人胚胎干细胞分化成单一激素胰岛素阳性细胞的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2011年12月22日提交的美国临时专利申请序列号61/579, 351的权 益，所述美国临时专利申请全文以引用方式并入本文用于任何目的。
技术领域
[0003] 本发明在细胞分化领域中。更具体地，本发明提供了在逐步分化的每个步骤使用 限定条件，由多能干细胞分化的单一激素胰岛素生成细胞。群体中大于10%的分化的胰岛 素生成细胞表达单一激素胰腺0细胞特征性标志物。
【背景技术】
[0004] 用于I型糖尿病的细胞替代疗法的进展以及可移植胰岛的缺乏已使得注意力集 中在开发适于移植物移入的胰岛素生成细胞或0细胞的来源上。一种方法是从多能干细 胞，例如胚胎干细胞产生功能性0细胞。
[0005] 在脊椎动物的胚胎发育中，多能干细胞可在称为原肠胚形成的过程中产生包括三 个胚层（外胚层、中胚层和内胚层）的一组细胞。组织例如甲状腺、胸腺、胰腺、肠和肝将从 内胚层经由中间阶段发育而来。该过程的中间阶段是定形内胚层的形成。定形内胚层细胞 表达多种标志物，例如HNF3 0、GATA4、MIXL1、CXCR4和S0X17。
[0006] 到原肠胚形成为止，内胚层划分成可通过一组因子的表达来识别的前-后域，所 述因子独特标志内胚层的前、中和后区。例如，Hhex和Sox2鉴定内胚层的前区，而Cdxl、2 和4鉴定内胚层的后半部分。
[0007] 内胚层组织的迀移使内胚层与不同的中胚层组织紧密接近，这帮助肠管的区域 化。这通过多种分泌因子例如？6?、1拉、16?-8、视黄酸（狀）和81^配体及其拮抗剂来完成。 例如，FGF4和BMP促进预定的后肠内胚层中的Cdx2表达并阻遏前基因Hhex和S0X2的表 达（Development2000,127 :1563-1567)。WNT信号传导也已显示与FGF信号传导平行工作， 以促进后肠发育并抑制前肠命运（Development2007,134 :2207-2217)。最后，由间充质分 泌的视黄酸调节前肠-后肠边界（CurrBiol2002,12:1215-1220)。
[0008] 特异性转录因子的表达水平可用于指定组织的身份。在定形内胚层转化成原肠管 的过程中，肠管变得区域化成广泛域，所述广泛域可通过限制性基因表达模式在分子水平 上进行观察。例如，肠管中区域化的胰腺域显示H)X-1的极高表达以及⑶X2和S0X2的极 低表达。相似地，高水平的Foxel的存在指示食道组织；在肺组织中高度表达的是NKX2. 1 ; S0X2/0ddl(0SRl)在胃组织中高度表达；PROXl/Hhex/AFP的表达在肝组织中比较高；S0X17 在胆道结构组织中高度表达；PDX1、NKX6. 1/PTfla和NKX2. 2在胰腺组织中高度表达；并且 0)父2的表达在肠组织中高。上文概括摘自〇6￥〇7112009,238:29-42和41111111^￥〇611〇6￥Biol2009,25 :221-251。
[0009] 胰腺的形成起于定形内胚层分化成胰腺内胚层（AnnuRevCellDevBiol2009， 25 :221-251;DevDyn2009, 238:29-42)。背侧和腹侧胰腺域起于前肠上皮。前肠也产生食 道、气管、肺、甲状腺、胃、肝、胰腺和胆管系统。
[0010] 胰腺内胚层的细胞表达胰-十二指肠同源盒基因roxi。在不存在Pdxi时，胰腺形 成腹胰芽和背胰芽后不再发育。因而，Pdxl表达标志着胰腺器官发生中的一个关键步骤。 除了其他细胞类型，成熟的胰腺还包括外分泌组织和内分泌组织。外分泌和内分泌组织来 自胰腺内胚层的分化。
