80%, 90%或100% 的酰基转移酶活性。低水分蛋黄中的转移酶测定法(参见实施例11)作为“经缓冲底物中的转移酶测定法”的替换(或附加)，本发明所用脂质酰基 转移酶可以用“低水分蛋黄中的转移酶测定法”来鉴定。为了判定一种酶是否是属于根据本发明的脂质酰基转移酶，可进行“低水分环 境中的转移酶测定法”，即如实施例9教导在含水6%的油性环境中。这个例子说明在水 含量6%的油性环境中本发明的脂质酰基转移酶具有高的相对转移酶活性，而现有技术的脂解酶具有水解活性。在一具体实施方案中，本发明组合物和/或方法中应用的适宜脂质酰基转移酶 是用“低水分环境中的转移酶测定法”检测的酶，在30、20或120分钟后进行测定时， 其相对转移酶活性至少1%，优选至少2%，优选至少5%，优选至少10%，优选至少 20%,优选至少30%，优选至少40%，优选至少50%，优选至少60%，优选至少70%， 优选至少75%。适宜地，用“低水分环境中的转移酶测定法”在10、20、30或120分 钟后进行测定时，本发明脂质酰基转移酶，可有少于30%、40%, 50%, 60%, 70%或 80%的活性。如上所述，本发明中的脂酶酰基转移酶可以用“经缓冲的底物中的转移酶测定 法”或“低水分环境中的转移酶测定法”以胆固醇为酰基受体进行鉴定。当然，本领域 技术人员会容易意识到，通过对分析方法进行明显的修改，“经缓冲的底物中的转移酶 测定法”或“低水分环境中的转移酶测定法”可用于确定脂质酰基转移酶对任何脂质酰 基供体或任何酰基受体组合的活性。如有必要，技术人员可简单地用可选酰基供体底物 (如糖脂，甘油三酯)替换酰基供体底物(如磷脂)和/或用可选酰基受体底物(如碳水 化合物，蛋白质，蛋白质亚基或羟基酸)替换酰基受体底物(如胆固醇)。(例如见实施 例 10-13)。本发明术语“高水分环境”指任何包含5-98%水的环境。优选所述环境包含不 超过 6%水含量，优选不超过 7%，8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%或90%水含量。适宜地，所述高水分环境包含20-98%，适宜地包含50-98% 水，适宜地包含70-98%水，适宜地包含75-98%水。一个实施方案中，所述混合物中加入的脂质酰基转移酶的量与水的重量比至少 1 700，优选 1 10,000。本文使用的术语“低水分”意味着任何底物或食品，其水含量小于6%，优选小 于 5%、4%, 3%, 2%, 或 0.5%。优选本发明的方法和/或用途可在15_60°C实施，优选在20-60°C，优选 20-50°C,优选 20-45°C，优选 20_40°C。适宜地，本发明的方法或用途包含另一步骤或纯化和/或分离所述反应产物， 即一或多种碳水化合物酯，蛋白质酯，蛋白质亚基酯，或羟基酸酯。因此，优选所述反 应产物是纯化的和/或分离的形式。纯化酯的多种方法是本领域技术人员已知的。例如，只有通过本发明教导的方 法/用途产生的酯可利用层析诸如疏水反应，过滤，离心，溶剂提取/蒸馏或结晶。适宜 的方法见 Ulmann，s Encyclopedia of Industrial Chemistry (2002)，Wiley-VCH Verlag GmbH & Co.KgaA。本发明所述脂质酰基转移酶可在任何适宜的表达宿主表达。例如本发明所述脂 质酰基转移酶可在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中表达，并且可以通过超滤法和/或乙 醇沉淀法和/或离心法纯化，接着可以使用淀粉(麦芽糊精)作为酶的载体进行喷雾干 燥。经喷雾干燥后的酶通过添加另外的粉末形式载体而标准化为规定的PLU活性。有 关技术在本领域中是很明确且常规的。一个实施方案中，本发明的方法是体外方法。所述方法适宜地是连续或批量方法。本发明的酶可以和一或多种其它酶联用。因此，除了本发明的酶以外，将所述 混合物与至少一种其它的酶接触也包含在本发明的范围内。所述另外的酶包括淀粉降解 酶，诸如内(endo)或外(exo)淀粉酶，支链淀粉酶(pullulanases)，去支化(debranching) 酶，半纤维素酶(hemicellulases)包括木聚糖酶(xylanases)，纤维素酶(cellulase)，氧化 还原酶(oxidoreductases)，例如葡萄糖氧化酶或碳水化合物氧化酶诸如麦芽糖的氧化酶， 例如己糖氧化酶(HOX)，酯酶，磷脂酶和己糖氧化酶，以及蛋白酶。所述混合物可以和 本发明的酶以及至少一种其它的酶同时或依次接触。一个实施方案中例如所述脂质酰基转移酶可以和具有一或多种以下脂酶活性的 脂酶联用糖脂酶活性(E.C.3丄1.26，三酰甘油脂酶活性(E.C.3丄1.3)，磷酯酶A2活性 (E.C.3.1.1.4)或磷酯酶Al活性(E.C.3.1丄32).适宜的酯酶是本领域已知的，并作为实例包 括以下酯酶LIPOPAN F 和 / 或LECITASE ULTRA (Novozymes A/S，Denmark)， 磷酯酶A2 (例如磷酯酶A2来自LIPOMOD 22L来自Biocatalysts，LIPOMAX 来自 Genecor)，LIPOLASE (Novozymes A/S, Denmark),酯酶的教导见 WOO3/97835，EP 0977 869 或 EP 1 193 314。