具有抗流感活性的扎那米韦膦酸酯同类物及流感病毒的奥司他韦易感性的测定的制作方法
【专利说明】具有抗流感活性的扎那米韦滕酸酯同类物及流感病毒的奥 司他韦易感性的测定
[0001] 本申请是申请日为2011年5月10日、申请号为201180034218. 3、发明名称为"具 有抗流感活性的扎那米韦膦酸酯同类物及流感病毒的奥司他韦易感性的测定"的申请的分 案申请。
[0002] 相关申请的交叉引用
[0003] 本申请为2011年5月10日提交的序号为PCT/US2011/035982的国际专利申请根 据第371节在国家阶段提交并要求2010年5月10日提交的序号为61/333, 137且题为"测 定流感病毒的奥司他韦易感性的组合物和方法"的美国临时专利申请的优先权，其内容通 过引入整体并入本文。
[0004] 序列
[0005] 本申请包括序列表。ASCII文本文件（创建于2011年7月26日，名为SEQLIST_ ASN51301US_ST25. txt，大小为714字节）的整体内容通过引入整体并入本文。
技术领域
[0006] 本发明涉及有效对抗流感病毒的新型化合物。本发明涉及抑制来自H1N1、H5N1和 H3N2流感病毒的野生型和奥司他韦耐药性病毒株的流感病毒的神经氨酸酶的新型膦酸酯 化合物。本发明涉及抗药病原体的检测。具体地，本发明涉及奥司他韦耐药性流感病毒的 检测。更具体地，本发明涉及使用本发明公开的新型化合物检测奥司他韦耐药性流感病毒。
【背景技术】
[0007] 甲型流感病毒的爆发持续引起世界范围内广泛的发病率和死亡率。仅在美国，每 年估计5-20%的人群感染甲型流感病毒，导致约200,000人住院治疗和36,000人死亡。 制定全面的接种疫苗政策已成为降低流感发病率的有效措施。然而，病毒的频繁遗传漂变 需要每年都进行疫苗的重配制，从而很可能导致接种疫苗中的病毒株与传播中的病毒不匹 配。
[0008] 甲型流感病毒由9种结构蛋白组成并且编码具有调节功能的另外两种非结构NSl 蛋白。病毒基因组的节段性质形成了在不同病毒株对细胞的交叉感染过程中发生基因重配 (基因组节段交换）的机制。根据其表面显示的不同红细胞凝集素（HA)和神经氨酸酶（NA) 病毒蛋白，将甲型流感病毒分成不同亚型。甲型流感病毒亚型通过两种病毒表面糖蛋白，红 细胞凝集素（HA或H)和神经氨酸酶（NA或N)来鉴定。每组流感病毒亚型均通过其H和N 蛋白组合来鉴定。有16种已知的HA亚型和9种已知的NA亚型。
[0009] 流感病毒是可感染包括人在内的很多动物种类的负链RNA片段病毒（negative sense segmented RNA virus)。流感基因组通过病毒编码的RNA依赖性RNA聚合酶的复 制是在所有时间都产生具有不同基因序列的子代的易出错过程。基因改变的活病毒被 称为"抗原性漂变的"突变体。病毒基因组的节段性质和感染不同动物种类的可能性可 产生"抗原性漂变的"突变体（P.K. Cheng 等人，Emerg. Infect. Dis. 15,966(2009))。在 期望的条件下，显性变异体可能成为针对人或动物的突出病原菌。还不能完全了解导致 突变体进化的多步骤筛选方法（L. Cohen-Daniel等人，J. Clin. Virol. 44, 138(2009); R. Wagner, Μ· Matrosovich, Η· D. Klenk, Rev. Med. Virol. 12, 159 (2002))。然而，疫苗常被 用于预防流感病毒感染，治疗流感感染的最有用疗法包括施用Tamiflu? (奥司他韦乙酯 的磷酸盐，Roche Laboratories, Inc.)和Relenza? (扎那米韦，Glaxo Wellcome, Inc.) (N. J. Cox, J. M. Hughes, N. Engl. J. Med. 341，1387 (1999))。奥司他韦（oseltamivir)和扎那 米韦（zanamivir)是防止子代病毒粒子在粘液分泌内的释放和散播并由此降低病毒感染 性的病毒唾液酸酶（神经氨酸酶）抑制剂。作为在流感病毒表面表达的糖蛋白，神经氨酸 酶（NA)对病毒复制和通过断裂宿主细胞的表面唾液酸受体（sialo-receptor)与子代病毒 之间的键而产生的感染性至关重要。因此，基于结构的策略来抑制NA已应用于开发抗流感 药。