[0011] D'Amour等人描述了在高浓度激活素和低血清的存在下，产生人胚胎干细胞衍生 的定形内胚层的富集培养物（Nature2005,23 :1534-1541 ;美国专利号7, 704, 738)。将这 些细胞移植在小鼠的肾囊下导致分化成具有内胚层组织特征的更成熟的细胞（美国专利 号7, 704, 738)。在添加FGF-10和视黄酸后，人胚胎干细胞衍生的定形内胚层细胞还可分 化成H)X1阳性细胞（美国专利公开号2005/0266554A1)。这些胰腺前体细胞在免疫缺陷 小鼠的肾囊下的后续移植导致在3-4个月成熟期后形成功能胰腺内分泌细胞（美国专利号 7, 993, 920 和美国专利号 7, 534, 608)。
[0012] Fisk等人报道用于由人胚胎干细胞产生胰岛细胞的系统（美国专利号 7, 033, 831)。在这种情况下，分化途径分成三个阶段。人胚胎干细胞首先使用丁酸钠和激 活素A的组合而分化成内胚层（美国专利号7, 326, 572)。然后将细胞和与EGF或0细胞 素（betacellulin)结合的BMP拮抗剂例如头蛋白一起培养，以生成H)X1阳性细胞。通过 烟酰胺诱导终末分化。
[0013] 小分子抑制剂也已用于诱导胰腺内分泌前体细胞。例如，TGF-B受体和BMP受体 的小分子抑制剂（Development2011，138 :861-871 ;Diabetes2011，60 :239-247)已用于显 著提高胰腺内分泌细胞的数目。另外，小分子活化剂也已用于生成定形内胚层细胞或胰腺 前体细胞（CurrOpinCellBiol2009,21 :727-732;NatureChemBiol2009,5 :258-265)。
[0014] 由人胚胎干细胞诱导胰腺前体细胞的先前尝试已突出H)X-1和NKX6. 1共表达在 正确鉴定胰腺内胚层中的重要性。然而，虽然本领域已鉴定在rox-l和NKX6. 1表达中阳 性的细胞群是低CDX2表达或不存在CDX2表达的，但先前报道未能测试正好在发育中的胰 腺前的标志物的存在。标志前内胚层的S0X2在成人胰岛中不表达，并且在发育中的胰腺 中以极低水平表达（Diabetes2005,54 :3402-4309)。相比之下，本专利申请的一些实例公 开了这样的细胞群，其中由人胚胎干细胞生成的至少30%的胰腺内胚层细胞对于rox-i和 NKX6. 1的表达是阳性的，并且对于⑶X2和S0X2的表达是阴性的。
[0015] 所有生成功能胰腺P细胞的先前尝试未能获得具有成熟P细胞特征的细胞。成 熟0细胞的标志包括单一激素胰岛素的表达，胰岛素原正确加工成胰岛素和C肽，PDX-1 和NKX6. 1的强表达，响应葡萄糖的适当胰岛素释放，葡萄糖转运蛋白的表达，和葡糖激 酶的高表达。所有先前报道均已导致产生两种或更多种胰腺激素的内分泌细胞。例如， D'Amour等人（NatureBiotech2006,24:1392_1401)报道如通过突触小泡蛋白测量的， 包含~10%胰岛素阳性细胞和~20%内分泌细胞的细胞群的生成。由其他人的类似报道 (CellRes2009,19 ：429-438；StemCells2007,25 ：1940-1953；DiabetesObesMetab2008, 10:186-194)也已显示多能细胞分化为无功能的胰岛素阳性细胞。事实上，近期研究已 明确确定多激素细胞在重症联合免疫缺陷（SCID)小鼠中的移植不导致功能0细胞的生 成（Diabetes2011，60:239-247;NatureBiotech2011，29:750-756)。虽然在人胎儿胰 腺中，一部分（~10-20% )内分泌细胞是多激素细胞；但多激素细胞在成人胰腺中消失 (HistochemCellBiol1999，112:147-153;JHistochemCytochem2009,57:811-824)。