用途因此，本发明的方法产生一或多种碳水化合物酯，蛋白质酯，蛋白质亚基酯， 羟基酸酯。这些酯中的许多是有用的乳化剂。作为实例只有例如氨基酸酯，肽酯，蛋白 质酯，碳水化合物酯和羟基酸酯(诸如酒石酸酯)是功能重要的乳化剂。乳化剂可用于 多种工业中，诸如食品工业，饲料工业，化妆品工业(例如在化妆品基础中)，制药工业 (例如在药物合成和配制中)以及例如颜料工业中。乳化剂可作为湿润剂，食品成分和活 性成分起作用。此外，蛋白质脂肪酸缩合物由于它们优越的生理性质适于作在例如化妆品和个 人卫生产品中。例如，蛋白质酯可用于沐浴制品以及香波和身体清洁剂中。蛋白质脂肪 酸缩合物也可用于药物组合物，例如作为基质。已知蛋白质脂肪酸缩合物可用于化妆品工业中。通常，这些产品通过利用水作 为溶剂，使蛋白质水解产物与脂肪酸氯化物在Schotten-Baumarai条件下反应来制备。(http://www.scf-online.com/english/26 e/rawmateria!26 e.htm#5).在开发蛋白质-脂肪酸缩合物的过程中，可能将可再生来源脂肪酸(来自植物 油)与蛋白质结合，其可获自动物废弃物(皮)以及来自许多植物，来构建具有疏水(脂 肪酸)和亲水(蛋白质)部分的表面活性剂结构。在该过程中，脂肪酸氯化物(fatty acid chloride)与氨基酸的氨基反应，并形成蛋白质脂肪酸缩合物(见图49)。获得具有很好的 皮肤相容性以及另外具有好的清洁效果的产品。甚至加入较少的酰基化蛋白质水解产物对其它表面活性剂的皮肤相容性具有协 同作用这一事实从技术配制角度来看是非常重要的。该保护作用可由该产物的两性特性 来解释。蛋白质-脂肪酸缩合物与皮肤胶原之间存在相互作用。这导致保护性层的形 成，其减少了表面活性剂对上皮层的过度攻击，它们强的去油效应以及阴离子表面活性 剂与皮肤的直接相互作用。在化妆品工业中，基于蛋白质的表面活性剂主要用于温和的沐浴产品(shower
22and bath product),温和的香波，基于表面活性剂的洗面剂，冷-剃须制品和固定剂或婴 儿用表面活性剂制品。蛋白质水解产物脂肪酸缩合物也可用作药物制剂的基质，例如用作含有用于局 部给药皮肤的活性成分的乳膏或油膏。本发明提供无需利用脂肪酸氯化物制备蛋白质脂肪酸缩合物的新方法。本发明 的反应的描述见图50。所述反应可在水或缓冲体系中在低温进行而不形成废物。本文术语“蛋白质脂肪酸缩合物”包括所有以下物质蛋白质酯，多肽酯，二 肽酯，寡肽酯，肽酯，以及氨基酸酯。本领域技术人员已知，碳水化合物酯(具体是糖酯)在食品工业中具有广泛的应 用。其它应用领域包括化妆品，口腔护理产品，和医学用品。此外这些化合物可用作抗 生素，抗肿瘤剂，杀真菌剂和杀虫剂。本发明的脂质酰基转移酶能催化在高水分环境中 形成葡萄糖糖酯(图51)。本发明制备的酯可用于以下领域化妆品包括精华油乳液(essentialoil emulsion) (o/w, HLB 16-18)石蜡油乳 液，o/w, HLB 10-14 ；硬脂酸乳液；蜡乳液(wax emulsion)，o/w, HLB14-16 ；羊毛脂 乳液，o/w，HLB 12-14 ；硅酮乳液；牙膏，o/w;泡沫沐浴品(foam bath)，o/w, HLB 14-18 ；洗发液。药物制剂包括药物乳剂；油膏基质；栓剂化合物，w/o;包囊化 (encapsulation)；注射制齐[J。农业包括土壤改良；作为增肥添加剂(feritliser additive)；作为全能洗涤剂 (all-purpose cleaner)；水果和蔬菜的洗涤物；搅乳器用清洁物。农作物保护包括天然存在的杀虫剂；氯化烃(chlorinated hydrocarbon)，和 140 ；磷酸酯o/w, HLB 10-14 ；杀真菌剂，o/w ；除莠剂，o/w。食品工业包括面包和蛋糕；人造黄油；巧克力；脂肪粉霜预防(fatbloom prevention)，w/o, HLB 5-10 ；糖霜化(sugar frosting)，o/w, HLB 14-16 ；焦糖 (caramel)和口香糖的软化剂，w/o，HLB.2-4 ；粘连预防，w/o，HLB2-4 ；冰淇淋添加 剂 w/o，HLB 4-6 ；奶和烘焙粉的湿化，w/o，HLB 9-11 ；蛋奶(custard)粉，w/o，HLB 2-4 ；在饮料工业中；在水果和蔬菜中；在调味剂中，w/o和o/w，HLB 10-12;在肉， 沙拉或其它调味酱中，o/w;在食品色素中，w/o，HLB 2-4 ； o/w, HLB 8-18 ；在泡沫 抑制剂中。利用本发明制备的蛋白质脂肪酸酯，羟基酸酯和碳水化合物酯作为食品应用中 的乳化剂的益处是这些是无害的食品相容性成分，它们与其它常规使用的乳化剂例如乙 氧基化的脂肪酸酯相比更容易发生生物降解。因此，这些乳化剂在食品工业和非食品工 业应用中更为环保。在一个具体实施方案中，microthecin酉旨、ascopyrone P酉旨、ascopyrone T酉旨、和 /或cortalcerone酯可以作为抗微生物剂起作用。可选地或者进一步地，microthecin酯、 ascopyrone P酯、ascopyrone T酯、和/或cortalcerone酯可以作为抗氧化剂和/或乳化剂