[0010] 扎那米韦（Relenza?) (von Itzstein，M.等人，Nature 1993, 363, 418. Dunn, C. J. ;Goa，K.L. Drugs 1999,58,761.)是治疗流感的流行药。克流感（Tamiflu)是前药，该前 药易于被肝酯酶水解产生相应的作为活性抑制剂的羧酸奥司他韦而与病毒的神经氨酸酶 (NA)活性位点内的3个精氨酸残基相互作用（Argll8、Arg292和Arg371) (von Itzstein，M. 等人，Nature 1993, 363, 418. Lew, W.等人，Curr. Med. Chem. 2000, 7, 663. Russell, R.J.等 人，Nature 2006,443,45.)。奥司他韦和扎那米韦均通过断裂宿主细胞的表面涎蛋白受 体与子代病毒之间的键来抑制对病毒繁殖很重要的流感病毒NA。NA抑制剂设计为具有 (氧杂）环己烯支架以模拟唾液酸（N-乙酰神经氨酸，其为用于与病毒NA的活性位点结 合的细胞表面糖蛋白的最外糖）酶促裂解的氧鑰过渡态。为适应与羧酸奥司他韦结合， 需要生成大疏水袋的NA的诱导装配，用于3-戊基侧链（Collins, P. J.，等人，Nature 2008, 453, 1258.)。相比之下，扎那米韦对新进化的耐药性病毒没有奥司他韦磷酸盐那样易 感。由于不需要生成疏水性结合袋，扎那米韦对NA突变体（例如，临床相关的H274Y突变 体）的抑制能力不变。
[0011] 甲型流感（HlNl)病毒具有奥司他韦耐药性，这归功于神经氨酸酶（NA)蛋白274 位组氨酸变为酪氨酸（H274Y)的氨基酸变化。2008年汹涌而来的季节性HlNl中的奥司他 韦耐药性H274Y突变体（A. Moscona, N. Engl. J. Med. 360, 953(2009))令人困惑，因为这些 突变的增长在很多H274Y流行地区与奥司他韦的使用无关（J. Mossong等人，Antiviral Res. 84,91(2009) ;M. Jonges 等人，Antiviral Res. 83, 290(2009))。此外，在患者中报导 了 H274Y 奥司他韦耐药性的全国流行性 HlNl (A. Gulland, Br. Med. J. 339, b4975 (2009))和 H5N1突变体（Q. M. Le等人，Nature 437, 1108(2005))，这表明这些突变体会影响流感疗法 的选择（I. Stephenson 等人，Clin. Infect. Dis. 48, 389 (2009)) 〇
[0012] □通过修饰甘油基部分支架以模拟唾液酸酶裂解中的氧鑰过渡态，已经制 备了很多扎那米韦衍生物。膦酸酯基团通常在药物设计中用作羧酸盐的生物电子等 排体（White, C.L.等人，了.]?〇1.81〇1.1995,245,623.5。11即，1(.八.；1^11(11161'，评.〇16111· Rev. 2005, 105, 67. Streicher, H. ;Busseb, H. Bioorg. Med. Chem. 2006, 14, 1047.)。相比于羧 酸盐-胍盐离子对，膦酸根离子会显示与胍盐离子更强的静电作用。因此，期望扎那米韦膦 酸酯同类物可更强地对抗HlNl和H5N1病毒甚至H274Y突变体的神经氨酸酶。亲合力的增 强可归功于生理条件下膦酸酯基团与3个精氨酸残基（A