[0016] 随着再生医学的新兴领域不断成熟，终末分化的、适当调节的胰腺内分泌细胞的 形成方法是高度希望的。我们在此处证实使用培养条件的适当和限定操纵，以及添加多种 途径的活化剂/抑制剂的精确定时，人胚胎干细胞可在体外分化成功能胰腺0细胞。具体 地，BMP抑制的精确定时、使用连同维生素C的使用一起的视黄酸梯度证明在单一激素胰腺 内分泌细胞的生成中是有效的。
【发明内容】
[0017] 本发明提供了通过多能细胞的逐步分化在体外获得的胰腺内胚层谱系的细胞群。 在每个分化步骤使用的培养基均补充有葡萄糖。在一些实施例中，在每个分化步骤，细胞在 包含5mM至20mM葡萄糖的培养基中进行培养。
[0018] 在一些实施例中，多能干细胞的分化生成胰腺内胚层细胞群，其中分化群体中大 于10%的细胞表达单一激素胰腺0细胞特征性标志物。
[0019] 在一些实施例中，多能干细胞的分化生成胰腺内胚层细胞群，其中大于30%的分 化群体对于H)X-1和NKX6. 1的表达是阳性的，而对于⑶X2和S0X2的表达是阴性的。
[0020] 在一些实施例中，逐步分化包括在还补充有TGF-B配体的培养基中培养未分化的 人胚胎干细胞。在一些实施例中，逐步分化包括在还补充有WNT活化剂的培养基中培养未 分化的人胚胎干细胞。在一些实施例中，逐步分化包括在还补充有FGF配体的培养基中培 养定形内胚层细胞。在一些实施例中，逐步分化包括在还补充有shh抑制剂、FGF配体、PKC 活化剂、TGF-B配体、类视色素和BMP抑制剂梯度的培养基中培养肠管细胞。在一些实施例 中，逐步分化包括在还补充有PKC活化剂、shh抑制剂、类视色素和BMP抑制剂的培养基中 培养后前肠细胞。在一些实施例中，逐步分化包括在还补充有抗坏血酸的培养基中培养细 胞。
[0021] 在一个实施例中，本发明提供了用于使多能细胞逐步分化成胰腺内胚层谱系的细 胞群的体外方法，所述体外方法包括在包含5mM至20mM葡萄糖的培养基中培养每个分化 阶段中的细胞。在一些实施例中，用于多能细胞逐步分化的体外方法还包括通过在补充有 TGF-B配体和WNT活化剂的培养基中培养多能细胞，使多能细胞分化成定形内胚层（DE)细 胞。在一些实施例中，用于多能细胞逐步分化的体外方法还包括通过在补充有FGF配体的 培养基中培养DE细胞，使DE细胞分化成肠管细胞。在一些实施例中，用于多能细胞逐步分 化的体外方法还包括通过在补充有shh抑制剂、FGF配体、PKC活化剂、TGF-B配体、类视色 素和BMP抑制剂的培养基中培养肠管细胞，使肠管细胞分化成后前肠内胚层细胞。在一些 实施例中，用于多能细胞逐步分化的体外方法还包括通过在补充有shh抑制剂、FGF配体、 PKC活化剂、TGF-B配体、类视色素和BMP抑制剂的培养基中培养肠管细胞，使肠管细胞分 化成后前肠内胚层细胞。在一些实施例中，用于多能细胞逐步分化的体外方法还包括通过 在补充有PKC活化剂、shh抑制剂、类视色素和BMP抑制剂的培养基中培养后前肠内胚层细 胞，使后前肠内胚层细胞分化成胰腺前肠细胞。在一些实施例中，用于多能细胞逐步分化的 体外方法还包括通过在补充有shh抑制剂、TGF-B配体和类视色素的培养基中培养胰腺前 肠细胞，使胰腺前肠细胞分化成胰腺内胚层细胞。在一些实施例中，用于多能细胞逐步分化 的体外方法还包括使胰腺内胚层细胞分化成胰腺0细胞群。