的来起作用。—个实施方案中，本发明的方法和用途可用于利用脂质酰基-转移酶制备用于药物配制剂中的乳化剂，具体是用于活性成分的控制释放的产生中，其中所述活性成分 是酰基化的。这种慢释放型制剂具体可用于口服给药的药物组合物，其中所述酯在消化 道中的逐渐水解可逐渐释放活性成分。所述酰基化的组合物可进一步用于皮下或静脉内 制剂。另一实施方案中，本发明的方法或用途可用于制备相转移催化剂用于例如在有 机反应中将盐转移到有机溶剂溶液中。例如，将酰基基团转移到适当的阳离子受体，诸 如羟基酸(柠檬酸)，或可选具有阴离子受体基团，诸如羟基-胺可产生用于将盐转移到 有机溶剂溶液中的相转移催化剂。另一实施方案中，本发明的方法可用于制备具有低生物利用度和/或低溶解度 的药物化合物的前药，例如抗病毒剂如阿昔洛韦(acyclovir)和更昔洛韦(gangaciclovir)。 所述方法可进一步用于其它具有游离羟基的药物化合物，例如伯，仲，叔羟基。优选，本发明制备的酯可用于药物配制。优选，本发明制备的酯可用于化妆品和/或个人卫生用品中。优选，本发明制备的酯可用于食品和/或饲料中。本发明的方法可以是在生产一或多种药物，化妆品，个人卫生用品，食品或饲 料的方法中的一个步骤。优点本发明方法的一个优点是其导致一或多种碳水化合物酯，蛋白质酯，蛋白质亚 基酯或羟基酸酯的生产而无需利用有机溶剂。因此，本发明允许利用较少的有机溶剂或 不利用有机溶剂。这具有许多优点，例如降低生产成本，降低人和/或环境的有机溶剂 暴露，简化生产过程。在用于食品应用的酯的生产中，具体优选利用脂质而不是脂肪酸，因为不必要 去除过多的脂质，这是由于它们可来自利用反应产物的食品的一部分。另一方面，多余 的游离脂肪酸必须被去除，这是由于它们对于大多数食品是有害的。分离在一方面，优选地，本发明应用的多肽或蛋白质是分离形式的。术语“分离 的”意思是序列至少基本上不含有至少一种其它成分，该成分于此序列天然相结合，并 在自然界发现。一方面，优选本发明的生物转化产品例如碳水化合物酯和/或蛋白质酯和/或蛋 白质亚基酯和/或羟基酸酯分离自反应混合物。术语“分离的”指所述生物转化产物至 少基本不含至少一种其它组分，所述生物转化产物在生物转化反应过程中与该其它组分
？口口。纯化在一方面，优选地，本发明应用的多肽或蛋白质是纯化的。术语“纯化的”意 思是序列处于相对纯化的状态_如至少大约51 %纯度、或至少大约75%纯度、至少大约 80%纯度、至少大约90%纯度、至少大约95%纯度、至少大约98%纯度。一方面，优选本发明制备的生物转化产物，例如碳水化合物酯和/或蛋白质酯 和/或蛋白质亚基酯和/或羟基酸酯自反应混合物纯化，并因此为纯化的形式。术语“纯 化的”指所述生物转化产物是相对纯的状态-例如至少约51%纯，或至少约75%，或至少约80%，或至少约90%纯，或至少约95%纯或至少约98%纯。药物组合物本发明还提供了药物组合物，其包含本发明的产物和可药用的载体，稀释剂或 赋形剂(包括其组合)。所述药物组合物可在人或兽医医学中用于人或动物并通常包含任何一或多种可 药用稀释剂，载体或赋形剂。治疗用可接受的载体或稀释剂是制药领域已知的，并在例 如 Remington' s Pharmaceutical Sciences, MackPublishing Co. (A.R.Gennaro edit. 1985)中 描述。药物载体，赋形剂或稀释剂可根据目的给药途径和标准药物操作来选择。所述药 物组合物可包含或另外包含，载体，赋形剂或稀释剂，任何适宜的粘合剂，润滑剂，助 悬剂，包被剂，助溶剂。防腐剂，稳定剂，染料甚至调味剂可在药物组合物中提供。防腐剂的实例包括 苯甲酸钠，山梨酸，以及对羟基苯甲酸的酯。抗氧化剂和助悬剂也可使用。根据不同的递送系统，有不同的组合物/配制要求。例如，本发明的药物组 合物可配制成利用微型泵或通过粘膜突途径给药的形式，例如作为喷鼻剂或吸入气溶胶 或可摄入溶液，或经胃肠外给药，其中所述组合物可配制成可注射形式用于例如经静脉 内，肌内或皮下途径来递送。可选，所述配制剂可设计为通过多种途径给药。当所述药剂经胃肠道粘膜给药时，其应当能够在通过胃肠道的过程中保持稳 定；例如其应抵抗蛋白水解降解，在酸性pH稳定并抵抗胆汁的清洁作用。适当的情况下，所述药物组合物可通过吸入给药，以栓剂或阴道栓的形式，以 洗液，溶液，乳膏，油膏或粉尘的形式，通过利用皮肤贴片(patch)，以含有赋形剂诸如 淀粉或乳糖的口服片剂，或以单独或与赋形剂混合的胶囊或卵形胶囊(ovule)的形式，或 以含有调味或着色剂的酏剂，溶液或悬液的形式，或它们可经胃肠外例如经静脉内，肌 内或皮下注射。对于经胃肠外给药，所述组合物最好以含有其它物质的无菌含水溶液形 式使用，所述其它物质例如足够的盐或单糖使得所述溶液与血液等张。对于经颊或经舌 下给药，所述组合物可以以可通过传统方式配制的片剂或锭剂形式给药。克隆编码本发明所述多肽的核苷酸序列编码具有本文定义的具体性质的多肽或适合被修饰的多肽的核苷酸序列，可以 从产生上述多肽的细胞或生物体中分离。本领域有多种不同的已知的方法分离核苷酸序 列。例如，基因组DNA和/或cDNA库可以应用由源自产生多肽的生物体的染色体 DNA或信使RNA构建。如果多肽氨基酸序列是已知的，可以合成标记的寡核苷酸探针， 并用于识别从生物体制备的基因组文库的多肽编码克隆。可替代的，包含与另一个已知 的多肽基因同源的氨基酸序列的标记的寡核苷酸探针可以用于识别多肽编码型克隆。在 后面的例子中，应用低严谨性的杂交和洗涤条件。可替代的，多肽编码克隆能够通过将基因组DNA片段插入表达载体如质粒中进 行鉴别，使用得到的基因组DNA文库转化不含酶的细菌，然后将转化后的细菌涂布于含 有一种被多肽抑制的酶琼脂平皿，从而使表达多肽的克隆被鉴定。作为另外的选择，编码多肽的核苷酸序列可以用确定的标准方法合成制备，该 标准方法例如 Beucage S.L.等(I98I) Tetrahedron Letters 22, pl859-1869 描述的亚膦酰胺
25(phosphoroamidite)方法，或 Matthes 等(1984) EMBO J.3，ρ 801-805 描述的方法。在亚
膦酰胺方法中，寡核苷酸被合成(例如在自动DNA合成器中)、纯化、退火、连接并克 隆到适宜的载体中。核苷酸序列可以是混合的基因组和合成来源，混合的合成与CDNA来源，或混 合的基因组与cDNA来源，其可通过使用标准技术连接合成DNA、基因组DNA(genomic DNA)或cDNA来源(适当的)的片段来制备。每一个连接片段对应于整个核苷酸序列 中不同的位置。DNA序列也可通过聚合酶链式反应(PCR)使用特异性的引物制备，例 如 US 4,683,202 中所描述的或在 Saiki R K 等(Science (1988) 239，pp 487-491)中所描述 的。核苷酸序列本发明也包括具有这里定义的特殊性质的核苷酸序列编码多肽。这里使用的术 语“核苷酸序列”指寡核苷酸序列或多核苷酸序列，它的变体、同族体、片段和它的衍 生物(例如它的部分)。该核苷酸序列可以属于基因组的、合成的、或重组的来源，不论 是代表同义链或反义链，它可以是双链的或是单链的。关于本发明使用的术语“核苷酸序列”包含基因组DNA、cDNA、合成DNA， 和RNA。优选的是DNA，更优选为编码序列的cDNA。一个优选的实施方案中，当结合到也存在它的自然环境中的、与其相结合的序 列时，编码具有本文定义具体特性的多肽的核苷酸序列本身不涵盖自然条件下存在的天 然核苷酸序列。为了便于参考，我们称这种优选的实施方案为“非天然核苷酸序列”。 在这种条件下，术语“天然核苷酸序列”是指在其自身天然环境中的完整核苷酸序列， 并且条件是与其天然所结合的完整启动子可操作地连接，所述启动子也存在于其自身天 然环境中。因此，本发明的多肽可以通过存在于自然生物体中的核苷酸序列表达，但是 其中的核苷酸序列不受该生物体中与其天然结合的启动子的控制。优选的多肽不是一种天然多肽。这种条件下，术语“天然多肽”是指一种处于 其自身的天然环境中的完整多肽，且条件是它被其天然核苷酸序列表达。一般地，编码具有本发明定义的具体性质的多肽的核苷酸序列可以通过重组 DNA技术(即重组DNA)制备。然而，在本发明一个可选择的实施方案中，核苷酸序 列的全部或部分可以应用本领域已知的化学方法合成(参考Carathers MH等(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 215-23 and Horn T etal (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232)。分子进化一旦编码酶的核苷酸序列被分离，或者推定的编码酶的核苷酸序列被鉴定，修 改选定的核苷酸序列是合乎需要的，例如为了制备本发明所述的酶而使核苷酸序列突变 是合乎需要的。突变可以由合成的寡核苷酸引入。这些寡核苷酸包含位于所需的突变位点侧翼 的氨基酸序列。适宜的方法被Morinaga 等在(Biotechnology (1984) 2，p646-649)中公开。 另一种将突变引入编码酶的核苷酸序列的方法记述在Nelson和Long的(Analytical Biochemistry (1989), 180，ρ147_151)。作为定点突变的替代，例如上面所述，可以随机引入突变，例如使用商业试剂盒诸如Stratagene生产的GeneMorph PCR突变试剂盒，或Clontech生产的多样化 (Diversify) PCR随机突变试剂盒。EP O 583 265涉及对基于PCRd诱变的优化，它能与突 变DNA类似物(例如EP O 866 796中描述的那些物质)的应用相结合。易错聚合酶链式反 应(ErrorpronePCR)技术适宜于生产具有优选特征的脂质酰基转移酶变体。W00206457 涉及脂酶分子进化。获得新序列的第三种方法是非同一的氨基酸序列的片段化，或应用任何数量的 限制性内切酶，或诸如DNase I的酶，并重新组装编码功能蛋白的的全部氨基酸序列。 或者，可以引入一种或多种不可识别的氨基酸序列，并在重新组装编码功能蛋白的的全 部氨基酸序列的过程中引入突变。DNA改组和DNA家族改组(DNA shuffling and family shuffling)技术适宜于生产具有优选特性的脂质酰基转移酶的突变体。适宜的实现“改 组”(‘shuffling')的方法被 EPO 752 008、EPl 138 763、EPl 103 606 公开。如 US 6,180,406和W001/34835所描述的，重排也可以与DNA突变的其它形式相结合。因此，能在体内或在体外在核苷酸序列中产生大量的定点突变或随机突变， 随后用不同的方法筛选功能改善的编码多肽。