[0022] 在一个实施例中，在用于多能细胞逐步分化的体外方法的至少一个步骤中，培养 基还补充有抗坏血酸。在一些实施例中，分化群体中大于10%的细胞是单一激素胰岛素阳 性细胞。在一些实施例中，在通过本发明的方法生成的培养物中大于30 %的胰腺内胚层细 胞是PDX-1+、NKX6. 1+、S0X2-和CDX2-。
[0023] 在一个实施例中，本发明涉及用于使人胚胎干细胞分化成胰腺0细胞的体外方 法，所述体外方法包括：a)在补充有葡萄糖、TGF-B配体和WNT活化剂的培养基中培养未分 化的人胚胎干细胞，以生成定形内胚层（DE)细胞群；b)在补充有葡萄糖和FGF配体的培养 基中培养DE细胞，以生成肠管细胞群；c)在补充有葡萄糖、shh抑制剂、FGF配体、PKC活化 剂、TGF-B配体、类视色素和BMP抑制剂梯度的培养基中培养肠管细胞，以生成表达H)X-1 和S0X2的后前肠内胚层细胞群；d)在补充有葡萄糖、PKC活化剂、shh抑制剂、类视色素和 BMP抑制剂的培养基中培养后前肠细胞，以生成相比于后前肠细胞，表达H)X-1和NKX6. 1并 表达更低水平的S0X2的胰腺前肠细胞群；e)在补充有葡萄糖、shh抑制剂、TGF-B抑制剂和 类视色素的培养基中培养胰腺前肠细胞，以获得相比于胰腺前肠细胞，表达rox-i、更高水 平的NKX6. 1和更低水平的S0X2的胰腺内胚层细胞群；和f)使胰腺内胚层细胞分化成胰腺 0细胞群。在一些实施例中，通过本发明的方法生成的胰腺0细胞群是H)X-1+、NKX6. 1+、 S0X2-和⑶X2-。在一些实施例中，在逐步分化方法的至少一个步骤中的培养基还补充有抗 坏血酸。在一些实施例中，通过本发明的方法获得的胰腺0细胞是单一激素胰岛素生成细 胞，其也是NKX6. 1+和PDX-1+。
【附图说明】
[0024] 图1A至图1G显示了在根据实例1分化的细胞的S3第2天时，下述标志物的FACS 直方图表达谱。图1A:同种型对照；图1B:嗜铬粒蛋白；图1C:KI-67 ;图ID:NKX6. 1 ;图1E: S0X2 ;图IF:CDX2 ;图1G:PDX-1。每种标志物的表达百分比显示于每个直方图上。
[0025] 图2A至图2G显示了在根据实例1分化且在S4第2天时收获的细胞中，下述标 志物的FACS直方图表达谱。图2A:同种型对照；图2B:嗜铬粒蛋白；图2C:KI-67 ;图2D: NKX6. 1 ;图2E:S0X2 ;图2F:CDX2 ;图2G:PDX-1。每种标志物的表达百分比显示于每个直方 图上。
[0026] 图3A至图3G显示了在根据实例1分化且在S5第2天时收获的细胞中，下述标 志物的FACS直方图表达谱。图3A:同种型对照；图3B:嗜铬粒蛋白；图3C:KI-67 ;图3D: NKX6. 1;图3E:S0X2;图3F:CDX2;图3G:PDX-1。每种标志物的表达百分比显示于每个直方 图上。
[0027] 图4A至图4G显示了根据实例1分化且在S5第7天时收获的细胞的下述标志物的 FACS直方图表达谱。图4A:同种型对照；图4B:嗜铬粒蛋白；图4C:KI-67;图4D:NKX6. 1; 图4E:S0X2;图4F:CDX2;图4G:PDX-1。每种标志物的表达百分比显示于每个直方图上。
[0028] 图5A至图5C描述了在根据实例1分化且在S5第2天时收获的细胞中，下述标志 物的FACS直方图表达谱。图5A:嗜铬粒蛋白（y轴）和CDX2 (x轴）；图5B:嗜铬粒蛋白（y 轴）和S0X2 (x轴）；图5C:嗜铬粒蛋白（y轴）和NKX6. 1 (x轴）。每个图的共表达百分比 显示于每个直方图上。