应用Silico和exo介导的重组方法(见 WOOO/58517, US 6,344,328，US 6,361,974)，例如，分子进化能够在产生的突变体保持 与已知的酶或蛋白十分低的同源性的情况下完成。这些获得的突变体与已知的转移酶具 有显著的结构近似性，但是具有十分低的氨基酸序列同源性。作为一个非限制的例子，另外地，多肽序列的突变或天然突变体能够被整合到 或野生型或其它突变或天然突变体中用于生产新的突变体。这种新的突变体也被筛选出 来以改善编码多肽的功能。通过上述提到的应用和类似的分子进化方法，可在没有任何关于蛋白质结构或 功能的已知知识的情况下，鉴别和选择具有优选的性质本发明所述酶的突变体，同时可 产生不可预测的但有益的突变或突变体。本领域有关分子进化的应用中有很多有关酶活 力优化或改变的例子。这些例子包括，但不限于以下一种或多种，优化在宿主细胞内或 体外优化的表达或活性，增加酶活性，改变酶作用底物和/或产品特异性，提高或降低 酶或结构的稳定性，在优选的环境条件下(例如温度、pH、酶作用底物)酶活性/特异 性的改变。应用分子进化工具可使酶发生改变以改善酶的功能，这对于本领域的技术人员 是显然的。适宜地，本发明中使用的脂质酰基转移酶可以是一种突变体，即与其亲代酶比 较，可以包含至少一个氨基酸置换、缺失或添加。突变酶保持与其亲代酶至少1%、 2%, 3%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99%的同源性。适宜的亲代酶可包括任何具有酯酶或脂酶活性的酶。优选 地，亲代酶与Pfam00657共有序列一致。在一个优选的实施方案中，脂质酰基转移酶突变体在GDSx、GANDY和HPT区
保留或掺入至少一个或多个Pfam00657共有序列氨基酸残基。酶，例如在水环境中无或低脂质酰基转移酶活性的脂酶可应用分子进化工具进 行突变，引入或增强转移酶活性，因此产生适用于本发明的组合物和方法的具有显著转 移酶活性的脂质酰基转移酶。
适宜地，用于本发明的脂质酰基转移酶可以是一种突变体，这种突变体与其亲 代酶相比，对于极性脂质，优选磷脂和/或糖脂具有增强的酶活性。优选地，这种突变 体优选对于溶解(Iyso)极性脂质表现出低或无活性。对于极性脂质，磷脂和/或糖脂的 增强的活性可能是水解作用和/或转移酶活性的结果。与其亲代酶相比，用于本发明的脂质酰基转移酶突变体可能减弱了对甘油三酯 和/或甘油单酯和/或甘油二酯的活性。适宜地，酶突变体对甘油三酯和/或甘油单酯和/或甘油二酯无活性。或者，本发明应用的酶突变体可具有增强的对甘油三酯的活性，和/或也增强 对下列一种或多种物质的活性，极性脂质、磷脂、卵磷脂、磷脂酰胆碱、糖脂、二半乳 糖基甘油单酯、单半乳糖基甘油单酯。已知的脂质酰基转移酶突变体，和一种或多种所述突变体可适用于本发明的方 法和用途和/或用于本发明的酶组合物中。仅仅作为举例，在下列参考文献中描述的脂 质酰基转移酶突变体可以适用于本发明Hilton S.Buckley JT.Studies on the reaction mechanism of a microbiallipase/ acyltransferase using chemical modification and site-directedmutagenesis. J Biol Chem.1991 Jan
15 ； 266(2) 997-1000。Robertson DL, Hilton S, Wong KR, Koepke A, Buckley JT.Influence ofactive site and tyrosine modification on the secretion and activity of theAeromonas hydrophila lipase/ acyltransferase.J Biol Chem.1994 Jan21 ； 269(3) 2146-50。Brumlik MJ, Buckley JT.Identification of the catalytic triad of thelipase/ acyltransferase from Aeromonas hydrophila.J Bacteriol.l996Apr ； 178(7) 2060—4。Peelman F, Vinaimont N，Verhee A, Vanloo B, Verschelde JL, Labeur C， Seguret-Mace S，Duverger N，Hutchinson G，Vandekerckhove J，TavernierJ, Rosseneu M.A proposed architecture for lecithin cholesterol acyl transferase (LCAT) identification ofthe catalytic triad and molecular modeling.Protein Sci.1998 Mar ； 7 (3) 587-99。氨基酸序列本发明还包括具有本文定义具体特性的多肽的氨基酸序列。这里使用的术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。 在某些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。氨基酸序列可从适宜的来源制备/分离，或者可以通过合成制备或可通过应用 DNA重组技术制备。适宜地，在此处提到的氨基酸序列可通过标准技术从分离出的本文教导的多肽 中获得。以下是测定分离的多肽中确定氨基酸序列的一种适宜方法纯化的多肽可为冰冻干燥的，100 μ g冰冻干燥的原材料溶于50 μ 1由8M尿素和 0.4Μ碳酸氢铵组成的混合溶液中，ρΗ8.4。溶解的蛋白质50°C变性还原15分钟，然后 以氮气覆盖，添加5μ145ιηΜ的二硫苏糖醇。经冷却至室温后，在室温，黑暗，氮气环 境中加入5 μ 1 IOOmM的碘乙酰胺，使半胱氨酸残基衍生15分钟。将135 μ 1的水与溶于5 μ 1 7jC的5 μ g赖氨酸_C内蛋白酶加入上述反应混合物，
28在氮气环境中37°C消化24小时。得到的多肽通过反相HPLC 在 VYDAC 碳-18 柱(0.46x15cm ； 10 μ m ； The Separation Group, California, USA)分离，使用水中的溶剂 A 0.1 % TFA 和乙腈中 的溶剂B: 0.1%TFA。在氨基末端测序之前，可对选出的多肽利用相同溶液体系 通过Develosil碳-18柱再进行色谱分析。可以根据生产厂家的技术说明书(Applied Biosystems, California, USA)利用脉冲液态快速循环，使用 Applied Biosystems 476A 序 列分析仪进行测序。序列同一性或序列同源性本发明还涉及与具有本文定义的具体性质多肽的氨基酸序列或任何编码这种多 肽的核苷酸序列的氨基酸序列(后面称为“同源序列”)具有一定程度的序列同一性或序 列同源性的序列的用途。这里，术语“同源体”指的是与受试氨基酸序列和受试核苷酸 序列具有一定同源性的实体。这里，术语“同源性”可与“同一性”等同。同源氨基酸序列和/或核苷酸序列应提供和/或编码保持功能活性和/或增强酶 活性的多肽。在本文中，指定同源序列包含与受试序列具有至少75、85或90% —致性，优选 95或98% —致性的氨基酸序列。一般地，同源序列包括与受试氨基酸序列相同的活性位 点等。虽然同源性也可被认为是相似性(即具有相似的化学性质/功能的氨基酸残基)， 在本发明的上下文中，优选以序列的同一性表述同源性。在本发明的上下文中，指定同源序列包括与编码本发明多肽的核苷酸序列(主 体序列)具有至少75，85或90%的同一性，优选95或98%的同一性的核苷酸序列。一 般地，同源序列包括与受试序列相同的编码活性位点及其它的序列。虽然同源性也可被 认为是相似性(即具有相似的化学性质/功能的氨基酸残基)，在本发明的上下文中，优 选以序列的同一性表述同源性。同源性比较可用肉眼进行，或更普遍的是，借助与容易获得的序列比对软件进 行比较。这种市场上可买到的电脑软件可计算出两个或更多个序列之间的％同源性。%同源性可在相邻的序列中计算，即一条序列与另一条对齐，一条序列的每一 个氨基酸直接与另一条的氨基酸比较，每次一个残基。这被称为“无间隙”排列。一 般地，这种无间隙排列只对相对较少数目的残基进行。虽然这是一种非常简单和稳定的方法，但不能考虑到例如在否则同一的序列对 中，插入和缺失将导致后面的氨基酸残基不能对齐，因此当总体比对已经完成时，很可 能地导致同源性百分比大幅度下降。因此，为产生最佳排列而设计的许多序列比较方法 考虑到可能存在的插入和缺失，而不会过分降低整体同源性得分。这是通过在序列中插 入“缺口”，最大化局部同源性来实现的。但是，这些更为复杂的方法将“缺口罚分”("gap penalties")赋予每一个在 排列上出现的缺口，使得对于相同数目的同一性氨基酸，具有尽可能少的缺口数的比对 (反映两条被比较序列之间更高的相关性)比缺口数多的比对可得到更高的分数。一般应 用的“亲和缺口成本”(〃 Affine gap costs")缺口的存在的罚分较高，而对缺口后的每 个后续的残基罚分较少。这是最通常应用的缺口评分系统。高缺口罚分当然产生具有较 少缺口的优化排列。大多数排列程序允许对缺口罚分进行更改。然而，使用这些软件进行序列比较时优选使用缺省值。例如，当使用GCG Wisconsin最佳拟合(Bestfit)程序包 时，缺省的氨基酸序列缺口罚分为每个缺口 -12和每个延伸_4。计算最大同源性百分比首先需要考虑到缺口罚分，产生最佳排列，实现这样排 列的适宜的计算机程序是GCG Wiscons中最佳拟合程序包(Devereux等1984 Nuc.Acids Research 12p387)。其它可进行序列对比的软件实例，包括但不仅限于，BLAST程序 包(参见 Ausubelet al 1999 ShortProtocols 中 Molecular Biology, 4th Ed-Chapter 18)， FASTA(Altschul etal 1990J.Mol.Biol.403_410)和 GENEWORKS 比较工具组。BLAST 和 FASTA都可以脱机和在线检索(参考Ausubel等1999，pages 7_58to 7-60)。然而，在一 些应用中优选使用GCG最佳拟合程序。