[0029] 图6A至图6T显示了在根据实例1分化且在S2、S3、S4和S5时收获的人胚胎干细 胞系HI的细胞中，来自下述基因表达的实时PCR分析的数据。图6A:CDX2 ;图6B:CD142 ; 图 6C:F0XE1 ;图 6D:HNF4-a;图 6E:NKX2. 1 ;图 6F:NKX2. 2 ;图 6G:NKX6. 1 ;图 6H:0SR1 ; 图 61 :PDX-1 ;图 6J:PR0X1 ;图 6K:PTFla;图 6L:S0X17 ;图 6M:S0X2 ;图 6N:胰岛素；图 60 : ZIC1 ;图6P:嗜铬粒蛋白；图6Q:胰高血糖素；图6R:Ngn3 ;图6S:NeuroD;图6T:生长抑素。
[0030] 图7A至图7G描述了在根据实例2分化且在S2、S3或S4的第3天时收获的H1细 胞系的细胞中，来自下述基因表达的实时PCR分析的数据。图7A:NKX6. 1 ;图7B:PDX-1 ;图 7C:嗜铬粒蛋白；图7D:NGN3 ;图7E:CDX2 ;图7F:白蛋白；图7G:S0X2。
[0031] 图8A至图8G描述了在根据实例3分化且在S2、S3、S4或S5时收获的HI细胞中， 来自下述标志物表达的实时PCR分析的数据。图8A:NKX6. 1 ;图8B:PDX-1 ;图8C:NGN3 ;图 8D:NeuroD;图 8E:嗜铬粒蛋白；图 8F:CDX2 ;图 8G:S0X2〇
[0032] 图9A至图9H描述了在根据实例4分化且在S3和S4的第4天时收获的HI细胞 中，来自下述标志物表达的实时PCR分析的数据。图9A:NKX6. 1 ;图9B:PDX-1 ;图9C:嗜铬 粒蛋白；图 9D:NGN3 ;图 9E:NeuroD;图 9F:CDX2 ;图 9G:白蛋白；图 9H:S0X2。
[0033] 图10A至图10H描述了在根据实例5分化且在第4阶段时收获的人胚胎干细胞系 H1的细胞中，来自下述基因表达的实时PCR分析的数据。图10A:NKX6. 1 ;图10B ; 图 10C:嗜铬粒蛋白；图 10D:NGN3 ;图 10E:NeuroD;图 10F:CDX2 ;图 10G:白蛋白；图 10H:S0X2〇
[0034] 图11A至图11H显示了在根据实例6分化且在S3或S6的第3天时收获的人胚胎 干细胞系H1的细胞中，来自下述基因表达的实时PCR分析的数据。图11A:NKX6. 1 ;图11B: roX-1 ;图 11C:嗜铬粒蛋白；图 11D:NGN3 ;图 11E:NeuroD;图 11F:CDX2 ;图 11G:白蛋白；图 11H：S0X2〇
[0035] 图12A至图12G描述了在根据实例7分化且在S3、S4或S5的第3天时收获的人 胚胎干细胞系H1的细胞中，来自下述基因表达的实时PCR分析的数据。图12A:NKX6. 1 ;图 12B:PDX-1 ;图 12C:嗜铬粒蛋白；图 12D:NGN3 ;图 12E:NeuroD;图 12F:CDX2 ;图 12G:S0X2〇
[0036] 图13A至图13G描述了在根据实例8分化且在S3、S4、S5或S6时收获的人胚胎干 细胞系H1的细胞中，来自下述基因表达的实时PCR分析的数据。图13A:NKX6. 1 ;图13B: PDX-1 ;图 13C:嗜铬粒蛋白；图 13D:NGN3 ;图 13E:NeuroD;图 13F:CDX2 ;图 13G:S0X2〇
[0037] 图14A至图14H显示了在根据实例9分化的细胞的S3第4天时，下述标志物 的FACS直方图表达谱。图14A:同种型对照；图14B:嗜铬粒蛋白；图14C:KI-67 ;图14D: NKX6. 1 ;图 14E:S0X2 ;图 14F:HNF3B;图 14G:CDX2 ;图 14H:PDX-1。每种标志物