名为BLAST 2 Sequence的新工具也可以用于比较 蛋白质和核苷酸序列(参见 FEMS Microbiol Lettl999 174(2) 247-50; FEMS Microbiol Lettl999 177 (1) 187—8 禾口 tatiana&commat ； ncbi.nlm.nih.gov)尽管最终同源性百分比能够以同一性的方式测定，比对程序通常不是基于全有 或全无(all-or-nothing)的成对比较。作为替代，成比例的相似性分数矩阵是普遍应用 的，该矩阵为基于化学相似性和进化距离的每个配对比较分配分值。平常应用的这样一 种矩阵的一个实例就是BLOSUM62矩阵一 BLAST程序组件的缺省矩阵。如果能提供的 话(想得到进一步的纤细信息，参见用户手册)，GCG Wisconsin程序通常或应用公开的 缺省值或应用定制的标记比较表。在一些应用中，优选使用GCG程序包公开的缺省值， 或者在应用其它软件的情况下，使用缺省的矩阵，如BLOSUM62。可选择地，同源性百分比可以在DNASIS (日立公司软件)通过序列特征多重 对比来计算，基于一种类似于 CLUSTALCHiggins DG & Sharp PM(1988)，Gene 73(1)， 237-244)的算法。一旦软件产生了一个最佳的排列，就能够计算序列同源性百分比，优选序列同 一性百分比。通常软件进行部分序列的比较，产生一个数值型结果。序列也可以进行氨基酸残基的删除、插入或置换，这会产生一个沉默变化并导 致生成一个功能上等同的物质。只要物质保持第二结合活性，考虑周全的氨基酸置换可 以基于在极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性、和/或亲水亲油性方面残基性质的近 似性进行。例如，带负电荷的氨基酸包括门冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖 氨酸和精氨酸；具有相似亲水性并具有不带电荷的极性头基团的氨基酸包括亮氨酸、异 亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨 酸、和酪氨酸。可以进行保守置换，例如下面表中所述。第二栏中同一区的氨基酸，优选第三 栏中同一行的可以互相取代。
权利要求
1.制备蛋白质酯和/或蛋白质亚基酯的方法，所述方法包括将酰基供体、酰基受体 与水混合以产生含5-98%水的高水分环境，其中所述酰基供体是脂质底物，其选自由磷 脂、溶血磷脂、甘油三酯、甘油二酯、糖脂或溶血糖脂组成的组中的一或多种，且所述 酰基受体是蛋白质和/或蛋白质亚基；以及将所述混合物与脂质酰基转移酶接触，使得 所述脂质酰基转移酶催化以下反应中的一或所有两种醇解或酯基转移作用。
2.权利要求1的方法，其中所述脂质酰基转移酶是固定化的。
3.权利要求1或2的方法，其中所述方法包括纯化所述蛋白质酯和/或蛋白质亚基
4.权利要求1-3之一的方法，其中所述脂质酰基转移酶的特征是，其为具有酰基转移 酶活性并包含氨基酸基序GDSX的酶，其中X是以下氨基酸残基中的一或多种L、A、 V、I、F、Y、H、Q、T、N、M 或 S。
5.前述权利要求任意一项所述的方法，其中所述脂质酰基转移酶是在使用“经缓冲 的底物中的转移酶测定法”检测时具有至少2%酰基转移酶活性的脂质酰基转移酶；所述 转移酶测定法包括以下步骤i)将450mg磷酸卵磷酯和50mg胆固醇溶于氯仿，在真空条件下蒸发干燥；ii)将300mg胆固醇/磷脂酰胆碱混合物移到Wheaton玻璃杯中，添加15ml50mM HEPES缓冲液pH 7，并在搅拌过程中使脂质分散到缓冲液中；iii)在使用磁力搅拌器混和的同时，将底物加热至35°C，并添加0.25ml酶溶液；iv)在反应0、5、10、15、25、40和60分钟后取出2ml样品，并立即添加25μ14Μ HCl以酸化游离脂肪酸，终止酶反应；ν)添加3ml氯仿，并剧烈摇晃振摇30秒，将样品离心，分离2ml氯仿相，并用 0.45 μ m的滤纸过滤，进入IOml涂焦油的Dram玻璃杯中；vi)在60°C氮蒸汽条件下蒸发氯仿，并称量样品；vii)通过GLC分析提取的脂质。
6.前述权利要求任意一项所述的方法，其中所述脂质酰基转移酶被分类为 E.C. 2.3.1 .χ ο
7.前述权利要求任意一项所述的方法，其中所述脂质酰基转移酶可以从一或多种 下列属的生物体获得气单胞菌、链霉菌、酵母菌、乳球菌、分枝杆菌、链球菌、乳 杆菌、脱亚硫酸菌、芽胞杆菌、弯曲杆菌、弧菌科、木杆菌、硫化叶菌、曲霉、裂殖酵 母、李司忒氏菌、奈瑟氏球菌、Mesorhizobium、雷尔氏菌、黄单胞菌和念珠菌。
8.前述权利要求任意一项所述的方法，其中所述脂质酰基转移酶包含一种或多种以 下氨基酸序列(i) SEQ ID Νο.2所示氨基酸序列；(ii) SEQ ID No.3所示氨基酸序列； (iii) SEQ ID No.4所示氨基酸序列；(iv) SEQ ID No.5所示氨基酸序列；(v) SEQ ID Νο.6 所示氨基酸序列；(vi) SEQ ID No. 12所示氨基酸序列；(vii) SEQ ID No.20所示氨基酸序 列；(viii) SEQ ID No.22所示氨基酸序列；(ix) SEQ ID No.24所示氨基酸序列；(x) SEQ ID Νο.26所示氨基酸序列；(xi) SEQ ID Νο.28所示氨基酸序列；(xii) SEQ ID No.30所 示氨基酸序列；(xiii) SEQ ID No.32所示氨基酸序列；(xiv) SEQ ID No.34所示氨基酸序 列，或者与 SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQIDNo.6、 SEQ ID No. 12, SEQ ID No.20、SEQ ID No.22、SEQ ID No.24、SEQIDNo.26、SEQ IDNo.28、SEQIDNo.30、SEQ ID No.32 或 SEQ ID No.34 所示的任意一种序列具有 75%或75%以上同一性的氨基酸序列。
9.脂质酰基转移酶在制备蛋白质酯和/或蛋白质亚基酯中的用途，所述制备通过在酰 基供体、酰基受体与水的混合物中催化醇解和/或酯基转移作用来实施，所述混合物包 含5-98%水、其中所述酰基供体是脂质底物，其选自由磷脂、溶血磷脂、甘油三酯、甘 油二酯、糖脂或溶血糖脂组成的组中的一或多种，所述酰基受体是蛋白质和/或蛋白质 亚基。
10.如权利要求9所述的用途，其中所述脂质酰基转移酶是固定化的。
11.如权利要求9所述的用途，其中所述蛋白质酯和/或蛋白质亚基酯是经纯化的。
12.如权利要求9-11中任一项所述的用途，其中所述脂质酰基转移酶的特征在于其为 这样一种酶，它具有酰基转移酶活性，并包含氨基酸基序GDSX，其中X是以下氨基酸 残基中的一种或多种残基L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S。
13.如权利要求9-12中任一项所述的用途，其中所述脂质酰基转移酶是在使用“经缓 冲的底物中的转移酶测定法”检测时具有至少2%酰基转移酶活性的脂质酰基转移酶；所 述转移酶测定法包括以下步骤i)将450mg磷酸卵磷酯和50mg胆固醇溶于氯仿，在真空条件下蒸发干燥；ii)将300mg胆固醇/磷脂酰胆碱混合物移到Wheaton玻璃杯中，添加15ml50mM HEPES缓冲液pH 7，并在搅拌过程中使脂质分散到缓冲液中；iii)在使用磁力搅拌器混和的同时，将底物加热至35°C，并添加0.25ml酶溶液；iv)在反应0、5、10、15、25、40和60分钟后取出2ml样品，并立即添加25μ14Μ HCl以酸化游离脂肪酸，终止酶反应；ν)添加3.00ml氯仿，并剧烈摇晃振摇30秒，将样品离心，分离2ml氯仿相，并用 0.45 μ m的滤纸过滤，进入IOml涂焦油的Dram玻璃杯中；vi)在60°C氮蒸汽条件下蒸发氯仿，并称量样品；vii)通过GLC分析提取的脂质。
14.如权利要求9-13中任一项所述的用途，其中所述脂质酰基转移酶被分类为 E.C. 2.3.1 .χ ο
15.如权利要求9-14中任一项所述的用途，其中所述的脂质酰基转移酶可以从一或多 种下列属的生物体获得气单胞菌、链霉菌、酵母菌、乳球菌、分枝杆菌、链球菌、乳 杆菌、脱亚硫酸菌、芽胞杆菌、弯曲杆菌、弧菌科、木杆菌、硫化叶菌、曲霉、裂殖酵 母、李司忒氏菌、奈瑟氏球菌、Mesorhizobium、雷尔氏菌、黄单胞菌和念珠菌。
16.如权利要求9-15中任一项所述的用途，其中所述脂质酰基转移酶包含一种或多种 以下氨基酸序列(i) SEQ ID Νο.2所示氨基酸序列；(ii) SEQ IDNo.3所示氨基酸序列； (iii) SEQ ID No.4所示氨基酸序列；(iv) SEQ ID No.5所示氨基酸序列；(v) SEQ ID Νο.6 所示氨基酸序列；(vi) SEQ ID No. 12所示氨基酸序列；(vii) SEQ ID No.20所示氨基酸序 列；(viii) SEQ ID No.22所示氨基酸序列；(ix) SEQ ID No.24所示氨基酸序列；(x) SEQ ID Νο.26所示氨基酸序列；(xi) SEQ ID No.28所示氨基酸序列；(xii) SEQ ID No.30所 示氨基酸序列；(xiii) SEQ ID No.32所示氨基酸序列；(xiv) SEQ ID No.34所示氨基酸序 列、或者与 SEQ ID No.2、SEQIDNo.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQIDNo.6、SEQIDNo.12、SEQIDNo.20、SEQIDNo.22、SEQIDNo.24、SEQID No.26、SEQIDNo.28、 SEQ ID No.30、SEQ ID No.32或SEQ ID No.34所示的任意一种序列具有75%或75%以上同一性的氨基酸序列。
全文摘要
制备蛋白质酯和/或蛋白质亚基酯的方法，所述方法包括将酰基供体、酰基受体与水混合以产生包含5-98％水的高水分环境，其中所述酰基供体是选自由磷脂、溶血磷脂、甘油三酯、甘油二酯、糖脂或溶血糖脂组成的组中的一或多种的脂质底物，且所述酰基受体是蛋白质和/或蛋白质亚基；以及将所述混合物与脂质酰基转移酶接触，使得所述脂质酰基转移酶催化以下反应中的一或所有两种醇解或酯基转移作用。本发明还涉及所述脂质酰基转移酶在制备蛋白质酯和/或蛋白质亚基酯中的应用。
文档编号C12P7/62GK102021205SQ20101053058
公开日2011年4月20日 申请日期2004年1月15日 优先权日2003年1月17日
发明者乔恩·B·索伊, 乔恩·D·米克尔森, 苏珊·M·马德里德, 阿尔诺·D·克赖杰 申请人:丹尼斯科公司